Generierung und quantitative Charakterisierung funktioneller und polarisierter Gallenepithelzysten

Summary

Dreidimensionale (3D) zelluläre Systeme sind relevante Modelle zur Untersuchung der Organogenese. Eine hydrogelbasierte Methode für die Produktion von Gallenzysten und deren Charakterisierung wird vorgeschlagen. Dieses Protokoll entschlüsselt die Barrieren der 3D-Charakterisierung, mit einer einfachen und zuverlässigen Methode, um die Effizienz der Zystenbildung und ihre Funktionalität zu bewerten.

Abstract

Cholangiozyten, die Epithelzellen, die die Gallengänge in der Leber aneinanderreihen, bewachen die Gallenbildung und -modifikation. In den letzten zwanzig Jahren sind im Zusammenhang mit Lebererkrankungen dreidimensionale (3D) Modelle entstanden, die auf Cholangiozyten basieren, wie Zysten, Sphäroide oder röhrenartige Strukturen, um Gewebetopologie für Organogenese, Krankheitsmodellierung und Arzneimittelscreening-Studien nachzuahmen. Diese Strukturen wurden hauptsächlich durch Einbettung von Cholangiozyten in ein Hydrogel gewonnen. Der Hauptzweck bestand darin, die Selbstorganisation zu untersuchen, indem epitheliale Polarität, funktionelle und morphologische Eigenschaften angegangen wurden. Jedoch, nur sehr wenige Studien konzentrieren sich auf Zystenbildung Effizienz. Wenn dies der Fall ist, wird die Effizienz oft anhand von Bildern einer einzelnen Ebene quantifiziert. Funktionelle Assays und Strukturanalysen werden durchgeführt, ohne die potenzielle Heterogenität der Zystenverteilung darzustellen, die sich aus Hydrogelpolymerisationsheterogenitäten und Nebenwirkungen ergibt. Daher kann die quantitative Analyse, wenn sie durchgeführt wird, nicht für den Vergleich von einem Artikel zum anderen verwendet werden. Darüber hinaus erlaubt diese Methode keine Vergleiche des 3D-Wachstumspotenzials verschiedener Matrizen und Zelltypen. Darüber hinaus wird die experimentelle Fehlerbehebung für immunstainierende Zysten nicht erwähnt. In diesem Artikel bieten wir eine zuverlässige und universelle Methode, um zu zeigen, dass die anfängliche Zellverteilung mit der heterogenen vertikalen Verteilung der Zystenbildung zusammenhängt. Cholangiozytenzellen, die in Hydrogel eingebettet sind, werden mit Z-Stacks-Analysen entlang der Hydrogeltiefe im Laufe von 10 Tagen verfolgt. Mit dieser Methode wird eine robuste Kinetik der Zystenbildung Effizienz und Wachstum erhalten. Wir präsentieren auch Methoden zur Bewertung der Zystenpolarität und der Sekretorialfunktion. Schließlich werden zusätzliche Tipps zur Optimierung von Immunstaining-Protokollen zur Verfügung gestellt, um den Zystenkollaps für die Bildgebung zu begrenzen. Dieser Ansatz kann auf andere 3D-Zellkulturstudien angewendet werden, wodurch die Möglichkeiten eröffnet werden, ein System mit einem anderen zu vergleichen.

Introduction

In den letzten drei Jahrzehnten hat sich der Bereich der In-vitro-Forschung zu 3D-Kultursystemen entwickelt. Eine Reihe von Protokollen sind für die Kultivierung von Zellen in 3D als Sphäroide oder Aggregate in Gegenwart oder Abwesenheit eines Gerüstes/Matrix, in einem Tropfen, in Deragitation, in mikrofluidischen Geräten oder schwimmend¹entstanden. Die Verwendung von 3D-Kulturmethoden hat sich gegenüber 2-dimensionalen (2D) Kulturen bewährt, insbesondere bei Epithelzellen, die sich nachweislich in 3D-Strukturen, zysten oder acini, selbst organisieren. In diesem Fall bilden die Zellen eine Monoschicht, die ein Lumen umgibt, wo Zellen ihren voll....

Protocol

1. Erzeugung von Zysten

HINWEIS: Dieses Protokoll kann mit jeder Art von Hydrogel durchgeführt werden, wenn die Gegebung das Einbetten von Zellen zulässt.

1. Hydrogelbeschichtung
   HINWEIS: Die richtige Hydrogelbeschichtung des Kammerschlittens ist ein kritischer Schritt, um die Bildung von 2D-Zellschichten auf der Unterseite des Brunnens zu vermeiden, die die nachfolgende Zystenbildgebung stören und die Berechnung der Zystenbildungseffizienz beeinträchtigen könnten.
   1. Um die Homogenität der Gellösung zu gewährleisten, das Hydrogel über Nacht (O/N) bei 4 °C auftauen.
   2. Vorcoolpipettenspitzen auf Eis oder O/N bei -20 °....

Results

Bildung und Charakterisierung von Zysten
3D-Zellkultursysteme sind ein wichtiges Werkzeug, um Organogenese und Krankheitsmodellierung zu studieren²⁵. Leider sind die meisten dieser Methoden qualitativ oder verwenden interne Quantifizierung auf einer einzigen Ebene durch den Vergleich der Anzahl der Zysten im Vergleich zu Nicht-Zysten, in variablen und oft nicht spezifizierten Volumen, verhindert jeden Vergleich in Bezug auf Zystenbildung Effizienz zwischen den verschiedenen Stu.......

Discussion

Um die Organogenese und die Erhaltung von 3D-Zellstrukturen zu untersuchen, wurden verschiedene Gewebe modelliert, mit unterschiedlichen zellulären Ursprüngen, aber auch verschiedenen Arten von extrazellulären Matrizen einschließlich synthetischer Hydrogele^8,9,10,21. Aufgrund des Fehlens einer quantitativen 3D-Analyse, die Vergleiche zwischen Methoden in Bezug auf Organoidbildung oder Funktiona.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 & Mikro; l- Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000020
100 µ l - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000046
1000 µ l - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000062
1X PBS	Thermo Fisher Scientific	14190-094
200 µ l - Pipette Eppendorf Research Plus	Thermo Fisher Scientific	3120000054
3,3′,5-Triiod-L-thyronin, Natriumsalz	Sigma-Aldrich	T5516	NRC, vollständiges Medium, Endkonzentration = 3,4 µ g/mL
Essigsäure	VWR	20104-298	0,02N final
Aerosolbarriere-Pipettenspitzen 10 & micro; l (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707439
Aerosol-Barriere-Pipettenspitzen 1000 & Mikro; l (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707404
Aerosolbarriere-Pipettenspitzen 200 & Mikro; l (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	2707430
Antibiotische Antimikotische Lösung (100X)	Sigma-Aldrich	A5955	NRC vollständige mittlere Endkonzentration = 1:100 Verdünnung
Rinder-Hypophysenextrakt	Thermo Fisher Scientific	13028-014	NRC vollständige mittlere Endkonzentration = 30 & Mikro; g/mL
Rinderserumalbumin	Sigma-Aldrich	A2153	1:1000 Verdünnung
Chemisch definiertes Lipidkonzentrat (100X)	Thermo Fisher Scientific	11905-031	NRC vollständig mittlere Endkonzentration = 1:100 Verdünnung
Kollagen hohe Konzentration, Rattenschwanz	Thermo Fisher Scientific	354249	50 & Mikro; g/mL Endkonzentration
Dexamethason	Sigma-Aldrich	D4902	NRC vollständiges Medium Endkonzentration = 0,393 & Mikro; g/mL
DMEM F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	NRC vollständiges Medium Endkonzentration = 1X
E-Cadherin Kaninchen Anti-Human, Ratte, Polyklonal	Thermo Fisher Scientific	PA5-32178	1:400 Verdünnung
Eclipse TE300 inverses Mikroskop	Nikon
Bildgebung Ethanolamin	Sigma-Aldrich	E9508	NRC komplettes Medium final Konzentration = 0,32 mM
Fötales Kälberserum	Thermo Fisher Scientific	10270-106	NRC vollständiges Medium Endkonzentration = 5:100 Verdünnung
Fluoroshield mit DAPI (Eindeckmedium)	Sigma-Aldrich	F6057
Formaldehyd 16% (W/V)	Thermo Fisher Scientific	28906	4% (W/V)
Ziegenserum	Thermo Fisher Scientific	16210-064	1:10 Verdünnung
Hamamatsu Kamera (Digitalkamera C11440 ORCA - Blitz 4.OLT)	Hamamatsu		Bildgebung
Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	B1155	5 µ g/mL Endkonzentration
IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierte Ziege Anti-Kaninchen, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Fisher Scientific	A32733	1:500 Verdünnung
ImageJ Version 2.0.0-rc-69/1.52n			Open-Source-Bildverarbeitungssoftware
Insulin-Transferrin-Selen (100X)	Thermo Fisher Scientific	51300-044	NRC vollständige mittlere Endkonzentration = 1:100 Verdünnung
L-Glutamin (100X)	Thermo Fisher Scientific	25030-024	NRC vollständiges Medium Endkonzentration = 1:100 Verdünnung
Matrigel GFR (Stammkonzentration 9,7 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	356231	4:10 Verdünnung
NIS Elements Softwareversion 4.50.00	Nikon		Bilderfassung und Anzeige
Nicht-essentielle-Aminosäuren-Lösung (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-035	NRC vollständiges Medium Endkonzentration = 1:100 Verdünnung
Objektiver Plan Fluor 10X/0,30 Ph1 DL (∞/1,2 WD 15,2)	Nikon
Prolong Gold Antifade Reagenz	Thermo Fisher Scientific	P36931
Propidiumiodid (PI)	Sigma-Aldrich	P4170 20	& Mikro; g/mL Endkonzentration
Rhodamin Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	R415	16,2 nM Endkonzentration
Sir-Actin / Verapamil Kit	Spirochrome	SC001	10 & Mikro; M Endkonzentration
Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	17075-029	NRC vollständig Medium Endkonzentration = 50 & Mikro; g/mL
Steriles Zellsieb 40 &Mikro; m (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	22363547
Sterile Pipetten 10 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	1367811E
Sterile Pipetten 5 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	1367811D
Sterile Röhrchen 1,5 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	11926955
Sterile Röhrchen 15 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	7200886
Sterile Röhrchen 50 mL (Fisherbrand)	Thermo Fisher Scientific	553913
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389	5:100 Verdünnung
Gewebekulturen behandelter Kolben 25 cm2 (Falcon)	Thermo Fisher Scientific	353108
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	5:1000 Verdünnung
Trypsin-EDTA (0,05%) Phenolrot	Thermo Fisher Scientific	25300-054	1X
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	5:10000 Verdünnung
Vitamin (100X)	Thermo Fisher Scientific	11120-037	NRC vollständiges Medium Endkonzentration = 1:100 Verdünnung
μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi	Clinisciences	80826