Summary
Sistemas celulares tridimensionais (3D) são modelos relevantes para investigar organogênese. Propõe-se um método à base de hidrogel para a produção de cistos biliares e sua caracterização. Este protocolo desvenda as barreiras da caracterização 3D, com um método simples e confiável para avaliar a eficiência, tamanhos e testar sua funcionalidade.
Abstract
Cholangiocytes, as células epiteliais que alinham os dutos biliares no fígado, supervisionam a formação e modificação da bile. Nos últimos vinte anos, no contexto das doenças hepáticas, surgiram modelos tridimensionais (3D) baseados em cholangiocitos, como cistos, esferoides ou estruturas semelhantes a tubos para imitar topologia tecidual para organogênese, modelagem de doenças e estudos de rastreamento de medicamentos. Essas estruturas foram obtidas principalmente pela incorporação de cholangiocitos em um hidrogel. O objetivo principal foi estudar a auto-organização abordando a polaridade epitelial, propriedades funcionais e morfológicas. No entanto, pouquíssimos estudos se concentram na eficiência da formação de cistos. Quando este é o caso, a eficiência é muitas vezes quantificada a partir de imagens de um único plano. Ensaios funcionais e análises estruturais são realizados sem representar a potencial heterogeneidade da distribuição de cisto surgida de heterogeneidades de polimerização de hidrogel e efeitos colaterais. Portanto, a análise quantitativa, quando feita, não pode ser utilizada para comparação de um artigo com outro. Além disso, essa metodologia não permite comparações do potencial de crescimento 3D de diferentes matrizes e tipos de células. Além disso, não há menção à solução experimental de problemas para cistos imunossínetos. Neste artigo, fornecemos um método confiável e universal para mostrar que a distribuição celular inicial está relacionada à distribuição vertical heterogênea da formação de cisto. As células de colangiocitos embutidas em hidrogel são seguidas com a análise de pilhas de Z ao longo da profundidade do hidrogel ao longo do tempo de 10 dias. Com este método, obtém-se uma cinética robusta da eficiência e crescimento da formação de cistos. Também apresentamos métodos para avaliar a polaridade do cisto e a função secreta. Finalmente, dicas adicionais para otimizar protocolos de imunossuagem são fornecidas a fim de limitar o colapso do cisto para imagens. Essa abordagem pode ser aplicada a outros estudos de cultura celular 3D, abrindo assim as possibilidades de comparar um sistema com outro.
Introduction
Nas últimas três décadas, o campo da pesquisa in vitro avançou em direção aos sistemas de cultura 3D. Uma série de protocolos surgiram para a cultura de células em 3D como esferoides ou agregados na presença ou ausência de um andaime/matriz, em uma gota, em agitação, em dispositivos microfluidos, ou flutuante1. O uso de métodos de cultura 3D provou suas vantagens sobre culturas bidimensionais (2D), particularmente para células epiteliais, que foram demonstradas para auto-organizar em estruturas 3D, chamadas cistos ou acini. Neste caso, as células formam uma monocamada circundando um lúmen, onde as células adquirem seu fenótipo epitelial completo com funções específicas fisiológicas melhoradas2.
Inúmeros estudos têm contribuído para o desenvolvimento de métodos para a formação desses organoides epiteliais em matrizes naturais. Isso permitiu recapitular interações in vivo célula-célula e microambiente celular, para obter o estabelecimento e a estabilidade do fenótipo epitelial3,4,5,6,7. Recentemente, e em particular com o objetivo de desenvolver organoides transplantáveis e decifrar a exigência do microambiente para orquestrar o programa epitelial, hidrogéis sintéticos foram desenvolvidos para melhorar a formação de acini epitelial8,9,10. Infelizmente, esses estudos relatam dados qualitativos, ou apresentam métodos de cálculo utilizando referências internas, como a razão de cistos sobre não cistos em um plano 2D8,9,10. Isso exclui qualquer comparação entre diferentes estudos em termos de eficiência, estabilidade ou caracterização morfológica e fisiológica dos organoides epiteliais.
A microencapsulação de células epiteliais em contas usando dispositivos microfluidos permitiu resultados quantitativos e comparativos mais realistas. Utilizando essa tecnologia, organoides de vários tipos celulares foram formados e diferenciados com base na morfologia entre diferentes estruturas celulares 3D11,12. No entanto, essa tecnologia não é fácil de trabalhar e requer o uso de salas limpas para produzir os dispositivos microfluidos. Esta tecnologia foi estabelecida para alguns tipos de hidrogéis, mas requer adaptação técnica para ser aplicada a outros hidrogéis, restringindo sua versatilidade. Portanto, a maioria dos estudos destinados a desenvolver organoides epiteliais dependem da incorporação de células epiteliais em um granel de hidrogel. Nesses métodos, a alta heterogeneidade da estruturação em gel e distribuição celular dentro de toda a cultura 3D é muitas vezes negligenciada. Portanto, a maioria das análises diz respeito a imagens 2D únicas, que representam apenas muito aproximadamente a distribuição dos vários objetos celulares em todo o volume 3D.
Doenças que afetam os ductos biliares, como o colangiocarcinoma, atresia biliar, cholangite esclerosante primária, entre outras, são uma das principais causas de mortalidade e morbidade. Com exceção do transplante de fígado, não há tratamentos eficazes para essas condições13. Os esforços para investigar a formação de dutos biliares, as causas da doença e a progressão permitirão o desenvolvimento de novas terapias14.
Foram desenvolvidos modelos organotipicos biliares de cistos, esferoides ou estruturas semelhantes a tubos utilizando linhas celulares de cholangiocitos normais ou derivadas do paciente, diferenciadas ou progenitoras,15,16,17,18,19,20. Vários estudos têm polarização de colangiocito recapitulado, expressão de marcadores de cholangiocito, presença de cílios, collangiocitos secretos e capacidade reabsortiva, e formação e obstrução de lúmen; todas elas representam características importantes do fenótipo de colangiocito, morfologia e função15,17,19. Outros relataram a manutenção de organoides biliar derivados do paciente por longos períodos detempo 20. Recentemente, investigamos o papel das pistas bioquímicas e biofísicas sobre cistos biliares organogênese21. Importante ressaltar que a patogênese da atresia biliar foi estudada em esferoides biliares e tubos7,22. Além disso, características-chave da colangite esclerosante primária, como senescência de colangiocito, secreção de citocinas pró-inflamatórias, bem como o recrutamento de macrófagos foram estudados com sucesso usando esferoides biliares15,20. No entanto, modelos quantitativos in vitro in vitro 3D que modulam fisiologicamente fenótipo de collangiocito, fisiologia e microambiente onde essas questões podem ser abordadas ainda são necessários. Além disso, apenas poucas publicações relataram eficiência de formação de cisto21,23. Este é um ponto importante a se estabelecer, particularmente ao investigar organogênese, causa da doença e correlação de respostas medicamentosas com função de cholangiocito e polarização. Além disso, com diferenças no andaime/matriz utilizadas do protocolo ao protocolo, é difícil comparar entre sistemas. Para resolver essas questões, propomos um método quantitativo, confiável e universal para gerar cistos biliares imitando a formação de lúmen, a polarização do cholangiocyte e a função secreta do cholangiocito. É importante ressaltar que apresentamos uma análise sistemática realizada ao longo do eixo Z ao longo do gel 3D ao avaliar ao longo do tempo, eficiência de formação de cisto, tamanho, viabilidade, polarização e funcionalidade. Além disso, utilizamos um hidrogel natural e collangiocitos normais de ratos (NRC)s, como exemplo para o protocolo, mas outros hidrogéis naturais ou sintéticos, bem como células epiteliais poderiam ser usados para a formação de estruturas císticas 3D.
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Protocol
1. Geração de cistos
NOTA: Este protocolo pode ser realizado com qualquer tipo de hidrogel, se a gelação permitir a incorporação de células.
- Revestimento de hidrogel
NOTA: O revestimento adequado do hidrogel do escorregador da câmara é um passo crítico para evitar a formação de camadas de células 2D na parte inferior do poço, que podem interferir com a imagem subsequente do cisto e prejudicar o cálculo da eficiência da formação de cisto.- Para garantir a homogeneidade da solução de gel, descongele o hidrogel a 4 °C durante a noite (O/N).
- Dicas de pipeta pré-mistura no gelo ou O/N a -20 °C e um deslizamento de câmara de 8 poços a -20 °C O/N.
- Coloque o hidrogel e o deslizamento de câmara de 8 poços em um balde de gelo cheio de gelo.
- Em um tubo cônico de 15 mL, prepare uma solução contendo 40% de hidrogel (V/V) em meio completo NRC frio (ver Tabela de Materiais) e coloque o tubo no gelo.
- Para revestir um escorregador de câmara, utilizando pontas de pipeta fria, adicione 50 μL de solução de hidrogel no centro de cada poço, e espalhe por toda a superfície usando uma ponta de pipeta, mantendo o deslizamento da câmara no gelo(Figura 1A).
NOTA: Espalhe a solução de hidrogel o mais uniforme possível evitando bolhas. - Para polimerizar o hidrogel, incubar o escorregador de câmara por pelo menos 15 min a 37 °C, 5% DE CO2.
- Preparação celular
- Aqueça o soro fisiológico tamponado nrc completo, fosfato (PBS), e o ácido tetraácático de trippsin-etilenodiamina (trypsin-EDTA) em um banho de água pré-aquecido a 37 °C.
- Enquanto o hidrogel estiver polimerizando, certifique-se de que as NRCs sejam cultivadas até 70% de confluência em um frasco t-25 cm2 revestido de colágeno21. Lave as células uma vez com 1x PBS pré-aquecido.
- Incubar os NRCs com 5 mL de PBS pré-aquecido 1x (para um frasco T-25 cm2) por 20 min a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Esta etapa, que reduz o tempo de incubação com trypsin-EDTA, é fundamental para manter as propriedades auto-organizadoras das células. - Descarte o PBS, adicione 1 mL de trippsina-EDTA e incubar por 5-10 min a 37 °C, 5% CO2.
- Neutralizar com 4 mL de meio NRC completo pré-aquecido. Colete e transfira a suspensão da célula em um tubo cônico de 15 mL e gire a 150 x g por 4 min.
- Descarte o meio e resuspenque a pelota de célula em 5 mL de meio pré-aquecido.
- Usando um coador de células de 40 μm, filtrar a solução celular em um tubo cônico de 50 mL e contar as células.
NOTA: Passar as células através de um coador é um passo crítico para que os resultados quantitativos sejam reprodutíveis, ou seja, para obter tamanho quase semelhante de agregados celulares a serem incorporados.
- Incorporação de suspensão celular em solução de hidrogel
- Preparar uma solução de 1.600 μL de 80% de hidrogel (V/V) em meio NRC completo a frio (tubo 1); manter no gelo. Diluir 5 x 105 células/mL em 1.600 μL de meio NRC completo frio (tubo 2) e manter no gelo.
NOTA: Esta etapa deve ser realizada rapidamente para evitar a polimerização do hidrogel, ao mesmo tempo em que a mistura com a suspensão celular e para manter a viabilidade celular. - Para preparar uma solução de semeadura celular de 2,5 x 105 células/mL em 40% de hidrogel (V/V), misture tubo 1 e tubo 2. Adicione 400 μL da solução celular em cada poço do slide de câmara revestido de hidrogel evitando bolhas(Figura 1B).
- Mantenha o deslizamento da câmara em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 até que a mídia mude.
- Após 2 dias na cultura, remova 250 μL do meio de um canto de cada poço, tenha cuidado para não pipeta o hidrogel. Em seguida, adicione lentamente 250 μL do meio de cultura. Troque o meio a cada 2 dias.
NOTA: Minimize o movimento do deslizamento da câmara, particularmente durante a iniciação do cisto.
- Preparar uma solução de 1.600 μL de 80% de hidrogel (V/V) em meio NRC completo a frio (tubo 1); manter no gelo. Diluir 5 x 105 células/mL em 1.600 μL de meio NRC completo frio (tubo 2) e manter no gelo.
2. Quantificação de cisto
- Imagem de cisto
NOTA: Esta seção deve ser realizada rapidamente para não comprometer a viabilidade celular se o microscópio não estiver equipado com uma câmara de aquecimento para controlar o CO2 e a temperatura. Para garantir uma quantificação consistente, representativa da distribuição de cistos no volume total de hidrogel, os cistos são imagens via microscopia de contraste de fase e imagem serial (Z-stacks), com parâmetros pré-definidos em diferentes pontos de tempo.- Pegue uma pilha Z ao longo da profundidade do hidrogel para cada ponto de tempo(Figura 1C, D). Neste exemplo, as pilhas Z são tomadas nos dias 1, 2, 4, 7 e 10.
NOTA: Verifique se a distribuição inicial da célula é uniforme no hidrogel para garantir a aplicabilidade deste método.- Com um microscópio de contraste de fase equipado com um software de aquisição de imagens, selecione a ampliação objetiva de 10x na janela manual da almofada de peça do nariz(Figura 2B(1).
- Ligue a lâmpada branca e selecione a opção de imagem brightfield.
- Ligue a câmera selecionando o botão "Reproduzir" no submenu da barra. Concentre-se em um campo de cistos e ajuste o tempo de exposição(Figura 2B(2)). Abra a janela Pasta de Captura Automática para uma economia automática de imagens(Figura 2B(3)).
- Abra a janela da série Z de captura e defina com o parafuso Z os planos superior e inferior da pilha Z (as mesmas coordenadas XY, mas diferentes telas Z). Ajuste a etapa Z dependendo do objetivo, do nível de resolução e pressione o botão "Executar agora" para iniciar a aquisição(Figura 2B(4)).
NOTA: Neste exemplo, os cistos são espalhados sobre uma espessura de hidrogel de 520 μm. 26 imagens são adquiridas ao longo da profundidade do hidrogel com um intervalo de 20 μm de passo Z. Dependendo do objetivo, a etapa Z deve ser ajustada para não perder nenhum cisto e garantir a detecção de células e agregados únicos. - Tome pelo menos 3 pilhas Z não sobrepostas por poço.
NOTA: Esta amostragem é necessária quando, como neste exemplo, os cistos são mais numerosos na profundidade do gel do que nas bordas devido às heterogeneidades na polimerização do hidrogel. - Para que um conjunto de dados representativo repita a etapa 2.1.1.5. para 3 poços no total.
NOTA: A distribuição heterogênea dos cistos depende do tipo de hidrogel, sua polimerização e da linha celular. Considerando três pilhas de Z por poço e três poços por experimento, um mínimo de 200 cistos são imagens ao longo de nove pilhas Z para caracterizar a formação de cisto e o crescimento de cistos em cada ponto de tempo.
- Pegue uma pilha Z ao longo da profundidade do hidrogel para cada ponto de tempo(Figura 1C, D). Neste exemplo, as pilhas Z são tomadas nos dias 1, 2, 4, 7 e 10.
- Processamento de imagens
NOTA: Em um hidrogel, as NRCs podem ser encontradas como células únicas, cistos ou agregados. Os cistos são identificados pela presença de uma concha celular redonda e fina contrastada que envolve um lúmen, enquanto os agregados celulares apresentam uma forma irregular e não possuem lúmen. Agregados e células individuais têm aparência densa e contrastada(Figura 3B(4)).- Abra o software Fiji, abra a pilha Z e vá para o menu Fiji e clique em Arquivo | Aberto (FiguraSuplementar 1). Selecione a pilha Z para analisar. Se necessário, selecione "Virtual Stack" e clique em "Sim" para abertura (Figura 3A(1)).
- Duplicar a pilha via Imagem | Duplicata. Clique na caixa "Duplicar stack" e clique em "OK"(Figura Suplementar 2).
NOTA: Neste exemplo, as pilhas Z estão em formato de arquivo .nd2 codificado em 16 bits. - Crie uma projeção de intensidade mínima a partir da pilha duplicada. Vá para o menu Imagem | Pilhas | Projeto Z. Selecione o tipo de projeção "Intensidade mínima" e clique em "OK"(Figura 3A(2)(Figura Suplementar 3).
- Subtraia o fundo da projeção. Vá para o menu Processo | Subtrair fundo. Digite 500,0 pixels de raio de bola rolando e clique em "fundo de luz" para tornar os cistos mais contrastados do que o fundo(Figura 3A(3)(Figura Suplementar 4).
NOTA: O raio da bola rolante define o tamanho da região em que a subtração de fundo é operada. Este parâmetro deve ser definido para o tamanho do maior objeto a ser identificado. - Se for necessário aprimoramento de contraste, vá para o menu Imagem | Ajuste | Brilho/Contraste | Auto | Inscreva-se. Fiji otimizará automaticamente o brilho e o contraste. Em (Figura 3A(3)), os valores cinza inferior e superior foram definidos para 49702 e 65452, respectivamente (Figura Suplementar 5).
NOTA: Se a projeção não estiver calibrada, vá para o menu Analisar | Defina a escala e digite a razão de calibração correspondente μm/pixel(Figura Suplementar 6).
- Contagem de cisto e medidas de tamanho de cisto
- Para medir o diâmetro aproximado do cisto, selecione a ferramenta linha reta no menu Fiji e desenhe uma linha através do diâmetro de cada cisto na projeção final(Figura 3B(4)). Adicione a nova região de interesse (ROI) criada para cada cisto ao gerenciador de ROI: pressione o atalho "t" no teclado para uma contagem mais rápida e abertura do gerenciador de ROI. Clique em "Mostrar Tudo" para ver os cistos contados(Figura Suplementar 7)
- Verifique se nenhum cisto foi deixado sem contar sobrepondo os ROIs definidos da projeção na pilha Z. Para isso, clique na janela Z-stack para selecioná-la. No ROI Manager, clique em "Mostrar Tudo" e mova o cursor ao longo da pilha Z para verificar essa imagem por imagem, todos os cistos foram contados(Figura Suplementar 8).
- Uma vez que novos cistos tenham sido contados e ROIs adicionados na etapa 2.3.1., selecione o conjunto ROI e salve-o através da janela ROI Manager clicando mais | Poupança (Figura Suplementar 9).
- Selecione todos os ROIs no GERENCIADOr de ROI e clique em "Medida" no Gerenciador de ROI para obter o tamanho de cada cisto. Isso abrirá uma nova janela de medições chamada "Resultados" numerando cada cisto e seu tamanho estimado. Em seguida, salve em .csv formato clicando na janela "Resultados" e através do menu: Arquivo | Salvar As (Figura Suplementar 10).
NOTA: Uma macro pode ser criada para processar pilhas semiautomáticas, estimar números/tamanhos de cisto das projeções e armazenar os dados para um procedimento de contagem mais rápido. Para isso, selecione a ferramenta "Gravar" no menu da barra, clicando em Plugins | Macros | Recorde.
- Quantificação da eficiência da formação de cisto
- Conte o número de cistos no dia Y,
em uma projeção (Y=1, 2, 4, 7 ou 10). - Para calcular a eficiência de formação de cisto para 1000 células no dia Y, divida o número de cistos contados nesse ponto de tempo pelo número de células semeadas no dia 0 inferidas do volume de hidrogel e multiplique por 1000 (Figura 3C, Figura 4).
- Conte o número de cistos no dia Y,
em uma projeção (Y=1, 2, 4, 7 ou 10).
3. Viabilidade celular
- Prepare uma solução de estoque de diacetato de fluoresceína (FDA) a 5 mg/mL dissolvendo 5 mg de FDA em acetona de 1 mL e armazene a -20 °C.
- Prepare uma solução de estoque de iodeto de propídio (PI) a uma concentração de 2 mg/mL em água deionizada (dH2O) e armazene a 4 °C.
- Prepare o meio NRC sem soro de bezerro fetal (FCS).
- Para preparar a solução de coloração FDA/PI, adicione 4 μL de solução de estoque FDA (concentração final de 8 μg/mL) e 25 μL de solução de estoque PI (20 μg/mL de concentração final) em 2,5 mL de meio NRC sem FCS.
- Retire o meio do slide da câmara, adicione 250 μL de solução de coloração em cada poço e incuba 4-5 min no escuro a 37 °C, 5% DE CO2. Pipeta a solução de coloração cuidadosamente e lave uma vez com 250 μL de 1x PBS.
- Adicione cuidadosamente 250 μL de meio NRC completo a cada poço e tire fotos usando um microscópio de fluorescência invertido com filtros de isocitonato vermelho e fluoresceína do Texas (FITC). As células vivas serão verdes e as células mortas serão vermelhas(Figura 5A).
NOTA: Para quantificar as células vivas/mortas, pegue pilhas de Z através do volume de hidrogel após o passo 2 e adapte o método de processamento de imagem para fluorescência.
4. Atividade de secreção
NOTA: A atividade de secreção através da membrana apical dos colangiocitos é avaliada pela secreção de fluoresceína no lúmen. Sua especificidade pode ser avaliada fazendo o mesmo teste com o Verapamil, um inibidor de transporte multi-resistente (MDR)24.
- Para preparar uma solução de coloração de Hoechst 33258 a 5 μg/mL, adicione 0,83 μL de solução de estoque Hoechst (concentração de estoque de 15 mg/mL em dH2O) em 2,5 mL de meio NRC sem FCS.
- Adicione 250 μL de solução Hoechst em cada poço e incubar a 37 °C, 5% de CO2 por 15 min.
- Remova a solução Hoechst e adicione 250 μL de solução FDA (concentração final de 8 μg/mL) em cada poço. Incubar 4-5 min a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Assim que as células forem expostas à solução de coloração da FDA, o acompanhamento da cinética de secreção de fluoresceína pode ser útil para calibrar o tempo necessário para que os cistos se secretem. Para isso, tire fotos a cada minuto por 1h através de imagens de lapso de tempo. Neste exemplo, o tempo necessário para observar cistos secretos do NRC no hidrogel é de cerca de 15-20 min. - Tire imagens usando um microscópio de fluorescência invertida 5 minutos após enxaguar com meio sem FCS. Use filtros 4′,6-diamidino-2-fenilôs (DAPI) e FITC para revelar rotulagem de núcleos e acúmulo de fluoresceína no lúmen(Figura 6A). Para quantificar o número de cistos secretos, pegue pilhas Z como na etapa 2 e adapte as etapas de processamento de imagem a imagens fluorescentes.
NOTA: Para o teste de Verapamil, preceder o processo anterior (etapas 4.3. a 4.4.) por uma incubação com Verapamil, de acordo com as seguintes condições: - Prepare uma solução de estoque de 10 mM Verapamil em sulfóxido de dimetila (DMSO). Para preparar a solução de trabalho de 10 μM, misture 2,5 μL de solução de estoque Verapamil com meio de cultura de 2,5 mL sem FCS.
- Para avaliar que a fluorescência no lúmen resulta da secreção de MDR, tome outro slide e adicione 250 μL de solução de trabalho Verapamil em cada poço e incubar 20 min a 37° C, 5% CO2
- Remova a solução e adicione 250 μL de solução FDA (concentração final de 8 μg/mL) em cada poço. Incubar 4-5 min no escuro a 37 °C, 5% CO2. Em seguida, lave com 250 μL de 1x PBS, antes da imagem(Figura 6B, C).
5. Avaliação da polaridade epitelial por imunofluorescência
- Para preparar a solução de fixação, misture 4% de formaldeído com 5% de sacarose, em 1x PBS, pH 7.4 e incubar em banho-maria pré-aquecido a 37 °C.
- Para fixar as células, pipeta suavemente o meio de cultura do poço sem danificar a matriz. Adicione lentamente 400 μL da solução de fixação ao lado dos poços. Incubar por 20 min em temperatura ambiente (RT).
NOTA: Deixe sempre 25 μL do líquido acima da matriz para evitar seu dano. - Remova suavemente a solução de fixação e lave 3x com 400 μL de 1x PBS at (RT).
- Pipeta para fora do PBS, adicione 400 μL de solução de permeabilização (0,5% Triton X-100 em 1x PBS) e incubar 10 min na RT.
- Remova suavemente a solução de permeabilização, seguida de 3 lavagens rápidas com 400 μL de 1x PBS e uma longa etapa de lavagem de 30 min na RT.
NOTA: Nesta etapa, o slide pode ser armazenado a 4 °C por 2 dias. Neste caso, sele o slide com um filme de parafina para evitar a evaporação e a secagem da matriz. - Remova o PBS, adicione 400 μL de solução de bloqueio contendo 0,1% de albumina de soro bovino (BSA) e 10% de soro de cabra em 1x PBS e incubar por 60 min na RT.
ATENÇÃO: Concentrações de BSA superiores a 0,1% resultarão em retração do lúmen e novo colapso de cisto (ver Seção resultados representativos) (Figura 7A). - Pipeta a solução de bloqueio e lave uma vez com 400 μL de PBS/0,05% Interpol 20 e descarte.
- Adicione 150 μL da solução de anticorpos, por exemplo, anticorpo E-cadherin diluído 1:400 e Phalloidin 568 (concentração final de 16,2 nM) em 1x PBS e incubar por 90 min na RT.
NOTA: Esta diluição de E-cadherin é a mesma usada em um protocolo padrão de imunofluorescência 2D. - Lave a amostra com 400 μL de PBS/0,05% Tween 20, 3x; cada vez incubando a amostra por 10 minutos no RT.
- Adicione 150 μL do anticorpo secundário (anti-coelho de cabra IgG Alexa Fluor Plus 647), diluído 1:500 em 1x PBS e incubar 60 min na RT.
- Lave 3x com 400 μL de PBS/0,05% Tween 20, cada vez incubando a amostra por 10 min na RT.
- Lave 3x com 400 μL de 1x PBS, cada vez incubando a amostra por 10 min na RT.
- Descarte o PBS da última lavagem e prepare o slide da câmara para visualização via microscopia confocal seguindo uma das duas opções abaixo.
- Adicione 400 μL de 1x PBS e 50 μL de DAPI por poço. As amostras podem ser examinadas através da parte inferior do poço sem a necessidade de montagem com um deslizamento de tampas (Figura 7B).
- Adicione 100 μL por poço de reagente antifade contendo DAPI e deixe o slide secando O/N na RT.
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Representative Results
Formação e caracterização de cistos
Os sistemas de cultura celular 3D são uma importante ferramenta para estudar organogênese e modelagem de doenças25. Infelizmente, a maioria desses métodos são qualitativos ou utilizam quantificação interna realizada em um único plano, comparando o número de cistos versus não cistos, em volumes variáveis e muitas vezes não especificados, impedindo qualquer comparação em termos de eficiência de formação de cisto entre os diversos estudos7,8,9,10,15,18,23. O método proposto neste protocolo, registrando todo o número de cistos e seus respectivos tamanhos ao longo do tempo do experimento, permite a análise da evolução da formação e crescimento de cistos(Figura 4).
Com base em imagens de contraste de fase, no dia 0, 8 horas após a semeadura celular, a maioria dos pequenos agregados celulares são encontrados embutidos no hidrogel. No primeiro dia, pequenos cistos de diâmetro mediano de 42,95 (26,53, 50,47) (primeiro, terceiro quartil) μm e fusão de cistos espalhados por todo o hidrogel são perceptíveis. Até o dia 4, é comum observar estruturas agregadas, bem como cistos de diâmetro mediano de 75 (56,48, 97,97) μm. Nos dias 7 e 10, o diâmetro médio do cisto atingiu 108,67 (75,31, 141,76) μm e 186,46 (113,98, 278,29) μm, respectivamente (Figura 4A-C). Curiosamente, a eficiência da formação de cistos aumenta de 70,03 ± 5,05 cistos/1000 células no dia 1 para 99,83 ± 12,81 cy células/1000 no dia 4 permanecem constantes até o dia 10 (Figura 4B), sugerindo que os cistos se formam essencialmente a partir de agregados celulares que estão presentes no momento da incorporação ou que se formam durante as próximas 48h, através da migração celular ou da fusão de pequenos agregados celulares. No que diz respeito à evolução do tamanho do cisto, enquanto o tamanho médio segue uma inclinação lenta e regular, a distribuição de tamanho aumenta amplamente ao longo do tempo de cultura, ilustrando que os vários cistos não crescem na mesma velocidade. Curiosamente, isso pode estar ligado à nossa observação (não mostrada) de que os cistos não são distribuídos uniformemente no hidrogel, os maiores cistos deitados no centro do volume de hidrogel. Uma vez que o aumento do diâmetro do cisto depende principalmente da atividade de secreção (uma vez que a taxa de divisão celular é limitada em cistos derivados do NRC), pode-se inferir que essa atividade é altamente dependente das propriedades do hidrogel que não são homogêneas no volume de cultura celular.
Em seguida, confirmamos a viabilidade das células após incorporá-las no hidrogel (dia 0) e cistos no dia 10 usando a coloração viva fda/pi(Figura 5A). FDA é uma molécula não fluorescente que só as células vivas, através de uma reação enzimática, são capazes de se converter para o composto fluorescente verde fluoresceína26. Pi é uma molécula não permeante para células vivas que se intercala no DNA das células necróticas27. Curiosamente, células mortas que representam menos de 3% de todas as células no volume de cultura no dia 10, são encontradas principalmente fora dos cistos, como células isoladas ou parte de pequenos agregados. No entanto, notamos que detritos de células necróticas se acumulam em alguns cistos grandes no dia 10(Figura 5B). Portanto, para a manutenção de culturas císticas, recomenda-se a passagem de cistos antes de 10 dias nessas condições.
Avaliação funcional
Em condições fisiológicas, a principal função dos cholangiocitos é modificar a bile canalicular através de mecanismos absortivos e secretos dos quais o canal MDR é um jogador-chave28. Para avaliar a funcionalidade dos cistos, incubamos o dia 10 de cistos com FDA/Hoechst e observamos a formação de fluoresceína e sua secreção do basal para o espaço luminal apical(Figura 6A,B). Assim, confirmando que as NRCs em cistos mantêm suas funções secretas. Além disso, a secreção de fluoresceína foi inibida pelo pré-tratamento de cistos com o inibidor de MDR Verapamil (Figura 6C),mostrando que o acúmulo de FLUOREScência FDA no lúmen deveu-se à secreção através do transporte MDR e não pelo vazamento do espaço intercelular.
Avaliação da polaridade do cisto
Para estabelecer a polarização dos cistos do NRC, realizamos uma série de etapas de otimização no protocolo de imunofluorescência. Um dos principais obstáculos no exame da polaridade das células epiteliais nos cistos é o frequente colapso da arquitetura organoide durante o processo de imunofluorescência, devido ao vazamento do fluido contido no lúmen. Para contornar esse problema, cada etapa do protocolo de imunofluorescência foi avaliada testando como várias condições podem afetar a manutenção da estrutura do cisto. Verificou-se que a modulação da fixação (formaldeído (2-4%) + sacarose (5-10%)) ou condições de permeabilização (0,1-1% tanto do Tritão X-100 quanto da sacarose) não teve muito impacto na arquitetura do cisto. Estas faixas podem ser usadas para fixar fortemente e permeabiliizar suavemente os cholangiocitos(Figura 7A). No entanto, observamos que manter a BSA em 0,1% ou menos durante a saturação é um passo fundamental para manter a integridade do cisto, pois concentrações mais elevadas resultam em retração de cisto e colapso do lúmen(Figura 7A).
As funções de colangiocito dependem de sua polaridade apico-basolateraladequada 29. Para verificar se os cistos do NRC se auto-montam em hidrogel como estruturas polarizadas, confirmamos a localização apical e basolateral de F-actin e E-cadherin, respectivamente. A expressão de e-cadherina em nossos cistos também indica que os NRCs mantêm seu fenótipo epitelial em hidrogel(Figura 7B) durante pelo menos 10 dias.
Figura 1: Fluxo experimental de trabalho de formação e caracterização de cisto. (A) Revestimento de hidrogel do deslizamento da câmara. (B) Incorporação celular no hidrogel. (C) Microscopia de formação de cisto. (D) Uma avaliação de acompanhamento de 10 dias do crescimento do cisto, viabilidade, funcionalidade e polarização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Método de aquisição de imagens. (A) Fluxo de trabalho da aquisição da pilha Z realizada ao longo da profundidade do hidrogel do dia 1 ao 10: Aquisição de pilha de Z(1) processamento de imagem da pilha Z (2) geração de projeção de intensidade mínima e quantificação de cisto(3). (B) Capturas de tela de software de aquisição de imagens mostrando a seleção do objetivo (1),o ajuste dos parâmetros (2),a economia automática de imagens(3)e a calibração da pilha Z (4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Método para quantificação do tamanho do cisto e eficiência da formação de cisto. (A) Layout de processamento de imagem representando: Z-stacks para analisar (1), sua intensidade mínima Z-projeção (2), a projeção Z final após subtração de fundo (3) usada para contagem de cisto e estimativa de tamanho de cisto. (B) Identificação de cisto na projeção (A3) com um zoom da projeção (4) para mostrar a identificação de cistos apresentados por uma concha de célula escura envolvendo um lúmen mais brilhante, que são distinguidos por linhas azuis traçadas para medição de diâmetro versus agregados com uma aparência escura e irregular apontada por setas vermelhas. (C) A fórmula para o cálculo da eficiência de formação de cisto para 1.000 células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Eficiência de formação de cisto e distribuição do tamanho do cisto no hidrogel. (A) Time-lapse mostrando imagens representativas de contraste de fase nos dias 0, 1, 2, 4, 7 e 10 das culturas 3D. (B) Gráfico de gráficos com a cinética da eficiência média da formação de cisto ± SEM (n=3). (C) Enredo de caixa e bigode mostrando a distribuição do tamanho do cisto ao longo do tempo de cultura. As barras pretas representam o primeiro quartil, a mediana e o terceiro quartil; as linhas representam a largura da distribuição; os pontos pretos representam o mínimo e o máximo da distribuição, n=3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Viabilidade de cistos NRC no hidrogel. (A) Imagens ao vivo fluorescentes representativas das culturas no dia 0 e no dia 10, manchadas com FDA (green=live) e PI (vermelho=morto). Note que a fluorescência vermelha estava associada principalmente a células únicas. (B) Imagem viva fluorescente representativa de um cisto necrosado no dia 10, onde as células mortas (em vermelho) foram vistas acumulando-se no lúmen. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Funcionalidade de cistos NRC no hidrogel. (A) Imagens ao vivo fluorescentes representativas de um cisto de 10 dias onde a camada da célula foi revelada pela rotulagem de núcleos com Hoechst (azul) e o lúmen pela FDA secreta (verde). (B) Contraste de fase representativa/imagens ao vivo fluorescentes após um teste de secreção com a FDA, que foi mostrado acumulado no lúmen. (C) Após a exposição a Verapamil, um inibidor de MDR, contraste de fase representativo/imagens ao vivo fluorescentes de cistos mostrando que a FDA foi mantida na camada da célula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Imunofluorescência de cistos NRC no hidrogel. (A) Otimização do protocolo de imunofluorescência com imagens de campo brilhante mostrando formas representativas de cisto em cada etapa do protocolo. Da esquerda para a direita:(Cisto vivo) um cisto vivo em meio completo antes da fixação, (Fixação) um cisto após a fixação, (Permeabilização) outro cisto após a permeabilização,(Saturação) um cisto após a etapa de saturação e (Rotulagem) um cisto na etapa de imunolabelação. (B) (1-2): Imagens confocalas de uma seção através de um cisto mostrando o marcador de superfície apical F-actin (vermelho-laranja), o marcador basolateral E-cadherin (verde) e os núcleos manchados com DAPI (azul). (3): reconstituição 3D de um conjunto de cistos com as seguintes rotulagens: vermelho-laranja para F-actin e verde para E-cadherin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Abertura de uma pilha. Capturas de tela do software que descreve o procedimento para abrir uma pilha Z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 2: Pilha duplicação. Capturas de tela do software mostrando o processo para duplicar uma pilha Z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 3: Geração de projeção de intensidade mínima. Capturas de tela do software que ilustra o procedimento para criar uma projeção de intensidade mínima a partir da pilha Z duplicada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 4: Remoção de fundo. Capturas de tela do software que retrata o método para remover o fundo da projeção de pilha Z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 5: Aprimoramento do contraste. Capturas de tela do software delineando as etapas para melhorar o contraste da projeção de pilha Z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 6: Calibração da imagem. Capturas de tela do software delineando o processo para calibrar a pilha Z e a projeção de pilha Z em mícrons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 7: Contagem de cistos. Capturas de tela do software que descreve o procedimento para contar cistos na projeção de pilha Z com a ferramenta de linha reta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 8: Check-up de contagem de cistos. Capturas de tela do software delineando o método para comparar o número de cistos contados na projeção Z-stack e na pilha Z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 9: economia de ROI. Capturas de tela do software mostrando como salvar o conjunto ROI definido pelas contagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 10: Medidas de tamanho e número de cistos. Capturas de tela do software detalhando como medir e salvar o tamanho do cisto e o número de cisto da projeção Z-stack e da pilha Z. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Para estudar a organogênese e a manutenção de estruturas celulares 3D, vários tecidos foram modelados, utilizando diferentes origens celulares, mas também diferentes tipos de matrizes extracelulares, incluindo hidrogéis sintéticos8,9,10,21. No entanto, devido à falta de análise quantitativa 3D que permita comparações entre métodos em termos de formação ou funcionalidade organoides7,8,9,10,15,18, a padronização adicional para hidrogel ou triagem de medicamentos permanece fora de alcance.
Para suprir essas deficiências, propomos um protocolo baseado em hidrogel, reprodutível e padronizado para gerar cistos epiteliais derivados de células. Aqui, exemplificamos-no com a formação de cistos biliares em um hidrogel derivado de lamina basal, de uma linha celular de cholangiocito referenciada. Para desbloquear a limitação da quantificação 3D, a eficiência da formação de cisto é calculada em relação ao número total de células semeadas no hidrogel e a cinética de crescimento de cisto é medida através de um volume constante de hidrogel.
Fornecemos uma série de etapas sistemáticas para gerar e caracterizar cistos, para permitir a análise quantitativa de cisto relevante. Para isso, foram feitos esforços especiais para gerar uma distribuição uniforme de agregados celulares no momento da incorporação de hidrogel e contornar a heterogeneidade da estrutura do hidrogel, o que impacta a formação de cistos, estabelecendo condições para ter uma amostra representativa para a contagem de cistos.
A reprodutibilidade experimental é abordada através de etapas críticas como, filtrando suspensões celulares para limitar o tamanho agregado celular e o pré-revestimento dos slides da câmara antes da adição de hidrogel celular para evitar a formação de camadas 2D quando as células entram em contato com a superfície do vaso cultural. A quantificação consistente é resolvida tirando fotos ao longo do eixo Z do hidrogel com um conjunto constante de parâmetros em diferentes amostras e experimentos.
A eficiência da formação de cisto e a cinética de crescimento de cisto são estimadas a partir do número total de células semeadas no hidrogel. Consequentemente, um algoritmo adaptável para processamento de imagens é proposto para segmentar imagens para contagem de cisto e medidas de tamanho de cisto. A novidade do método proposto é que a contagem e as medições são feitas em projeções de pilha Z. Após a remoção do plano de fundo específico, o número de imagens a serem analisadas é restrito, permitindo um ganho considerável de tempo e limitando a saturação do disco rígido. A imunofluorescência é uma ferramenta significativa para analisar culturas 3D no nível estrutural, em particular a polarização, chave na função celular epitelial adequada4. Assim, empreendemos a tarefa de otimizar cuidadosamente a fixação, a permeabilização e o bloqueio de etapas da parte de imunofluorescência do nosso protocolo; solução de problemas da concentração de BSA para evitar a retração de cisto e o colapso do lúmen.
Ao todo, o método proposto abre o caminho para gerar um protocolo simples, reprodutível e dispendioso, culturas celulares 3D e investigar parâmetros qualitativos e quantitativos. Além disso, este método permite comparações entre diferentes tipos de matrizes: utilizando o mesmo método com hidrogéis derivados de poli (etileno glicol) (PEG) poderíamos demonstrar que a formação e o crescimento do lúmen são criticamente dependentes da rigidez e adesão do hidrogel, respectivamente21. Este protocolo também é aplicável para comparar a formação e a função dos esferoides derivados de diferentes células, que poderiam participar da padronização de modelos epiteliais epiteliais específicos do tecido. No entanto, uma limitação é que a otimização das condições culturais, como a mídia cultural, a semeadura celular inicial e o tempo necessário para a formação de cistos podem ser necessários para outros tipos de células. No campo do ducto biliar, este trabalho pode contribuir para responder perguntas sobre organogênese do ducto biliar, bem como vias moleculares da doença e testes de drogas. Este protocolo também encontrará seu limite quando aplicado à análise de alto rendimento, uma vez que algumas etapas como contagem de cisto e processamento de imagens ainda não são automatizadas, embora propomos macros para a semimaprematização do processo de imagem que poderia ser desenvolvido para automatização. A limitação ao processamento automático neste caso é o fundo de imagem. Isso se deve à estrutura heterogênea de hidrogéis complexos naturais, tais géis do tipo membrana de porão, mas acreditamos que a automatização pode ser aplicada a géis transparentes, como hidrogéis derivados de PEG.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Estados Unidos), que gentilmente forneceu a linha celular NRC.
Este trabalho recebeu o apoio financeiro tanto do programa iLite RHU (conceder ANR-16-RHUS-0005) quanto do DHU Hepatinov.
Agradecemos a Isabelle Garcin e Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay pelo apoio à imagem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 µl - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 µl - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 µl - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL |
| Acetic acid | VWR | 20104-298 | 0.02N final |
| Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| Antibiotic Antimicotic Solution (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Bovine pituitary extract | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | 1:1000 dilution |
| Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Collagen high concentration, rat tail | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 50 µg/mL final concentration |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC complete medium final concentration = 1X |
| E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | 1:400 dilution |
| Eclipse TE300 inverted microscope | Nikon | imaging | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC complete medium final concentration = 0.32 mM |
| Fetal calf serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution |
| Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Formaldehyde 16% (W/V) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4% (W/V) |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 dilution |
| Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT) | Hamamatsu | imaging | |
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 5 µg/mL final concentration |
| IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | 1:500 dilution |
| ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n | Open source image processing software | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 356231 | 4:10 dilution |
| NIS Elements software version 4.50.00 | Nikon | image acquisition and display | |
| Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) | Nikon | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 20 µg/mL final concentration |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | 16.2 nM final concentration |
| Sir-Actin / Verapamil kit | Spirochrome | SC001 | 10 µM final concentration |
| Soybean trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL |
| Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | 5:100 dilution |
| Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 dilution |
| Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 5:10000 dilution |
| Vitamin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
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