Methylierung spezifische Multiplex Droplet PCR mit Polymer Droplet Generator Gerät für die hämatologische Diagnostik

Summary

Epigenetische Marker werden für die Untertypisierung von weißen Blutkörperchen (WBC) durch die Quantifizierung von DNA-Methylierungsmustern verwendet. Dieses Protokoll stellt ein Multiplex-Droplet-Polymerase-Kettenreaktionsverfahren (mdPCR) unter Verwendung eines thermoplastischen Elastomer(TPE)-basierten mikrofluidischen Geräts zur Tröpfchenerzeugung dar, das eine präzise und Multiplexmethylierungsspezifische Zielquantifizierung von WBC-Differentialzählungen ermöglicht.

Abstract

Ein Multiplex-Droplet-PCR-Workflow (mdPCR) und ein detailliertes Protokoll zur Bestimmung der epigenetischen Anzahl von weißen Blutkörperchen (WBC) werden zusammen mit einem thermoplastischen Elastomer (TPE) mikrofluidischen Tröpfchenerzeugungsgerät beschrieben. Epigenetische Marker werden für die WBC-Subtypisierung verwendet, die bei verschiedenen Krankheiten von wichtigem prognostischen Wert ist. Dies wird durch die Quantifizierung von DNA-Methylierungsmustern bestimmter CG-reicher Regionen im Genom (CpG loci) erreicht. In diesem Beitrag wird bisulfitbehandelte DNA aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) in Tröpfchen mit mdPCR-Reagenzien, einschließlich Primern und hydrolysefluoreszierenden Sonden, die speziell für CpG-Loci sind, die mit WBC-Subpopulationen korrelieren, eingekapselt. Der Multiplex-Ansatz ermöglicht die Abfrage vieler CpG-Loci ohne separate mdPCR-Reaktionen, was eine genauere parametrische Bestimmung von WBC-Subpopulationen mithilfe epigenetischer Analysen von Methylierungsstellen ermöglicht. Diese präzise Quantifizierung kann auf verschiedene Anwendungen ausgedehnt werden und hebt die Vorteile für die klinische Diagnose und die anschließende Prognose hervor.

Introduction

Die Analyse der Zusammensetzung weißer Blutkörperchen (WBCs) gehört zu den am häufigsten nachgefragten Labortests in der hämatologischen Diagnostik. Differential-Leukozyten-Zahl dient als Indikator für ein Spektrum von Krankheiten einschließlich Infektion, Entzündung, Anämie, und Leukämie, und wird als frühe prognostische Biomarker für mehrere andere Bedingungen sowie untersucht. Der Goldstandard in der WBC-Subtypisierung beinhaltet Immunfärbung und/oder Durchflusszytometrie, die beide kostspielige, instabil-anfällige fluoreszierende Antikörper erfordern und oft stark von der Befähigung des Bedieners in der Probenvorbereitung abhängig sind. Darüber hinaus gilt diese M....

Protocol

Alle Experimente, die in dieser Studie mit menschlichen Proben durchgeführt wurden, wurden vom NRC Ethics Board genehmigt und wurden gemäß der NRC-Politik für menschliche Probanden durchgeführt, die den geltenden Forschungsrichtlinien folgen und den Gesetzen in Québec, Kanada, entsprechen.

1. Zellvorbereitung

1. Die gefrorenen menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) sofort auftauen, indem Sie das Kryovial in einem Wasserbad bei 37 °C für 5 min platzieren.
2. Invertieren Sie die Kryovial zweimal, um die Zellen sanft wieder zu suspendieren und mit einer 1 ml Pipette übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml....

Results

Das Mikrofluid-Tröpfchengeneratorgerät tPE wurde mit dem beschriebenen Protokoll hergestellt, wie in Abbildung 1dargestellt. Eine Transparenzmaske wurde in der Photolithographie verwendet, um Silizium (Si) Master zu erhalten. Weiche Lithographie wurde durchgeführt, um eine inverse PDMS-Replik des Si-Meisters zu erhalten, die dann verwendet wurde, um die Epoxidform herzustellen. Epoxid-Vorläufer wurde auf das PDMS gegossen und zu Vernetzung und Aushärten ausgehärtet. Diese Form, die die exakt.......

Discussion

Das vorgestellte experimentelle Protokoll und die vorgestellten Methoden ermöglichen die hauseigene mdPCR mit einem hergestellten TPE-Tröpfchengenerator, einem thermischen Cycler und einem Fluoreszenzmikroskop. Das hergestellte Gerät mit weicher TPE-zu-TPE-Bindung bietet hydrophobe Oberflächeneigenschaften, die über alle Kanalwände gleichmäßig sind, so dass das Endgerät keine Oberflächenbehandlung für die spätere Verwendung als Tröpfchengenerator erfordert. Dieses Material wurde routinemäßig in Point-of-Care-Plattformen .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201	PCR-Röhrchen
RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluorTensid	Fluortensid
Silicon Quest International, Santa Clara, CA
Oxford Instruments, Abingdon, Großbritannien		EMCCD-Kamera
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		Für die Fluoreszenz-Bildanalyse
Nikon, Japan		10x Objektiv
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
Fisher, Kanada
Vitrocom, NJ, USA	5015 und 5010	Borosilikat-Kapilärrohr
(http://definetherain.org.uk/)
Hamamatsu, Japan	LC-L1V5	DEL UV-Lichtquelle
Dolomit	3200063	Einweg-Fluidschlauch
Dolomit	3200302	Einweg-Fluidikschläuche
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		Aufrechtes Lichtmikroskop
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schä rding, Österreich
Zymo Research, Irvine, CA	D5030
Photron, San Diego, CA
IDT, Coralville, IA
Gersteltec, Pully, Schweiz		SU-8 Fotolack
Fineline Imaging, Colorado Springs, CO
Qiagen, Hilden, Deutschland
Bild J		Zur Beurteilung des Tröpfchendurchmessers
Anachemia, Montreal, QC
Excelitas, MA, USA		Breitspektrum-LED-Leuchtstofflampe
Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC	DE1010
Hexpol TPE, Å MÅ l, Schweden		Thermoplastisches Elastomer (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, Japan		Wird für die Bilderfassung
verwendet 3M, St. Paul, MN		Trägeröl
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	Blau fluoreszierender Lebendzellfleck (DAPI)
IDEX Gesundheit & Gesundheit Science, Oak Harbor, WA	P-881	PEEK-Armaturen
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	806552
Dow Corning, Midland, MI
ThinkyUSA, CA, USA	ARV 310
Ihc world, Maryland, USA	IW-125-0
Zinsser NA, Northridge, CA	2607808
Cetoni GmbH, Korbussen, Deutschland
Sigma-Aldrich, Oakville, ON	484431
Bio-Rad, Mississauga, ON	1861096
Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON
Nikon, Melville, NY		Inverses Mikroskop
Nikon, Japan
Loctite	AA 352