Methodenartikel

Nahezu simultanes Laserscanning Konfokal- und Atomkraftmikroskopie (Conpokal) auf lebenden Zellen

DOI:

10.3791/61433

⸱

11. August 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Kentucky, 2Department of Chemistry, University of Kentucky, 3Department of Physiology, University of Kentucky, 4UK Light Microscopy Core, University of Kentucky

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird das Protokoll der Conpokal-Technik vorgestellt, das konfokale und atomare Kraftmikroskopie zu einer einzigen Instrumentenplattform vereint. Conpokal bietet die gleiche Zelle, die gleiche Region, fast gleichzeitige konfokale Bildgebung und mechanische Charakterisierung von lebenden biologischen Proben.

Zusammenfassung

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Die für die mikro- und nanoskalige mechanische Charakterisierung verfügbaren Techniken sind in den letzten Jahrzehnten explodiert. Von der Weiterentwicklung des Raster- und Transmissionselektronenmikroskops über die Erfindung der Atomkraftmikroskopie bis hin zur Entwicklung der fluoreszierenden Bildgebung haben sich wesentliche Fortschritte bei Technologien ergeben, die das Studium kleiner Materialien ermöglichen. Conpokal ist ein Portmanteau, das konfokale Mikroskopie mit Atomkraftmikroskopie (AFM) kombiniert, bei der eine Sonde die Oberfläche "poket". Obwohl jede Technik für die qualitative und/oder quantitative Bildsammlung allein äußerst effektiv ist, bietet Conpokal die Möglichkeit, mit gemischter Fluoreszenzbildgebung und mechanischer Charakterisierung zu testen. Conpokal wurde für nahezu gleichzeitige konfokale Bildgebung und Atomkraft-Sondierung entwickelt und ermöglicht experimentelte an lebenden mikrobiologischen Proben. Die zusätzliche Erkenntnis aus der gepaarten Instrumentierung ermöglicht die Kolokalisierung gemessener mechanischer Eigenschaften(z.B.elastischer Modul, Haftung, Oberflächenrauheit) durch AFM mit subzellulären Komponenten oder Aktivität, die durch konfokale Mikroskopie beobachtbar ist. Diese Arbeit bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Betrieb von Laserscanning Konfokal- und Atomkraftmikroskopie, gleichzeitig, um die gleiche Zelle, gleiche Region, konfokale Bildgebung und mechanische Charakterisierung zu erreichen.

Einleitung

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Mikro- oder nanoskalige mechanische Auswertungswerkzeuge werden häufig eingesetzt, um die Verformungseigenschaften auf Einzelzell- oder Mikroorganismenebene aufzudecken, während separate hochauflösende Mikroskopiewerkzeuge eingesetzt werden, um subzelluläre Prozesse und strukturelle Merkmale zu visualisieren. Conpokal ist die Kombination von laserscanning konfokaler Mikroskopie und Atomkraftmikroskopie (AFM) zu einer einzigen instrumentalen Plattform. Die Conpokal-Technik wurde zunächst in einem nicht-biologischen Polymersystem implementiert, bei dem das Ziel darin bestand, die Haftung, Elastizität und Oberflächenspannung harter Oberflächen in Kontakt mit weichen Oberflächen zu bestimmen. Konfokale Bilder lieferten eine visuelle Darstellung, wie sich das Polymer von der harten Sonde1,2verformt, haftet und freigibt. Von Polymeren bis hin zu biologischen Proben bietet diese Technik die Möglichkeit für nahezu gleichzeitige konfokale Bildgebung von lebenden Zellen oder Mikroorganismen und AFM.

Veränderungen der Zellelastizität sind in die Pathogenese vieler menschlicher Krankheiten involviert3 einschließlich Gefäßerkrankungen4Malaria5,6, Sichelzellanämie7Arthritis8Asthma9, und Krebs6,10,11,12,13,14,15. Häufige Techniken zur Messung der Zellmechanik sind die Verwendung von magnetischen Perlen16,17, optische Pinzette18,19, Micropipette-Aspiration8,20,21,22und AFM11,23,24,25,26. Seit der Anwendung von AFM auf lebende Zellen wurde es leicht angepasst, um die Zelltopographie zu charakterisieren.27,28 sowie mechanische Eigenschaften11,24,29,30,31 mit nanoskaliger Präzision. AFM wurde für die Mikrorheologie weiter angepasst32,33, Frequenzmodulation34,35, und kriechen25,36,37 Die viskoelastischen Eigenschaften verschiedener Zelllinien zu untersuchen. Die Verwendung eines geeigneten Nanokontaktmodells ist entscheidend für die Extraktion quantitativer Elastizitätswerte aus AFM-produzierten Krafteinzugsmessungen1,2. AFM-Studien, die den Einfluss von Zytoskelett-Medikamenten auf die Zellelastizität untersuchen, haben gezeigt, dass der elastische Modul stark betroffen ist38. Basierend auf den Messungen des elastischen Moduls haben viele Forscher gezeigt, dass Krebszellen weicher sind als ihre nicht transformierten Pendants.11,38,39. Erhöhte Verformbarkeit spielt wahrscheinlich eine herausragende Rolle bei der Fähigkeit von Krebszellen, Gewebe zu metastasieren und zu infiltrieren40. Ein solches Verhalten wird durch Modifikationen in der zytoskelettalen Organisation von Zellen reguliert.38,41,42. Neben Krebs sind eine weitere Klasse mechanisch abhängiger Krankheiten Atemwegserkrankungen. Zum Beispiel betrifft das akute Atemstresssyndrom jedes Jahr immer mehr Menschen. Es hat sich gezeigt, dass sich ihr Zustand verschlechtern kann, wenn Patienten mit einer mechanischen Beatmung mit hohen Sauerstoffkonzentrationen43. In einer Reihe von Studien zur Beobachtung von Alveolar-Epithelmakrophagen mit AFM fanden die Wissenschaftler heraus, dass die Zugabe einer sauerstoffreichen Umgebung die Steifigkeit der Zellen aufgrund der Aktinbildung erhöhte; ein Paradebeispiel für die Auswirkungen, die AFM auf unser detailliertes Verständnis des atmosphärischen Umwelteinflusses auf die Atmungsfunktion auf zellulärer Ebene und letztlich auf die Menschliche Heilung und Gesundheit hat44,45,46. Epithelzellsteifigkeit während der Migration in Richtung einer Wunde kann auch über AFM beurteilt werden und dass eine Variation des elastischen Moduls auftritt, um zukünftige Zellausbreitung zu signalisieren47,48. Daher ist es praktisch notwendig, die Zellmechanik quantitativ zu messen, um zu verstehen, wie sich kranke Zellen von gesunden Zellen unterscheiden und mit ihnen interagieren.

AFM wird auch verwendet, um Klebstoffeigenschaften und Oberflächenstruktur zu untersuchen. Ein Atomkraftmikroskop verfügt über eine Vielzahl von Modi, um Informationen über eine Probe mithilfe der Kontaktmechanik zu sammeln. Für lebende biologische Proben sind zwei der Hauptziele die Erzielung quantitativer mechanischer Eigenschaftswerte(z.B.elastische Module, Klebekräfte) sowie die Kartenoberflächenhöhe. Zu diesen Modi gehört der Abstichmodus (auch als intermittierender Kontakt bezeichnet), der eine konstante Auslegeramplitude beibehält, die die Probenoberfläche und den Kontaktmodus intermittierend anspricht oder senkt, wodurch der Ausleger erhöht oder gesenkt wird, um eine konstante Durchbiegung zu erhalten49. Haftungskarten können mittels Force Mapping auf dem AFM-System gesammelt werden. Der Ausleger entsteht die Probe auf eine bestimmte Kraft und wird dann zurückgezogen. Die Kraft, die dem Rückzug widerhält, wird vom Detektor gemessen, um ein Kraft-Verschiebungs-Diagramm zu erzeugen. Die Haftkraft ist die maximale Kraft, die beim Rückzug gemessen wird. Die Oberflächenmorphologie bietet eine detaillierte Ansicht der Probe auf Mikro- oder Nanoebene. Der Ausleger schließt einen Raster-Scan über die Probe ab, basierend auf dem Einzug und der Ablenkung, die von der Bewegung des Auslegers an jedem Pixel erfasst werden, wodurch mikro- und nanogroße Features aufgedeckt werden. Mit AFM kann die Größe kleiner Merkmale wie Peptidoglykanstruktur50, Polymerkettenausrichtung51, Flagella52, Lamellipodia53und Filipodia54 gemessen werden. Während die Leistungsfähigkeit von AFM in Kraftverschiebungskurven und nicht-optischen topologischen Bildern liegt, bietet die konfokale Mikroskopie eine detaillierte Abbildung fluoreszierender Proben.

Konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) ist eine dominante Technik zur Abbildung von lebenden Zellen, festen Zellen und Geweben55,56,57. CLSM ist seit 1955 für die biologische Bildgebung im Einsatz, d.h.seit seiner Gründung58,59. Während das Arbeitsprinzip der konfokalen Mikroskope(d.h.die Ablehnung von fokuspunktiertem Licht durch ein Loch) weitgehend gleich geblieben ist, ist die technische Umsetzung sehr vielfältig geworden56,57,58,60. Konfokale Bildgebung kann über Multipoint-Scanning implementiert werden, wie in einem Spinning Disc System61, Punktscannen eines einzelnen Laserstrahls, wie beim Linienscannen62, oder die Abbildung der Punktstreufunktion mit nachfolgenden Pixel-Neuzuweisungen über einen Multielementdetektor57. Jüngste Fortschritte, die den Nutzen der konfokalen Bildgebung erweitern, umfassen Laserscanning-Fähigkeit, Hochgeschwindigkeits-Resonanzscanning und hochempfindliche Detektoren63,64,65. Der Vorteil, den alle konfokalen Systeme gegenüber Weitfeldmikroskopen haben, ist die Fähigkeit, optische Schnitte in der z-Achse mit größerer Detailgenauigkeit durchzuführen, insbesondere in dicken Proben. Weitfeldmikroskope mit kamerabasierter Erkennung erfassen Licht, das von der Brennebene emittiert wird, und gleichzeitig Licht, das von überall im Beleuchtungspfad emittiert wird. Durch Schließen des Lochs, auf Kosten der Reduzierung des Signals, kann sowohl die axiale als auch die seitliche Auflösung66erhöht werden. In CLSM werden Bilder pixelweise durch Dieemissionssignalerfassung aufgebaut, da ein Anregungslaser über ein x-y-Sichtfeld gescannt wird. Die Sammlung mehrerer x-y-Ebenen entlang der z-Achse des Samples kann dann verwendet werden, um die dreidimensionale Architektur des Beispiels57,67zu rekonstruieren. Konfokale Mikroskopie in Verbindung mit der Einführung von fluoreszierenden Proteinen, hat unser Verständnis der Zellbiologie revolutioniert68. Zum Beispiel ist es ein wesentliches Werkzeug in der Neurowissenschaftgeworden 69. Das CLSM wird regelmäßig verwendet, um gelöschtes Gewebe zu beobachten und umfassende Bilder von immungefärbtem Gehirn und neuronaler Netzwerkarchitektur zu erhalten70. Diese Anwendung hat zu neuen Erkenntnissen über synaptische Kontakte und Kommunikation zwischen Neuronen und Gliazellen im Gehirn71geführt. Von Gehirnzellen bis zu Vesikeln unterstützen fluoreszierende Färbeprotokolle die Inspektion und Erfassung von Zellfunktionen mittels konfokaler Mikroskopie für Fortschritte in den therapeutischen Techniken72,73.

Obwohl sie beeindruckende und vielseitige Werkzeuge einzeln sind, ermöglicht die Kombination von Konfokal- und Atomkraftmikroskopie (Conpokal) Forschern, topografische und mikromechanische Zell-/Gewebeeigenschaften mit der Beobachtung verschiedener Zellorganellen und ihrer jeweiligen Dynamik auf einzigartige Weise zu korrelieren. Gekoppelte Instrumentierung ermöglicht es Benutzern, im Wesentlichen zu "sehen", was sie prüfen; ein großer Vorteil gegenüber einer Technik für sich. Mit Conpokal wird die Kraftzuordnung durch AFM auf konfokale Bilder überlagert, um beispielsweise die Zellsteifigkeit, Haftung oder Morphologie mit der Zytoskelettstruktur innerhalb der Probe zu korrelieren. Das übergeordnete Ziel der Conpokal-Methode ist es, Forschern eine Plattform zu bieten, um lebende Proben auf eine präzise und effektive Weise zu untersuchen und sowohl Bild- als auch Materialeigenschaftendaten in einer einzigen Plattform bereitzustellen. In dieser Arbeit zeigen wir den Betrieb von Conpokal einschließlich der richtigen Probenauswahl und -vorbereitung, Der Geräteeinrichtung, der Freischwingerkalibrierung und geben Richtlinien für eine erfolgreiche Fehlerbehebung. Nach dem Protokoll liefern wir repräsentative Ergebnisse, die erfolgreiche Bakterien- und Zell-AFM-Höhenkartierung, Bakterien- und Zell-AFM-Modul-Mapping und konfokale Bildgebung von mehrbeschrifteten Zellen durch konfokale und AFM-Zellen mit gleichzelliger Konfokalität umfassen. Wir schließen mit einer Diskussion der kritischen Schritte des Conpokal-Verfahrens, Der Fehlerbehebungsempfehlungen, der Technikeinschränkungen, der Bedeutung und der Zukunftsaussichten für die Methode.

Protokoll

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1. Vorbereitung von Instrumenten, Kulturmedien, Gerichten

  1. Schalten Sie die Stromquellen sowohl für das konfokale Mikroskop als auch für das Atomkraftmikroskop sowie alle anderen zugehörigen Instrumente oder Geräte ein, die während Conpokal verwendet werden. Lassen Sie den Instrumenten genügend Zeit, um sich thermisch auszuberuhigen und zu stabilisieren, bevor Sie mit den Messungen beginnen. In der Regel ist 1 h ausreichend.
  2. Bereiten Sie eine saubere, systemzugelassene, glasbodenförmige Petrischale vor und füllen Sie halb voll, aber nicht mehr als zwei Drittel voll, mit Phosphat gepufferter Saline (PBS) oder ähnlicher klarer Flüssigkeit. Diese Schale (als "Kalibrierungsschale" bezeichnet) ist von den Probenschalen getrennt und wird verwendet, um den Ausleger des Atomkraftmikroskops (AFM) zu lokalisieren und zu kalibrieren.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Flüssigkeit klar ist und eine geringe Autofluoreszenz hat, um Störungen der Fluoreszenzspektren zu verhindern. PBS wird empfohlen, weil es die biologische Umgebung imitiert.
  3. Bereiten Sie experimentelle Probegerichte so vor, dass die zugehörige Flüssigkeit die Schale mindestens halb voll gefüllt hat. Wenn die Probe fluoreszierend ist, stellen Sie sicher, dass sie bedeckt ist oder an einem dunklen Ort, bis sie benötigt wird. Reinigen Sie den Boden aller Glasschalen mit Linsenreiniger und Linsentüchern.
  4. Erstellen Sie Datenspeicherordner für die konfokale und AFM auf der Festplatte(n) des Computers(s).

2. Auswahl von Zellen oder Mikroorganismen

  1. Um Bakterien-Stammlösung zu schaffen, impfen Streptococcus mutans Bakterien, mit einer Impfschleife, in 15 ml Todd Hewitt Hefe (THY) über Nacht (für exponentielle Phase) in einem 5% CO2-Inkubator.
  2. 1 h vor Der nachtintischer Inkubation, beschichten Sie experimentelle Probenschalen mit 1 ml Poly-l-Lysin-Lösung oder ausreichend, um den Glasteil der Glasbodenschale zu bedecken und 1 h im Biosicherheitsschrank zu lassen. Nach dem Einstellen Poly-l-Lysin-Lösung aspirieren und spülen Sie die Gerichte 3x mit PBS.
  3. Nach 18 – 24 h bakterielle inkubation, impfen THY mit 1 ml bakterielle Suspension, bis eine optische Dichte von 0,6 – 0,7 erreicht wird (typische Werte für die Inokulation sind 3 ml THY mit 1 ml bakterielle Suspension pro Schale). Fügen Sie 1 ml neue Bakterienlösung zu jeder Poly-l-Lysin-beschichteten Schale hinzu und brüten sie für 1 h. In den letzten 10 min 1 ml grünen fluoreszierenden Membranfleck (Konzentration von 1 M) zu jeder Schale hinzufügen.
  4. Spülen Sie jede Schale 3x mit PBS. Fixieren Sie die Bakterien vorsichtig mit ca. 1 ml 4% Paraformaldehydlösung für 15 min bei Raumtemperatur in einem Biosicherheitsschrank. Spülen Sie jede Schale 3x mit PBS nach der Fixierung.
  5. Bewahren Sie die Menschliche Embryonale Niere (HEK) 293 Zellen in flüssigem Stickstoff auf. Führen Sie schnelles Auftauen bei 37 °C Wasserbad vor der Beschichtung.
  6. Fügen Sie 1 ml Kellermembranmatrixlösung in Zellkulturmedien zu jeder Zellprobenschale hinzu und inkubieren (5%CO2) bei 37 °C für 1 h. Aspirieren Sie die Lösung und waschen Sie die Gerichte mit Zellkulturmedien. Die erforderliche Anzahl von HEK 293 Zellen(z.B.100.000 Zellen pro 35 mm Schale) zu vereinigen und 2 ml Zellkulturmedien hinzuzufügen. Dann inkubieren (5%CO2) die Zellen bei 37 °C für 48 h.
  7. Nach 48 h fügen Sie jeder Zellprobenschale 2 l eines fluoreszierenden Mikrotubuli-Zytoskelettfarbstoffs (Konzentration von 1x) hinzu und brüten 30 min. Aspirieren Sie die Lösung, die den Farbstoff enthält, waschen Sie die Zellen 3x mit PBS und fügen Sie 2 ml Zellkulturmedien hinzu.
  8. Plasmamembranfarbstoff (Konzentration von 10 m) zu den Probenschalen hinzufügen und 30 Minuten inkubieren. Waschen Sie die Lösung, die den Farbstoff 3x mit PBS enthält, und fügen Sie 2 ml Zellkulturmedien hinzu.
  9. Den Zellkern gegenstainieren, indem Sie den Probenschalen 1 l eines Nukleinsäurefarbstoffs (Konzentration von 10 m) hinzufügen und 30 min inkubieren. Waschen Sie die Lösung, die den Farbstoff 3x mit PBS enthält, und fügen Sie 2 ml Kulturmedien hinzu.

3. AFM-Verfahren

  1. Öffnen Sie die Betriebssoftware des Atomkraftmikroskops (AFM), indem Sie auf das Softwaresymbol auf dem Computer klicken.
  2. Drehen Sie ein Luftobjektiv mit niedriger Vergrößerung oder legen Sie es ein (empfohlen 10x oder 20x). Ein langer Arbeitsabstand von 5 mm oder mehr ist beim Absenken und Kalibrieren der Spitze von Vorteil.
  3. Montieren Sie die gewählte Zellprobenstufe, wenn sie noch nicht installiert ist. Verwenden Sie für Live-Proben eine Spülheizung, um die Probe bei der gewünschten Temperatur zu halten.
  4. Laden Sie die saubere, systemzugelassene Petrischale halb voll mit PBS (in Schritt 1.2) oder ähnlicher klarer Flüssigkeit (Kalibrierschale) gefüllt. Wenn die Probenstufe über eingebaute Verschlüsse verfügt, verwenden Sie diese, andernfalls Vakuumfett, um die Probe zu stabilisieren.
  5. Wählen Sie einen geeigneten AFM-Ausleger für die gewünschte Datensammlung aus und installieren Sie ihn wie folgt.
    1. Mit Handschuhen montieren Sie den AFM-Chip mit der AFM-Chip-Montagestufe, einer Pinzette und einem kleinen Schraubendreher in den Glasblock. Legen Sie den AFM-Chip vorsichtig auf den Glasstein und richten Sie ihn so aus, dass er zentriert ist. Der Ausleger sowie ein sehr kleiner Teil des AFM-Chips sollten sich im sichtbaren, nicht-undurchsichtigen Teil des Montageblocks befinden.
    2. Sichern Sie den Chip mit dem Schraubendreher, indem Sie die Schraube anziehen, bis der Chip an den Glasblock geschraubt ist. Prüfen Sie, ob der AFM-Ausleger mit einem Stereomikroskop oder einem Hand-Spyglas richtig ausgerichtet ist. Passen Sie nach Bedarf an. Sobald sie richtig ausgerichtet ist, legen Sie den Glasstein in die richtige Ausrichtung des AFM-Kopfes und verriegeln Sie ihn an Ort und Stelle.
      HINWEIS: Die Ausrichtung des AFM-Chips innerhalb des Glasblocks ist wichtig, damit die Systemlaser auf die Rückseite des Auslegers zielen und richtig auf den Photodetektor reflektieren. Achten Sie darauf, die Schrauben während der Platzierung nicht zu überziehen, da dieses Verfahren dazu führen könnte, dass der AFM-Chip, auslegernoder oder Spitze bricht.
  6. Mit der Hellfeld-Option des konfokalen Mikroskops können Sie die Unterseite der Kalibrierschale mithilfe des Fokusknopfes lokalisieren. Beachten Sie diese z Höhe als den Wert, wo sich der Boden der Schale in Bezug auf das Mikroskopobjektiv befindet.
  7. Mit dem Motorbedienfeld des AFM-Systems am Computer, der die Z-Schrittmotoren bedient, bewegen Sie den AFM-Ausleger von der Probe nach oben 2000 m.
  8. Mit beiden Händen legen Sie den AFM-Kopf mit dem AFM-Chip vorsichtig auf die Probenbühne und stellen Sie sicher, dass jeder der vertikalen Punkte auf dem AFM-Kopf fest in ihren dafür vorgesehenen Nuten auf der AFM-Bühne gesetzt ist. Sobald der AFM-Kopf an Ort und Stelle ist, sehen Sie visuell, wie nah der Freischwingerhalter an der Schale ist. Wenn es zu nah zu sein scheint, so dass der AFM-Kopf in Kontakt oder innerhalb von 1 mm von der Oberseite der Probenschale ist, setzen Sie ihn mit den z Schrittmotoren zurück, bevor Sie die AFM-Spitze in Richtung der Probe senken.
  9. Mit Hellfeldbeleuchtung, langsam senken Sie den AFM-Chip auf den Boden der Glasschale mit dem z Schrittmotor-Bedienfeld auf der AFM-Software. Suchen Sie die manuellen Mikrometer, die die x-y- oder in-plane Bewegung des AFM-Kopfes auf der Instrumentenplattform steuern. Passen Sie die Position des AFM-Auslegers innerhalb des Sichtfeldes an, indem Sie den AFM-Kopf korrigieren, wenn der Ausleger in Sicht kommt.
    1. Da die Lage in Bezug auf den Boden der Schale ist zu diesem Zeitpunkt unbekannt, niedriger mit Stufen von 100 – 200 m, um zu vermeiden, dass die AFM-Spitze in die Petrischale abstürzt. In der Regel muss die Spitze 800 – 2000 m abgesenkt werden. Achten Sie beim Absenken der Spitze darauf, dass ein Schatten in der Ansicht der Mikroskopsoftware angezeigt wird, was darauf hinweist, dass die AFM-Spitze näher an den Boden der Schale rückt.
    2. Verringern Sie die Inkremente auf 20 – 50 m. Stellen Sie sicher, dass Sie die Nachschlagendertät (LUTs) des Kamerabildes anpassen, wenn die Spitze in die Schale absinkt, indem Sie das LUTs-Bedienfeld der konfokalen Software verwenden. Fahren Sie fort, um die AFM-Spitze mit kleinen Schritten zu senken, bis sie meistens im Fokus steht.
    3. Stellen Sie sicher, dass die Spitze dunkel genug ist, damit die allgemeine Form im Sichtfeld sichtbar und zentriert werden kann. Stellen Sie auch sicher, dass die Spitze verschwommen erscheint, was bestätigt, dass sie noch nicht auf den Boden der Schale gestoßen ist.
  10. Stellen Sie den Mikroskopfokus so ein, dass die Spitze nun im Fokus steht, wobei der Arbeitsabstand des Ziels zu berücksichtigen ist. Bevor Sie zu einem höheren Vergrößerungsziel wechseln, verwenden Sie das Mikroskop-Messwerkzeug, um die Breite und Länge des AFM-Auslegers zu erfassen, indem Sie auf das Bedienfeld der Messwerkzeuge auf der konfokalen Software zugreifen. Beachten Sie diese Messungen.
    HINWEIS: Es ist wichtig, das Objektiv nicht in den Boden der Probenschale zu stürzen, was auch dazu führen kann, dass die Probenschale mit der AFM-Spitze in Kontakt kommt und sie potenziell beschädigt.
  11. Wenn vorhanden, entfernen Sie den Laserlichtfilter, und stellen Sie sicher, dass der AFM-Laser eingeschaltet ist, so dass das Laserlicht in der Optik sichtbar wird.
    1. Bewegen Sie den Laser mit den Laserausrichtungszifferblättern in das Sichtfeld und in die Nähe der AFM-Spitze. Sobald sich der Laser an dieser Stelle befindet, ersetzen Sie den Laserlichtfilter.
    2. Platzieren Sie den Laser mit den Laserausrichtungszifferblättern auf der Rückseite der Stelle, an der sich die AFM-Spitze auf dem Ausleger befindet. An dieser Stelle sollte das Laserausrichtungspanel ein Summensignal größer als 0,0 V lesen. Wenn kein Summensignal erhalten wird, stellen Sie den Spiegel ein, indem Sie den manuell gesteuerten Spiegelknopf verwenden, bis ein Summensignal größer als 0,0 V auf dem Bildschirm liest.
    3. Bewegen Sie den Laser in kleinen Mengen in alle Richtungen auf dem AFM Ausleger, bis die maximale Summe Signal erreicht ist, aber die Position ist an der AFM-Spitze. Sobald die Laserposition eingestellt ist, null die vertikale und seitliche Durchbiegung mit den manuell gesteuerten Umlenkzifferblättern.
    4. Beobachten Sie das Laserausrichtungspanel auf der AFM-Software und verwenden Sie die vertikalen und seitlichen Umlenkknöpfe am AFM-Kopf, richten Sie den Detektor so aus, dass das Ziel zentriert ist (roter Punkt in der Mitte des Fadenkreuzes) und es gibt keine vertikale oder seitliche Durchbiegung.
  12. Öffnen Sie das Kalibrierungsfenster in der AFM-Software. Geben Sie alle experimentspezifischen Informationen ein. Schalten Sie vor der Kalibrierung die konfokale Mikroskoplichtquelle aus und schließen Sie ggf. das AFM-Gehäuse, um mögliche Geräusche zu dämpfen, die von Raumlicht oder Raumschwingungen ausgehen. Drücken Sie dann die Kalibrierungstaste, damit das System die Spitze automatisch kalibrieren kann. Nach Abschluss der Kalibrierung werden die Steifigkeit des Auslegers (N/m) und seine Empfindlichkeit (nm/V) innerhalb des Kalibrierpanels bereitgestellt. Beachten Sie diese für eine spätere Analyse.
  13. Ziehen Sie den AFM-Ausleger mit den Schrittmotoren mindestens 2000 m ein. Nehmen Sie den AFM-Kopf von der Bühne und entfernen Sie die Kalibrierschale. Drehen Sie auf das gewünschte Ziel oder fügen Sie es ein. Ziehen Sie das Ziel 10 % des Arbeitsabstands zurück, wenn das System so programmiert ist, dass es die gleiche Schwerpunktebene zwischen den Zielen aufrechterhält. Wenn dies ein Ölziel ist, legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Auge des Ziels.
    HINWEIS: Das Zurückziehen des Objektivs verringert die Wahrscheinlichkeit, dass das Objektiv während der Platzierung mit der Probenschale in Berührung geht.
  14. Um die Probenschale sicher an Ort und Stelle zu halten, verwenden Sie einen Wattestäbchen, um kleine Tupfer Vakuumfett um den Rand des Probenrings innerhalb der Probenstufe aufzutragen, oder verwenden Sie Probenclips. Die Probenschale vorsichtig in die Probenstufe laden.
  15. Sobald die Probe platziert ist, drehen Sie sie ein paar Mal, um eine gute Dichtung der Schale an den Probenhalter über das Fett zu gewährleisten. Erhöhen Sie das Ziel auf den Boden der Schale, bis das Öl nur über das Auge des Ziels.
  16. Mit dem Mikroskop, ohne den AFM-Kopf auf der Bühne, fokussieren Sie das Bildgebungssystem, so dass die Probe im Fokus steht. Beachten Sie diese z-Höhe als Referenz.
  17. Ersetzen Sie den AFM-Kopf vorsichtig auf die Plattform.
  18. Senken Sie mit den z Schrittmotoren die Spitze zur Probe hin ab. Wenn die AFM-Spitze abgesenkt wird, passen Sie die Nachschlagender Tabellen (LUTs) im Hellfeldbild nach Bedarf an. Senken Sie die Spitze bis fast scharf. Bewegen Sie den AFM-Kopf mit den manuell betätigten AFM-Spitzenpositionsmikrometern so, dass sich die AFM-Spitze in der Mitte oder links zentriert im Sichtfeld befindet.
    HINWEIS: Da die z Höhe des AFM bereits in Schritt 3.6 vermerkt wurde, können größere Schritte unternommen werden, um die AFM-Spitze zu senken, jedoch wurde Fett an der Unterseite der Schale und möglicherweise Öl zum Ziel hinzugefügt, so dass dieser Wert nur als Referenz dient. Es wird empfohlen, 50 – 100 m Schritte zu machen und sich bei Fokus der Spitze kleiner einzustellen.
  19. Stellen Sie die Laserposition mithilfe der manuellen Mikrometer am AFM-Kopf nach. Bei Bedarf die vertikalen und seitlichen Verformungen null, indem Sie die entsprechenden Knöpfe einstellen und den AFM-Ausleger in der Probenschale neu kalibrieren.
    HINWEIS: Wenn der Ausleger in einem anderen Medium als der Probe kalibriert wurde, muss er im Scanmedium neu kalibriert werden, um eine mögliche Änderung des Brechungsindex zu berücksichtigen. Zusätzlich kann der Laser aufgrund von Geräuschen oder Temperaturänderungen von der Rückseite des Auslegers abdriften. Justieren Sie den Laser nur umund kalibrieren Sie ihn bei Bedarf und in der Probenschale über dem Glassubstrat, wenn Sie berührungslose Kalibrierung verwenden. Wenn Sie die Kontaktkalibrierung verwenden, kalibrieren Sie das Innere der Kalibrierschale mit dem Probenmedium neu.
  20. Um hochwertige konfokale Mikroskopbilder zu erzielen, ersetzen Sie den stromdämpfenden Lichtfilter durch den Filter, der das gesamte AFM-Laserlicht blockiert. Dieser Lichtfilter sorgt für keine Interferenzen durch das helle Licht des AFM-Lasers.
  21. Mit der Befehlsschaltfläche für den automatisierten Ansatz, die in der Regel durch einen nach unten gerichteten Pfeil bezeichnet wird, senken Sie die Spitze nach unten in der Probenschale. Legen Sie die Größe/Fläche des Scans, die Auflösung, den Sollwert, die Z-Länge und die Pixelzeit (oder verwenden Sie die kalibrierten/propagierten Werte) auf dem Bildverarbeitungsbedienfeld fest und beginnen Sie mit dem Scannen.
  22. Heben Sie nach Abschluss eines Scans den AFM-Chip 50 – 100 m nach oben, bevor Sie zu einer neuen Messposition in der Probenschale navigieren. Sobald ein neuer Standort gefunden ist, nähern Sie sich dem Glas, und beginnen Sie erneut zu scannen, indem Sie die Schritte 3.21 und 3.22.
  23. Wählen Sie die Option Autospeichern aus, oder speichern Sie jede generierte Datei aus jedem einzelnen Scan manuell, indem Sie auf Speichernklicken.

4. Konfokalverfahren

  1. Öffnen Sie die konfokale Betriebssoftware. Stellen Sie sicher, dass alle zugehörigen Peripheriegeräte, Lichtquellen und Controller eingeschaltet sind und normal funktionieren.
  2. Drehen oder einfügen Sie ein Ziel mit geringer Vergrößerung (10x oder 20x), um die Probe anzuzeigen. Stellen Sie sicher, dass sich das Ziel in einem sicheren Arbeitsabstand von der Stelle befindet, an dem sich die Probenschale befindet, und bei Bedarf das Ziel, eine mögliche Kollision des Ziels mit der Probe zu vermeiden, zurück- und zurück. Mit einem Wattestäbchen, Tupfer Vakuumfett um den Rand der Probeschale Ring. Wenn Sie ein Ölobjektiv verwenden, legen Sie einen einzigen Tropfen Tauchöl auf die Vorderlinse des Objektivs
  3. Legen Sie die gewünschte Probe in die Probenstufe. Drehen Sie die Probe ein paar Mal, um sicherzustellen, dass Vakuumfett eine enge Bindung an den Probenstufeneinsatz erzeugt hat, oder verwenden Sie Probenclips. Wenn Sie ein Ölobjektiv verwenden, erhöhen Sie das Ziel auf den Boden der Schale, so dass das Öl nur über den Glasboden ableitet. Um übermäßiges Bleichen zu vermeiden, minimieren Sie die Umgebungsbeleuchtung.
  4. Mit Hellenfeld- oder Epifluoreszenzmodi über die Kamera oder Okulare, lokalisieren Sie die Probe und verwenden Sie den Fokusknopf, konzentrieren Sie sich auf einen Bereich von Interesse, der mehrere Zellen oder eine einzelne Zelle enthält. Oft ist das Sichtfeld innerhalb des optischen Mikroskops größer als das x-y-Scanfenster des AFM-Systems (100 x 100 m). Nehmen Sie die AFM-Position innerhalb des konfokalen Sichtfelds so an, dass sie das Motorbedienfeld in der AFM-Software verwenden, so dass der AFM-Scan und die konfokale Optik die gleichen Merkmale abbilden.
    HINWEIS: Innerhalb des Sichtfeldes gibt es in der Regel nur wenige Zellen, so dass es einfacher ist zu bestimmen, welche Zelle untersucht werden soll. Während AFM durchgeführt wird, wird die Zelle auf der AFM-Software sichtbar und von dort aus kann der Benutzer bestimmte Bereiche von Interesse zu untersuchen.
  5. Erfassen Sie auf Wunsch Bilder in Hellfeld- oder Epifluoreszenz mithilfe einer Kamera oder CLSM-Modi basierend auf dem Etikett der Probe, Fokusknöpfen und Aufnahmetasten auf der Mikroskopsoftware.
  6. Wählen Sie mit der Mikroskopsoftware die Option aus oder öffnen Sie das Panel, um konfokale Funktionen(z. B.Laser und nachfolgende Parameter) zu ermöglichen. Diese Option wird in der Regel durch die Wellenlängenwerte der Laserlinie festgestellt.
  7. Wählen Sie die Laserlinien aus, die für die Farbstoffe geeignet sind, die zum Färben der Proben verwendet werden. Aktivieren Sie eine oder mehrere Laserlinien, um diese Features in der Probe zu erregen und abzubilden.
  8. Legen Sie die Verstärkung auf einen Wert fest, der die Fluoreszenz der Proben optimiert, aber die Rauschmenge begrenzt. Ein typischer Startwert ist ein Gewinn von 70.
  9. Passen Sie die Laserleistung an, um gesättigte Pixel zu vermeiden, aber maximieren Sie den Dynamikbereich. Ein typischer Startbereich für die Laserleistung beträgt 1 – 3 %.
  10. Stellen Sie die Lochgröße auf 1 Airy-Einheit ein, um die Auflösung für den optischen Schnitt zu maximieren. Wenn die Probe abgeseudet ist und die Laserleistung bereits hoch ist, öffnen Sie das Loch, um das Signal auf Kosten der Verringerung der Z-Achsenauflösung zu erhöhen.
  11. Stellen Sie die Pixelverweilzeit(d. h.die Scangeschwindigkeit) ein. Beginnen Sie mit einer Verweilzeit von 2 s und passen Sie bei Bedarf an, um die Probenhelligkeit widerzuspiegeln. Wählen Sie die Pixelgröße/Scangröße für das ausgewählte Ziel aus, indem Sie das Instrument über die Nyquist-Optionsschaltfläche und die gewählte Anzahl von Pixeln im Bild berechnen lassen.
    HINWEIS: Längere Verweilzeiten in dickeren Proben können zu übermäßiger Bleichung führen, wenn Z-Stacks gesammelt werden.
  12. Wählen Sie die Option Scannen in der Software des Geräts aus, und beginnen Sie mit der Datenerfassung.
    HINWEIS: Wenn das Gerät über mehrere Laser verfügt, kann jeder unabhängig optimiert werden und läuft dann gleichzeitig für multifluoreszierende Bilder.
  13. Verwenden Sie den Fokusknopf, um das optimale Sichtfeld im Beispiel zu vergrößern und zu verkleinern.
  14. Erfassen Sie Bilder mithilfe der Capture-Taste des Systems, und speichern Sie alle erforderlichen Dateiformate des Beispiels an einem gewünschten Speicherort/Ordner auf der Festplatte des Computers oder auf einer lokalen externen Festplatte.
  15. Passen Sie weiterhin Verstärkung, Laserleistung, Lochgröße, Abtastrate und andere Werte entsprechend an, um das Bild zu optimieren. Der Pixelsättigungsindex kann aktiviert werden, um zu überprüfen, ob Pixel überlastet sind. Wenn diese Übersättigung vorhanden ist, können Verstärkung und Laserleistung angepasst werden, um gesättigte Pixel zu eliminieren. Verwenden Sie die LUTs als Leitfaden, um spezifische Anpassungen vorzunehmen.
  16. Wenn möglich, verwenden Sie die Nyquist-Abtastrate des Systems, die in der Software als Panel oder Taste angezeigt wird, um sicherzustellen, dass Bilder mit der maximal verfügbaren Auflösung gesammelt werden.
  17. Aktivieren Sie das Z-Stack- oder Bild-Volume-Sammlungstool des konfokalen Systems. Mit einer Bottom-to-Top-Option, mit nur einer Laserlinie, insbesondere der Laserlinie, die ein Feature in der Probe am deutlichsten beleuchtet, legen Sie die Start- und Zielebenen für das zu messende Volumen fest.
  18. Verwenden Sie den vorgeschlagenen Abstand zwischen ebenen im z-Stack, der berechnet wird, um die Nyquist-Sampling-Kriterien für die am besten erhältliche axiale Auflösung zu erfüllen, die vom Instrument und der verwendeten Laserlinie bereitgestellt wird.
  19. Wenn mehrere Laserlinien verwendet werden, verwenden Sie die kürzeste Wellenlänge für die Berechnung des Abstands. Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, speichern Sie die Datei im entsprechenden Ordner.
  20. Wenn eine priori Kenntnis der Dicke der Probe vorhanden ist, definieren Sie alternativ das Volumen, indem Sie die mittlere Ebene auswählen, die am hellsten und schärfsten erscheint. Legen Sie in dieser Situation die obere auf die Hälfte der Probendicke über der mittleren Ebene und die Unterseite auf die Hälfte der Dicke unterhalb der mittleren Ebene fest.
  21. Nachdem die Probenentnahme in diesem Sichtfeld abgeschlossen ist oder die Probe gebleicht hat, verwenden Sie die motorisierte oder manuell gesteuerte Stufe, um einen anderen Ort von Interesse auf der Probe zu finden, und wiederholen Sie die Schritte für die Bildsammlung.

5. Bereinigungsverfahren

  1. Stellen Sie sicher, dass alle Datendateien, sowohl aus dem CLSM als auch vom AFM, an den richtigen Speicherorten gespeichert werden.
  2. Ziehen Sie den AFM-Chip mit den z Schrittmotoren mindestens 2000 m oder den zurückgelegten Abstand zurück, um zur Probenoberfläche zu gelangen. Entfernen Sie den AFM-Kopf von der Bühne und legen Sie ihn vorsichtig an seiner Ruhestätte ab.
  3. Ziehen Sie das Mikroskopobjektiv so zurück, dass es weit von der Probe entfernt ist. Wenn ein Ölziel verwendet wurde, sollte das Ziel so weit zurückgenommen werden, dass kein Kontakt mehr zwischen dem Objektiv und dem Probensubstrat besteht.
  4. Entfernen Sie die Probe mit Handschuhen und reinigen Sie das Fett und gegebenenfalls das Öl von der Unterseite der Probenschale. Erwerben Sie eine neue, saubere, leere Petrischale und füllen Sie sie mit 70% Ethanollösung ein halbes bis drei viertel voll. Legen Sie es in den Probenhalter und ersetzen Sie den AFM-Kopf, damit der AFM-Chip die Ethanollösung für 5 min einweichen kann.
  5. Während der AFM-Chip einweicht, wird empfohlen, die Experimentierdaten auf eine externe Festplatte zu kopieren. Nach dem Eintauchen des AFM-Chips in Ethanollösung für mindestens 5 Minuten, entfernen Sie den AFM-Kopf und legen Sie ihn in seine Ruhestätte.
  6. Entfernen Sie mit Handschuhen den AFM-Chiphalter und legen Sie ihn in die Montagestation. Entfernen Sie den AFM-Chip vorsichtig mit einer Pinzette mit Gummigriffen. Platzieren Sie die verwendete Spitze wieder an der Position des Feldes, das von einer orientierten Achse stammt, um anzuzeigen, dass sie verwendet wurde. Für zukünftige Referenzen, beachten Sie, welche Spitze im Experiment verwendet wurde.
  7. Nehmen Sie die mit der Ethanollösung gefüllte Petrischale aus dem System und entsorgen Sie die Flüssigkeit und die Schale. Reinigen Sie das Öl mit Handschuhen, Linsenreiniger und Linsentüchern nach Standardprotokollen vorsichtig vom Mikroskopobjektiv. Reinigen Sie den Probenhalter, indem Sie Fett entfernen. Entsorgen Sie alle Abfallstoffe nach Biosicherheitsprotokollen und bringen Sie Werkzeuge an ihre bekannten Standorte zurück.
  8. Beenden Sie die Datensammlung vom/den Computer(n) und fahren Sie sie herunter. Schalten Sie alle Geräte, Zubehörteile, Peripheriegeräte oder andere Geräte aus, die für das Experiment verwendet werden.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Conpokal-Technik ist schematisch in Abbildung 1A dargestellt und ein Bild des Setups ist in Abbildung 1Bdargestellt. Um biologische Strukturen über konfokale Mikroskopie mit den gleichen Strukturen in AFM genau zu lokalisieren, ist die Ausrichtung der beiden Systeme während der Installation entscheidend. Wählen Sie seriöse Konfokal- und AFM-Hersteller aus, die mit den räumlichen Anforderungen des jeweils anderen vertraut sind. Darüber hinaus beruht die erfolgreiche Implementierung der Technik auf guten Färbeverfahren, immobilisierender biologischer Struktur und der entsprechenden Wahl der AFM-Spitze. Die Höhe der lebenden Zellen stellt oft eine Herausforderung für die AFM-Bildgebung dar. Ein AFM-Scan über einer lebenden HEK-Zelle ist in Abbildung 2Adargestellt. Die Höhe für diese spezielle HEK-Zelle betrug etwa 10 m, was durch den Zeilenscan in grün demonstriert wurde (Abbildung 2B). Eine AFM-Spitze mit entweder Nullversatz (Spitze befindet sich ganz am Ende des Auslegers) oder die Spitzenhöhe größer als die Zellhöhe(z.B.Spitzenhöhe ≥ 10 m) erzeugt ein hoch aufgelöstes Bild einzelner Zellen. Ein Beispiel für einen schlechten Scan aufgrund einer unsachgemäßen AFM-Tippauswahl ist in Abbildung 2Centhalten. In diesem Bild tauchten schwarze Pixel an der Spitze der Zelle auf, was darauf hinweist, dass der AFM-Piezo aufgrund einer großen Zellenhöhe a-range ist. Das Ende des AFM-Auslegers erschien im Bild (ein abgerundetes Quadrat) wegen des Spitzenversatzes in Kombination mit unzureichender Spitzenhöhe im Vergleich zur Zellhöhe. Diese Artefakte im AFM-Bild zeigen an, dass eine andere AFM-Spitze zum Abbilden der Zelle ausgewählt werden sollte.

Für diese Methode sind eine effiziente Kennzeichnung bei der Fluoreszenzfärbung zusammen mit der richtigen Sonde für die Bildgebung von Lebenden Zellen erforderlich. Wir führten ein dreifarbiges konfokales Bild in Abbildung 3A mit einem kernförmigen Fleck (Fluoreszenzblau), einem Mikrotubuli-Fleck (fluoreszierend grün) und einem lipophilen Membranfleck (fluoreszierendes Rot) durch. Diese Lebenden Zellsonden wurden aufgrund ihrer begrenzten spektralen Überlappung und ihrer Kompatibilität mit Standardfilterwürfeln ausgewählt. Wir haben auch das optische Hellfeldbild in Abbildung 3Baufgenommen.

Aus AFM ergibt die Analyse der Spitzeneinzüge zusammen mit einem nanomechanischen Modell eine Modulkarte der Oberfläche. Ein Beispiel für eine Modulkarte, die mit einer Hertz-Modellpassung und einem parabolischen Profil (Radius 8 nm) für die Spitzenform erstellt wurde, wird auf die 3D-Rekonstruktion der Zellform in Abbildung 4A (die selbe zwei Zellen in Abbildung 3)überlagert dargestellt. Die entsprechende 3D-Projektion des laserkonfokalen z-Stacks ist in Abbildung 4Bdargestellt.

Die Methode eignet sich auch für kleinere biologische Strukturen, einschließlich einzelner Bakterien, deren mikro- und nanoskopische Eigenschaften mit Der Lichtmikroskopie schwer aufzulösen sind. Eine laufende Studie nutzt die Conpokal-Technik, um mechanische Mechanismen innerhalb der Zellwand zu erforschen, die die Antibiotikaresistenz in Streptococcus mutans beeinflussen.74 Die Manipulation der Zellwandkomponenten führte zu Veränderungen in der Morphologie und Antibiotikaresistenz. Conpokal ermöglicht die Live-, In-Lösungs-Datenerfassung(z. B.Oberflächenmorphologie, elastischer Modul, Haftfestigkeit und Oberflächenrauheit) auf gleichzelligen Proben, um mechanische Eigenschaften mit dem Vorhandensein oder Fehlen von Zellwandkomponenten zu koppeln. Abbildung 5A,B enthalten einen AFM-Scan und eine gemessene Modulkarte eines Streptococcus mutans Bakteriums. Mit AFM wurde eine bessere Auflösung erreicht als mit der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie.

Abbildung 6 enthält ein konfokales Bild einer Kolonie von Enterococcus faecalis, die mit einem grünen fluoreszierenden Zellstrukturfleck befleckt ist, der an der Zellwand befestigt ist. Abbildung 5 und Abbildung 6 zeigen die Anwendbarkeit der Conpokal-Technik auf Mikroben zusätzlich zu eukaryotischen Zellen.

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Abbildung 1: Die Conpokal-Einrichtung.
(A) Schematic der Conpokal-Technik. (B) Bild des Geräteaufbaus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Atomkraftmikroskopie lebender Zellen.
(A) AFM-Bild von zwei HEK-Zellen. (B) Höhenprofil (grüne Linie in A) einer HEK-Zelle, die die Zellhöhe angibt, ist bei 10 m recht groß. (C) Schlechtes AFM-Bild einer Astrozytenzelle, bei der sich der AFM-Piezo a-range an der Spitze der Zelle befindet und es Hinweise auf eine umgekehrte Abbildung des Auslegerenendes gibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Konfokale und Hellfeldmikroskopie lebender Zellen.
(A) Laserscanning konfokale Mikroskopie von lebenden HEK-Zellen, die mit einem kerntechnischen Fleck (Fluoreszenzblau), einem Mikrotubuli-Fleck (fluoreszierend grün) und einem lipophilen Membranfleck (fluoreszierend rot) gefärbt sind. (B) Entsprechendes hellfeldoptisches Bild. Die Skalenbalken sind 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Vergleich von 3D-Renderings von AFM und konfokaler Mikroskopie lebender HEK-Zellen.
(A) Modulkarte mit einer Hertz-Modellpassung und einem parabolischen Profil (Radius 8 nm) für die Spitzenform, die auf die 3D-Rekonstruktion der Zelle von AFM überlagert wird. (B) Die entsprechende 3D-Projektion des laserkonfokalen z-Stacks mit einem kerntechnischen Fleck (fluoreszierendes Blau), einem Mikrotubuli-Fleck (fluoreszierend grün) und einem lipophilen Membranfleck (fluoreszierend rot). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 5: AFM von Bakterienproben.
(A) AFM-Scan und (B) gemessene Modulkarte eines Streptococcus mutans Bakteriums. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 6: Konfokale Mikroskopie der Bakterienprobe.
Konfokales Bild einer Kolonie von Enterococcus faecalis mit grünem fluoreszierendem Membranfleck. Die Skalenstange ist 5 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conpokal ist eine fortschrittliche, effektive Technik zum Sammeln hochwertiger Bilder und in situ mechanischer Eigenschaften lebender Biomaterialien in einer flüssigen Umgebung. Die Fähigkeit, außergewöhnliche Morphologie- und Topographiebilder in Kombination mit mechanischen Eigenschaften von Live-Proben zu sammeln, reicht an typischen Elektronen- und Lichtmikroskopietechniken vorbei. Getrennt davon bietet ein konfokales Mikroskop Hellfeld-, Epifluoreszenz- und Laserscanning-Konfokalfunktionen, um hochwertige, detaillierte fluoreszierende Bilder von Proben zu erzielen. Ein AFM bietet mechanische Charakterisierung, aber ohne Zusatzoptik wird es schwierig, die Probe zu navigieren. Mit den beiden Systemen zusammen kann ein Benutzer während des Experiments sowohl Bilder als auch mechanische Eigenschaften der exakt gleichen Zelle erfassen, was ein großer Vorteil gegenüber zwei separaten Instrumenten ist. Der Zweck dieses Manuskripts ist es, die Benutzer über die umfangreichen Fähigkeiten des kombinierten Conpokal-Systems für die Zukunft von Biologie, Ingenieurwesen und Gesundheit zu informieren und zu führen. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung von Instrumenten, Kulturmedien, Geschirr, Auswahl von Mikroorganismen, AFM-Verfahren, konfokale Verfahren und Aufräumarbeiten. Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Live-, In-Lösung-Conpokal-Sitzung sind Beispiel-Immobilisierung, vernünftige Tippauswahl und Live-Fleckenausführung. Im Diskussionsteil für dieses Manuskript werden Kulturempfehlungen, Fehlerbehebungstipps und operative Richtlinien sowie zukünftige Arbeiten für die Conpokal-Technik erläutert. Die Kulturempfehlungen werden leitliniendeckend zu Probenkultur, Immobilisierung und Färbung sein. AFM-, konfokale und Conpokal-Tipps und -Richtlinien werden die Auswahl und Kalibrierung von Tipps, die Auflösung, Einschränkungen und den nahezu gleichzeitigen Betrieb diskutieren. Zukünftige Arbeiten umfassen die Aussichten und Potenziale für zukünftige Forschungspfade.

Das Protokoll behandelt Kultur, Sondierung und Bildgebung von lebenden Zell- und festen Bakterienproben. Eine Herausforderung bei der Durchführung von AFM in flüssigen ist eine Gefahr für die Bewegung des Auslegers aufgrund von Probenhindernissen und hydrodynamischem Luftwiderstand. Wenn die Probe nicht gut auf dem Substrat haftet, besteht das Potenzial, den Ausleger durch Abschnitte der in der Flüssigkeit schwebenden Probe zu verunreinigen. In diesem Fall werden die Messungen kompromittiert, da sie eine Vermutung der elastischen Haftung und der mikromechanischen Eigenschaften der Probe sind. Die HEK-Zellen wurden jedoch nicht fixativ behandelt, jedoch erfordern S. mutans und E. faecalis eine zusätzliche Immobilisierung, ähnlich wie andere prokaryotische Zellen. Die ausgewählten Bakterien zeigten eine aktive Bewegung, die die Zelluntersuchung und -bildgebungsgebungsmittelisbildte Art behinderte, daher wurden die Proben sanft und chemisch fixiert, um die Immobilisierung zu fördern. Es gibt Alternativen zur chemischen Fixierung, wie Filtermembranen, die einzelne Zellen in Poren physikalisch einfangen75.

Die Tippauswahl ist auch eine wichtige Komponente für die Einrichtung und den Betrieb des AFM. Wenn mechanische Eigenschaften auf der Grundlage der Verformung des Biomaterials gesucht werden, muss man die Auslegersteifigkeit und Materialsteifigkeit berücksichtigen, was eine nicht triviale Aufgabe ist. Das Hauptziel ist es, die Steifigkeit des Materials am besten mit der Steifigkeit des ausgewählten Auslegers zu entsprechen. Wenn der Ausleger viel weicher ist als die Probe, wird er zu viel durchbiegt. Wenn der Ausleger steifer als die Probe ist, kann der AFM-Detektor möglicherweise nicht in der Lage sein, solche kleinen Verformungen zu erfassen. Es wird empfohlen, bei der Auswahl eines geeigneten AFM-Auslegers basierend auf experimenteller Anwendung zu wählen. Um detaillierte Bilder im intermittierenden Kontaktmodus zu sammeln, sind AFM-Spitzen im Bereich von 0,1 - 0,3 N/m für Steifigkeit und Spitzenradius innerhalb von 5 nm – 100 nm wirksam für die Live-Zell-Bildgebung. Kleine konische Spitzen werden empfohlen. Scharfe Spitzen bieten einen kleinen Kontaktbereich und die Möglichkeit, weitere Hilfe beim Sammeln kleiner Details und Funktionen in der Beispielmorphologie76zu unterstützen. Scharfe Spitzen können jedoch auch problematisch sein, da sie anfällig für Punktion-Samples sind, wenn die Einstellungen(z. B.Sollwert, Pixelzeit, Annäherungsgeschwindigkeit) zu viel Einzug erfordern oder der Einzug zu schnell ist. Um Effekte mit hoher Dehnungsrate, lokale Dehnungshärtung in der Nähe einer scharfen Spitze oder einfach nur zur Steuerung der Kontaktfläche und der Annäherungsgeschwindigkeit zu vermeiden, entscheiden sich viele für die Kraftspektroskopie mit einer kolloidalen Spitze, um einen elastischen Modul zu messen.

AFM-Spitzen im Bereich von 0,01 - 1,0 N/m für Steifigkeit und Spitzenradius innerhalb von 1 – 5 m werden empfohlen, um die elastischen Module lebender Zellen zu messen. Große Spitzengrößen, typischerweise Glaskolloide, bieten einen bekannten Kontaktbereich und sind unwahrscheinlich, dass die Zelle während des Kontakts durchbohrt wird. Rechteckige Ausleger werden gegenüber Dreiecksvorhaben bevorzugt, da während der Kalibrierung die berührungslose Methode für rechteckige Geometrie im Vergleich zur kontaktbasierten Kalibrierung für Dreiecksgeometrien verwendet werden kann. Aufgrund der feinen Natur von AFM-Spitzen wird empfohlen, dass der Bediener eine Pinzette mit Gummispitzen umsetzt, um das Beschädigungspotenzial des empfindlichen AFM-Chips oder Montageblocks zu verringern. Weitere zu beachtende Parameter sind die Anfluggeschwindigkeit der AFM-Spitze und die Einbuchtung in die Probe. Eine gute Richtlinie ist es, den Einzug auf etwa 10% der Dicke (oder Höhe) der Probe zu halten und eine Geschwindigkeit zu wählen, die einen potenziellen hydrodynamischen Widerstand des Auslegers38ausschließt.

Komplizierte experimentelle Instrumente sind in der Regel mit Straßensperren zu finden, die eine Fehlerbehebung im Setup, der Kalibrierung und dem Betrieb des Geräts erfordern. Die AFM-Spitze oder den Ausleger in das Proben- oder Probensubstrat abzustürzen, ist ein häufiger Fehler für neue Benutzer. Um dieses Problem zu vermeiden, schlägt das Protokoll vor, den Ausleger aus 2000 m zu unterstützen. Dieser Schritt stellt sicher, dass die Spitze nicht mit dem Boden der Schale in Kontakt kommt, wenn der vorherige Benutzer vergessen hat, die Spitze beim Aufräumen nach dem Experimentieren zurückzuziehen. Für den ausgewählten Schalenhalter, der in diesem Protokoll verwendet wird, wurde jedoch der Abstand von 2000 m gewählt. Je nach verwendetem Tellerhalterstil muss möglicherweise ein anderer Bereich, größer oder kleiner, ausgewählt werden. Bei der Ausrichtung des Lasers und detektors wird im Protokoll die Einstellung eines Spiegelknopfes erwähnt, um das Summensignal zu maximieren. Möglicherweise ist nicht auf allen AFMs ein Spiegelverstellknopf vorhanden. Wenn vorhanden, ist eine Möglichkeit, das Instrument zu manipulieren, um ein niedriges Summensignal zu beheben, die Einstellung des Spiegelknopfes, der verwendet wird, um das Medium zu berücksichtigen, in dem das Scannen stattfinden wird; Flüssigkeit(z. B.Wasser, Medien, PBS) oder Luft. Aufgrund des Unterschiedlichen im Brechungsindex für Licht durch Luft und durch Flüssigkeit muss der Spiegelknopf möglicherweise angepasst werden. Die maximale Biegeempfindlichkeit des AFM-Auslegers liegt an der Stelle der AFM-Spitze, daher muss sich das Laserlicht, das die Biegeposition durch seine Platzierung auf einer Photodiode zurückgibt, an der Position der AFM-Spitze befinden. Je nach gewählter AFM-Spitze kann der Summensignalwert zwischen 0,3 – 3,0 V variieren. Eine Hinterbeschichtung des AFM-Auslegers wie Cr-Au oder Al erhöht das Summensignal und die Empfindlichkeit der Messung.

Die Spitzengeometrie ist relevant, wenn die Spitzenkalibrierung während des AFM-Betriebs abgeschlossen wird. Es wurde eine gute Übereinstimmung zwischen kontaktlosem und Kontaktkalibrierung beobachtet. Wenn der gewählte AFM-Ausleger nicht rechteckig ist, muss eine Kontaktkalibrierung durchgeführt werden. Beachten Sie, dass das Medium, in dem die Spitze kalibriert ist, mit dem Probenmedium identisch sein muss. Wenn sich diese Flüssigkeiten unterscheiden, muss der Benutzer neu kalibrieren. Bei Verwendung der AFM-Spitzen in Flüssigkeit sollte die vom System gemessene Frequenz ein Viertel bis ein Drittel der vom Hersteller bezeichneten natürlichen Resonanzfrequenz betragen. Eine gute Möglichkeit, um zu überprüfen, ob das System die Spitze richtig kalibriert hat, besteht darin, die Werte innerhalb der erzeugten thermischen Rauschdatei zu überprüfen. Stellen Sie sicher, dass diese Datei im entsprechenden Ordner gespeichert wird. Wenn das System Probleme beim Kalibrieren hat oder nicht wahrscheinliche Werte herauskommen, kalibrieren oder die Laserposition leicht anpassen, dann neu kalibrieren.

Eine weitere Ursache für schlechte Summensignal kann durch AFM Ausleger Ausrichtung sein. Wenn der AFM-Chip in den Glasblock montiert ist, ist es wichtig, dass die Spitze des Auslegers innerhalb des kleinen Laserfensters (glatter Glasbereich) verbleibt. Wenn der Chip zu weit nach vorne ist, kann der Winkel, in dem der Ausleger natürlich ruht, ein Problem mit der Reflexion vom Ausleger verursachen, der Photodetektor fehlt und zu einem schlechten Summensignal führt. Wenn der Chip zu weit zurück ist, kann der Laser nicht von der Rückseite des Auslegers reflektieren, was zu einem schlechten Summensignal führt. Aus diesen Gründen muss der montierte AFM-Chip möglicherweise angepasst werden. Darüber hinaus tritt ein weiteres Problem auf, das bei der Höhe der Probe auftreten kann. Das in diesem Protokoll verwendete AFM-Instrument hat einen maximalen Piezo-Z-Bereich (Höhe) von 15 m. Wenn ein Benutzer feststellt, dass die Software nicht in der Lage ist, die Höhendaten zu erfassen und Karten in einem bestimmten Pixel zu erzwingen, wird ein schwarzes Feld angezeigt, das angibt, dass das System anicht zum Bereich ist (Abbildung 2C). Eine Möglichkeit, dieses Problem zu beheben, besteht darin, die Piezohöhe auf einen niedrigeren Wert festzulegen, z. B. 2 oder 3 m, sodass der größte Teil des 15-mm-Bereichs für die Zuordnung der erwarteten Höhe der Zelle festgelegt wird. Diese Technik sollte in den meisten zell- oder bakteriellen Experimenten das Problem im Z-Bereich beheben.

Experimentalisten, die für hohe Proben mit einer Höhe von mehr als 10 – 15 m einen erweiterten Z-Bereich benötigen, müssen möglicherweise ein zusätzliches Modul auf dem AFM verfolgen. AFM-Hersteller haben diese Option für die meisten Systeme gegen Aufpreis zur Verfügung. Durch die Erweiterung des z-Bereichs verfügt der Experimentalist über die Möglichkeit, Proben zu scannen, die im Mikromaßstab als hoch angesehen werden, mit wenig Problemen für A-Bereichswerte oder AFM-Piezomotormodifikationen. Obwohl diese Module extra kosten, können einige, je nach Hersteller, zusätzliche Höhe bieten, bis zu 100 m in z-Richtung. Konfokale Proben sind immer noch möglich, wenn der Benutzer einen langen Arbeitsabstand, ein hohes Vergrößerungsziel hat oder bereit ist, ein Luftobjektiv zu verwenden, vielleicht ein 20-faches oder 40-faches. Durch Absenken der Objektivvergrößerung des Mikroskops erhöht sich der Arbeitsabstand und gewinnt die Entfernung, um den Scheitelpunkt einer größeren Probe zu sehen. Diese Änderung an einem Ziel niedrigerer Vergrößerung wird die Auflösung opfern. In der Conpokal-Einrichtung, auf die in diesem Manuskript Bezug genommen wird, hat das 60x TIRF (total internal reflection fluorescence) Objektiv einen Arbeitsabstand von fast 100 m hinter dem Deckzettel der Glasboden-Probenschale.

In Bezug auf das in diesem Manuskript erwähnte konfokale Mikroskop werden einige wichtige Bestimmungen diskutiert. Das konfokale System, das für die Herstellung der Figuren in diesem Manuskript verwendet wurde, implementierte ein 60-faches TIRF-Ölobjektiv mit einer numerischen Öffnung von 1,49. Laserlinien mit 405 nm, 488 nm und 561 nm Anregungswellenlängen wurden für die Bildgebung von Live-Zellproben verwendet,siehe Abbildung 3 und Abbildung 4. Die Beugungsgrenze des konfokalen Mikroskops kann mit hilfe der Abbe-Auflösungsgleichung, Abbe Resolution(x,y) = s/2NA, bestimmt werden, wobei die Anregungswellenlänge für Alexa 488 bei 488 nm und NA die numerische Blende für den konfokalen Kondensator ist, der 0,3 beträgt. Daher wird eine axiale Auflösung von 272 nm bestimmt. Bei der Epifluoreszenzbildgebung werden zwei Fälle berücksichtigt, um die Auflösung zu bestimmen, in denen das Loch auf eine luftige Einheit (AU) und 0,5 AE eingestellt ist. Im letzteren Fall wird das Loch so geschlossen, dass ein erheblicher Lichtverlust auftritt, aber die Auflösung steigt. Die konfokale Software berechnet laterale native und axiale native Auflösungen bei 170 nm bzw. 290 nm für das Loch bei 0,5 AE und 200 nm bzw. 370 nm für das Loch bei 1 AE. Sphärische Aberrationen, die in das System eingeführt werden, können durch einen Dekonvolution-Prozess zur Erhöhung des Kontrasts und der Auflösung in Mikroskopbildern berücksichtigt werden. Aufgrund der Beugungsbeschränkungen, die konfokalen Mikroskopen innewohnen, fehlt dem konfokalen Bild der Bakterienkolonie in Abbildung 6 die passende Auflösung für die Details, die im AFM-Scan von Bakterien in Abbildung 5zu sehen sind. AFM bietet Zugang zu nanoskaligen Funktionen und Details, die mit einem konfokalen Mikroskop nur schwer zu erfassen sind. Je nach erforderlicher Fluoreszenzauflösung zeigen Abbildung 5 und Abbildung 6 jedoch die Anwendbarkeit der Conpokal-Technik auf Mikroben zusätzlich zu eukaryotischen Zellen.

Ein Vorteil der Verwendung eines konfokalen Mikroskops ermöglicht es dem Bediener, 3D-Bilder bestimmter Regionen in einer Probe mit geschärften Details zu sammeln. Diese Bilder korrelieren mit dem AFM, indem sie die Oberfläche betrachten, die über das AFM-Bild und einen konfokalen Scan derselben Region untersucht wurde. Da das Mikroskop invertiert ist, sammelt ein Epifluoreszenzbild Lichtinformationen von der gegenüberliegenden Seite der Probe, die untersucht wurde. Das Loch innerhalb des konfokalen Systems hilft dabei, aus einer bestimmten Entfernung auf eine einzelne Ebene zu begrenzen und gleichzeitig Licht herauszufiltern, das vom Rest der Probe oder sogar aus dem Raum kommt. Im Wesentlichen hilft das Loch, das Licht zu isolieren, das von der einzelnen Ebene des Interesses an der Probe zurückkommt. Typischerweise muss diese Interessenebene starke Fluorophormarker enthalten, da bei invertierten konfokalen Systemen die Einzelmoleküldetektion auf konfokale Mikroskope mit höherer Auflösung beschränkt wäre. Epifluoreszenzbeleuchtung ist weniger wünschenswert, da im Epifluoreszenz-Bildgebungsmodus jedes Licht aus der Probe, das in das Objektiv reflektiert wird, gesammelt und zur Erzeugung des Bildes verwendet wird, daher unmöglich ist, eine einzelne Ebene zu isolieren. Konfokale Techniken bieten ein isolierteres Einzelebenenbild des betreffenden Stichproben-Features aufgrund des Lochs77. Wenn beispielsweise der Scheitelpunkt einer eukaryotischen Zelle von AFM untersucht wird, kann dieselbe Oberfläche mit den konfokalen Laserscanning-Fähigkeiten des Mikroskops isoliert werden, anstatt mit dem Epifluoreszenz-Bildgebungsmodus. Es wird empfohlen, die Gesundheit/Form der Zellen während der Datenerfassung über Bildgebung gleichzeitig im Differentialinterferenzkontrastmodus mit Hilfe des Durchserücklichtdetektors und der 488 nm Laserlinie zu überwachen. Bei der Erfassung eines z-Stapels der Probe wird für das oben beschriebene Verfahren nur die Verstärkung des Detektors eingestellt. Jede morphologische Veränderung der Zellen während der Messung, die in den Fluoreszenzkanälen nicht unbedingt sichtbar ist, weist darauf hin, dass Artefakte in die Messung eingeführt werden.

Der ideale Abstand zwischen den Ebenen kann erreicht werden, indem man der Softwareempfehlung für die kürzeste Wellenlänge folgt, die in der Bildgebungstechnik verwendet wird. Die native Auflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis in den Bildvolumina können durch den Einsatz von Dekonvolution-Algorithmen, die im Bildverarbeitungsmodul der Erfassungssoftware zur Verfügung stehen, effektiv verbessert werden. Bei der Durchführung der fluoreszierenden Mikroskopie ist jedoch die Auswahl spezifischer Flecken und Farbstoffe von entscheidender Bedeutung, um frühzeitiges Bleichen oder Übersprechen von überlappenden Anregungs-/Emissionsspektren zu vermeiden. Gelegentlich kann es bei der konfokalen Lichterzeugung zu einer Fehlfunktion bei der konfokalen Lichterzeugung kommen. Wenn ein Benutzer einen Mangel an Lichtemission oder fehlerhafte Laserleitungen erlebt, besteht eine Möglichkeit zur Fehlerbehebung darin, das System zurückzusetzen, in der Regel durch einen Neustart der Bediensoftware. Wenn das Problem weiterhin besteht, hat sich der Durchlichtdetektor möglicherweise nicht innerhalb oder afehl am optischen Pfad des Lichtmikroskops bewegt. Das Zurücksetzen der Position des Senderdetektors kann helfen, Lichtsammlungs- oder Laserbildprobleme zu lindern.

Der Fokus des Conpokal-Instruments liegt darauf, den Anwendern die Möglichkeit zu geben, optische und kraftbasierte Informationen über lebende Biomaterialien in einer flüssigen Umgebung gleichzeitig und auf derselben Zelle oder funktionzulierung zu sammeln. Diese Arbeit beschreibt explizit, wie diese Experimente in Flüssigkeit durchgeführt werden, eine natürliche Heimat für viele Biomaterialien, obwohl trockene Experimente noch mit der Instrumentierung durchgeführt werden können. Bei Proben, die in Petrischalen zubereitet werden, ist die Tellerhöhe eine Einschränkung. Aufgrund der Konfiguration des Glassteins, der den AFM-Ausleger hält, müssen die Seitenwände des Geschirrs unter 10 mm Hochsein sein; Wenn die Schale zu hoch ist, kann das Instrument die AFM-Spitze nicht auf die Oberfläche der Probe oder des Substrats senken.

Obwohl es eine Einschränkung für die Stichprobengröße gibt, gibt es keine Beschränkung mit dem Instrument oder den Softwarefunktionen in Bezug auf eine Zeitverzögerung. Gleichzeitig konfokale und AFM ist mit den richtigen Faktoren möglich. Die Einschränkung, die zu ihrer nahezu gleichzeitigen Fähigkeit beiträgt, bezieht sich auf das Rauschen, das bei der gleichzeitigen Durchführung bestimmter konfokaler Mikroskopiefunktionen und Atomkraftmikroskopiefunktionen erzeugt wird. Die Vibrationen der Motoren, die das Mikroskopobjektiv während der Erfassung eines z-Stacks bewegen, werden während der Bewegung des Signals von der AFM-Sondenspitze hinzugefügt. Das Geräusch wird durch ein Ölobjektiv verstärkt, da sich die Motoren in z-Richtung nach oben und unten bewegen, um sequenzielle Ebenen in der Probe zu beleuchten. Daher umfasst das empfohlene Protokoll die sequenzielle Sammlung von AFM-Scans und konfokalen Z-Stack-Bildern. GleichzeitigCLSM und AFM würden stationäre Bildgebung mit dem Konfokal erfordern, aber mit der aktuellen Technik könnte die Verzögerungszeit für die beiden Instrumente so kurz wie zehn Sekunden sein. Die tatsächliche Zeit für den Wechsel vom AFM-Betrieb zur konfokalen Bildgebung betrug etwa 2 – 4 Minuten für die in Abbildung 2A und Abbildung 4Bgesammelten Bilder. Dieser Wert wurde ermittelt, indem die beiden Zeitperioden für die Bildsammlung von der Gesamtzeit von 33 Minuten subtrahiert wurden, was die Zeit zum Starten und Abschließen des AFM-Scans umfasst, die Gerätemodi wechselt, um die konfokale Bildgebung zu aktivieren, und den konfokalen Bild-z-Stack beginnen und abschließen.

Die Zukunft von Conpokal zielt darauf ab, neben einem scharfen Einblick in Einzelzellprozesse neue Struktur-Funktions-Beziehungen zu erforschen. Beispielsweise wäre das Experimentieren von in situ-Medikamentierungen an Zell- oder Bakterienproben, um die Auswirkungen der Zellelastizität zu bestimmen, ein Fortschritt in den Bereichen Biomaterialien, Biologie und Biomechanik. Eine Behandlungstherapie in der Probeschale während der Bildgebung und Probe würde Wissen darüber liefern, wie die Probe im Laufe der Zeit auf Therapeutika in einer lebendigen und sorgfältig kontrollierten Umgebung reagiert. Die Einbeziehung eines neuen Medikaments oder einer Umweltherausforderung würde das Verständnis dafür erweitern, wie sich der Standort des Zytoskeletts oder der Organelle auf Fortbewegung, Topologie, Steifigkeit usw. auswirkt. Eine weitere mögliche Weiterentwicklung von Conpokal ist die Fähigkeit, eine vollständige Umweltkontrolle des Systems zu haben. Der aktuelle Conpokal, der in diesem Protokoll erwähnt wird, ist in einem akustischen Gehäuse untergebracht, das lärmdurchdrungen im Labor untergebracht werden soll. Die Weiterentwicklung dieses Gehäuses würde die Möglichkeit bieten, innerhalb eines oder einer Kombination von Faktoren zu testen, die nicht auf solche wie eine sterile Umgebung, eine temperaturgesteuerte oder sogar variable Schwerkraft beschränkt sind. Die Conpokal-Methode bietet in ihrer jetzigen Form einen effektiven und nützlichen Ansatz zur Charakterisierung lebender, flüssiger Biomaterialien, aber die Zukunft der Technik wird diese Fähigkeiten nur weiter voranbringen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir würdigen die Finanzierung durch die NIH COBRE unter der Nummer P20GM130456. Wir danken dem britischen Zentrum für Lichtmikroskopie, der vom Vizepräsidenten für Forschung unterstützt wird, für die Unterstützung bei dieser Arbeit. Stämme von S. mutans und E. faecalis wurden von Dr. Natalia Korotkova zur Verfügung gestellt. Die erste Erwähnung der Play-on-Wörter, Conpokal, um die Kombination von konfokaler Mikroskopie und Atomkraftmikroskopie zu beschreiben, wird Dr. Brad Berron, Chemical and Materials Engineering, an der University of Kentucky, im Gespräch mit Dr. Martha Grady (korrespondierende Autorin) im Vorgriff auf die Ankunft eines Seminarsprechers Dr. Jonathan Pham zugeschrieben, der im Herbst 2017 an die Fakultät für Chemie- und Materialtechnik an der University of Kentucky kam.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Akustisches GehäuseJPK-BrukerAkustisches GehäuseKammer zur Dämpfung von Lärm
BioTracker 488 Grüner Mikrotubuli-Zytoskelett-FarbstoffMillipore SigmaSCT142Wird zur Markierung von Mikrotubuli in Säugetierzellen
verwendet CP-qp-CONT-BSG AFM-SpitzenNanoAndMoreCP-qp-CONT-BSG-BKollodiale AFM-Spitzen eignen sich gut für Modulmessungen an biologischen Proben
Dil-Fleck (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat ('DiI'; DiIC18(3)))ThermoFischerScientificD282Zur Markierung der Plasmamembran von Säugetierzellen
Dulbecco's Modified Eagle MediumVWRVWRL0100-0500Bestandteil von Zellkulturmedien
Dulbecco's Phosphatgepufferte KochsalzlösungThermoFisherScientific A1285601Zur Simulation der biologischen Umgebung
Fötales RinderserumFischer Scientific45000-736Bestandteil von Zellkulturmedien
Fisher BioReagents Mikrobiologie Medienzusätze: HefeextraktFischer ScientificBP1422-500Bestandteil von bakteriellem Kulturmedium
FluoroDish ZellkulturschaleWorld Precision Instruments (WPI)FD35-100Schalen mit Glasboden, deren Seitenwände kleiner als 10 mm sind, notwendig für die volle Funktion von Nanowizard 4a AFM
Hoechst 33342 Nukleinsäure FärbungThermoFischer Scientific62249Wird zur Markierung des Zellkerns von Säugetierzellen verwendet, ein guter Kernmarker für lebende Zellen
Menschliche embryonale Niere 293 ZellenATCC Global Bioresource CenterCRL-1573Säugetierzellen, die im Protokoll verwendet
werden MatrigelVWR47743-716Beschichtung in Zellkulturschale
Modell: PFQNM-LC-A-CAL AFM-SpitzenBrukerPFQNM-LC-A-CALAFM-Spitzen, die sich gut für Proben eignen, die eine große Höhe aufweisen (z. B. eukaryotische Zellen)
NanoWizard 4aJPK-BrukerNanoWizard 4aAFM
Nikon A1 Konfokales Laser-Scanning-MikroskopNikonA1 HD25Mikroskop für Hellfeld-, Epifluoreszenz- und konfokale Bildgebung
PENICILLIN/STREPTOMYCINVWR16777-164Bestandteil von Zellkulturmedien
PetriDishHeaterJPK-BrukerPetriDishHeaterHält die gewünschte Temperatur der Petrischale
aufrecht qp-BioAC-Cl AFM-SpitzenNanosensorenqp-BioAC-Cl-10Drei verschiedene AFM-Ausleger mit unterschiedlicher Steifigkeit
Austauschbare Pinzette mit KohlefaserspitzeTed Pella Inc.5051Wird verwendet, um empfindliche AFM-Spitzen vorsichtig in den Glasmontageblock zu platzieren und zu entfernen
Todd Hewitt Broth BactoBD DIFCO Bacterius LtdBacto-249240Bestandteil des Bakterienkulturmediums
Vancomycin, BODIPY FL KonjugatThermo Fisher ScientificV34850Wird verwendet, um bakterielle Zellwände fluoreszierend zu markieren

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Butt, H. J., Pham, J. T., Kappl, M. Forces between a stiff and a soft surface. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 27, 82-90 (2017).
  2. Pham, J. T., Schellenberger, F., Kappl, M., Butt, H. J. From elasticity to capillarity in soft materials indentation. Physical Review Materials. 1 (1), 015602(2017).
  3. Lee, G. Y. H., Lim, C. T. Biomechanics approaches to studying human diseases. Trends Biotechnology. 25 (3), 111-118 (2007).
  4. Qiu, H., et al. Short Communication: Vascular Smooth Muscle Cell Stiffness As a Mechanism for Increased Aortic Stiffness With Aging. Circulation Research. 107 (5), 615-619 (2010).
  5. Glenister, F. K., Coppel, R. L., Cowman, A. F., Mohandas, N., Cooke, B. M. Contribution of parasite proteins to altered mechanical properties of malaria-infected red blood cells. Blood. 99 (3), 1060-1063 (2002).
  6. Suresh, S., et al. Connections between single-cell biomechanics and human disease states: gastrointestinal cancer and malaria. Acta Biomaterialia. 1 (1), 15-30 (2005).
  7. Nash, G. B., Johnson, C. S., Meiselman, H. J. Mechanical properties of oxygenated red blood cells in sickle cell (HbSS) disease. Blood. 63 (1), 73-82 (1984).
  8. Trickey, W. R., Lee, G. M., Guilak, F. Viscoelastic properties of chondrocytes from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Orthopedic Research. 18 (6), 891-898 (2000).
  9. An, S. S., Fabry, B., Trepat, X., Wang, N., Fredberg, J. J. Do Biophysical Properties of the Airway Smooth Muscle in Culture Predict Airway Hyperresponsiveness. American Journal of Respiratory Cell and Molecuar Biology. 35 (1), 55-64 (2006).
  10. Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Materialia. 55 (12), 3989-4014 (2007).
  11. Rebelo, L. M., de Sousa, J. S., Mendes, J., Radmacher, M. Comparison of the viscoelastic properties of cells from different kidney cancer phenotypes measured with atomic force microscopy. Nanotechnology. 24 (5), 055102(2013).
  12. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).
  13. Remmerbach, T. W., et al. Oral Cancer Diagnosis by Mechanical Phenotyping. Cancer Research. 69 (5), 1728-1732 (2009).
  14. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  15. Yallapu, M. M., et al. The Roles of Cellular Nanomechanics in Cancer. Medical Research Reviews. 35 (1), 198-223 (2015).
  16. Fabry, B., et al. Scaling the Microrheology of Living Cells. Physical Review Letters. 87 (14), 148102(2001).
  17. Ingber, D. E., Prusty, D., Sun, Z., Betensky, H., Wang, N. Cell shape, cytoskeletal mechanics, and cell cycle control in angiogenesis. Jouranl of Biomechica. 28 (12), 1471-1484 (1995).
  18. Svoboda, K., Block, S. M. Biological Applications of Optical Forces. Annual Reviews of Biophysics and Biomolecular Structures. 23 (1), 247-285 (1994).
  19. Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Mechanics of the human red blood cell deformed by optical tweezers. Journal of the Mechicanics and Physics of Solids. 51 (11-12), 2259-2280 (2003).
  20. Thoumine, O., Cardoso, O., Meister, J. J. Changes in the mechanical properties of fibroblasts during spreading: a micromanipulation study. European Biophys with Biophyics Letters. 28 (3), 222-234 (1999).
  21. Reynolds, N. H., et al. On the role of the actin cytoskeleton and nucleus in the biomechanical response of spread cells. Biomaterials. 35 (13), 4015-4025 (2014).
  22. Jones, W. R., et al. Alterations in the Young’s modulus and volumetric properties of chondrocytes isolated from normal and osteoarthritic human cartilage. Journal of Biomechics. 32 (2), 119-127 (1999).
  23. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysics Journals. 70 (1), 556-567 (1996).
  24. Ketene, A. N., Roberts, P. C., Shea, A. A., Schmelz, E. M., Agah, M. Actin filaments play a primary role for structural integrity and viscoelastic response in cells. Integrative Biology. 4 (5), 540-549 (2012).
  25. Ketene, A. N., Schmelz, E. M., Roberts, P. C., Agah, M. The effects of cancer progression on the viscoelasticity of ovarian cell cytoskeleton structures. Nanomedicine-Nanotechnology. 8 (1), 93-102 (2012).
  26. Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechics. 41 (2), 454-464 (2008).
  27. Henderson, E., Haydon, P., Sakaguchi, D. Actin filament dynamics in living glial cells imaged by atomic force microscopy. Science. 257 (5078), 1944-1946 (1992).
  28. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-Induced Changes of Cytoskeletal Structure and Mechanics in Fibroblasts: An Atomic Force Microscopy Study. Biophysics Jouranl. 78 (1), 520-535 (2000).
  29. Darling, E. M., Zauscher, S., Guilak, F. Viscoelastic properties of zonal articular chondrocytes measured by atomic force microscopy. Osteoarthritis Cartilage. 14 (6), 571-579 (2006).
  30. Lekka, M., et al. Local elastic properties of cells studied by SFM. Applied Surface Science. 141 (3-4), 345-349 (1999).
  31. Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. AFM indentation study of breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communication. 374 (4), 609-613 (2008).
  32. Rother, J., Noding, H., Mey, I., Janshoff, A. Atomic force microscopy-based microrheology reveals significant differences in the viscoelastic response between malign and benign cell lines. Open Biology. 4 (5), 140046(2014).
  33. Nalam, P. C., Gosvami, N. N., Caporizzo, M. A., Composto, R. J., Carpick, R. W. Nano-rheology of hydrogels using direct drive force modulation atomic force microscopy. Soft Matter. 11 (41), 8165-8178 (2015).
  34. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 6 (12), 809(2011).
  35. Caporizzo, M. A., et al. Strain-rate dependence of elastic modulus reveals silver nanoparticle induced cytotoxicity. Nanobiomedicine. 2, 9(2015).
  36. Corbin, E. A., Kong, F., Lim, C. T., King, W. P., Bashir, R. Biophysical Properties of Human Breast Cancer Cells Measured Using Silicon MEMS Resonators and Atomic Force Microscopy. Lab Chip. 15 (3), 839-847 (2014).
  37. Moreno-Flores, S., Benitez, R., Vivanco, M. D., Toca-Herrera, J. L. Stress relaxation and creep on living cells with the atomic force microscope: a means to calculate elastic moduli and viscosities of cell components. Nanotechnology. 21 (44), 445101(2010).
  38. Grady, M. E., Composto, R. J., Eckmann, D. M. Cell elasticity with altered cytoskeletal architectures across multiple cell types. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 61, 197-207 (2016).
  39. Park, S., Koch, D., Cardenas, R., Kas, J., Shih, C. K. Cell motility and local viscoelasticity of fibroblasts. Biophysical Journal. 89 (6), 4330-4342 (2005).
  40. Ribeiro, A. S., Khanna, P., Sukumar, A., Dong, C., Dahl, K. Nuclear Stiffening Inhibits Migration of Invasive Melanoma Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (4), 1-8 (2014).
  41. Buda, A., Pignatelli, M. Cytoskeletal network in colon cancer: from genes to clinical application. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36 (5), 759-765 (2004).
  42. Lindberg, U., Karlsson, R., Lassing, I., Schutt, C. E., Höglund, A. S. The microfilament system and malignancy. Seminars in Cancer Biology. 18 (1), 2-11 (2008).
  43. Altemeier, W. A., Sinclair, S. E. Hyperoxia in the intensive care unit: why more is not always better. Current Opinion in Critical Care. 13 (1), 73-78 (2007).
  44. Roan, E., Waters, C. M., Teng, B., Ghosh, M., Schwingshackl, A. The 2-pore domain potassium channel TREK-1 regulates stretch-induced detachment of alveolar epithelial cells. PLoS One. 9 (2), 89429(2014).
  45. Roan, E., et al. Hyperoxia alters the mechanical properties of alveolar epithelial cells. American Journal of Physiology. 302 (12), 1235-1241 (2012).
  46. Wilhelm, K. R., Roan, E., Ghosh, M. C., Parthasarathi, K., Waters, C. M. Hyperoxia increases the elastic modulus of alveolar epithelial cells through Rho kinase. The FEBS Journal. 281 (3), 957-969 (2013).
  47. Roan, E., Wilhelm, K. R., Waters, C. M. Kymographic Imaging of the Elastic Modulus of Epithelial Cells during the Onset of Migration. Biophysical Journal. 109 (10), 2051-2057 (2015).
  48. Wagh, A. A., et al. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. American Journal of Physiology. 295 (1), 54-60 (2008).
  49. Liu, S., Wang, Y. Application of AFM in microbiology: a review. Scanning. 32 (2), 61-73 (2010).
  50. Hayhurst, E. J., Kailas, L., Hobbs, J. K., Foster, S. J. Cell wall peptidoglycan architecture in Bacillus subtilis. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 105 (38), 14603-14608 (2008).
  51. Dover, R. S., Bitler, A., Shimoni, E., Trieu-Cuot, P., Shai, Y. Multiparametric AFM reveals turgor-responsive net-like peptidoglycan architecture in live streptococci. Nature Communications. 6 (1), 1-10 (2015).
  52. Gillis, A., Dupres, V., Delestrait, G., Mahillon, J., Dufrêne, Y. F. Nanoscale imaging of Bacillus thuringiensis flagella using atomic force microscopy. Nanoscale. 4 (5), 1585-1591 (2012).
  53. Laurent, V. M., et al. Gradient of rigidity in the lamellipodia of migrating cells revealed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 89 (1), 667-675 (2005).
  54. Collart-Dutilleul, P. Y., et al. Initial stem cell adhesion on porous silicon surface: molecular architecture of actin cytoskeleton and filopodial growth. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 564(2014).
  55. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  56. Ilie, M. A., et al. Current and future applications of confocal laser scanning microscopy imaging in skin oncology. Oncology Letters. 17 (5), 4102-4111 (2019).
  57. Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-a comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (2), 54(2015).
  58. Minsky, M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope. Scanning. 10 (4), 128-138 (1988).
  59. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), 643-648 (2008).
  60. Amos, W., White, J. How the confocal laser scanning microscope entered biological research. Biology of the Cell. 95 (6), 335-342 (2003).
  61. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  62. Wolleschensky, R., Zimmermann, B., Kempe, M. High-speed confocal fluorescence imaging with a novel line scanning microscope. Journal of Biomedical Optics. 11 (6), 064011(2006).
  63. Brakenhoff, G., Van der Voort, H., Van Spronsen, E., Nanninga, N. Three-dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy. Journal of Microscopy. 153 (2), 151-159 (1989).
  64. Jerome, W. G., Price, R. L. Basic Confocal Microscopy. , Springer. (2018).
  65. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427(1996).
  66. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , Springer. 236(2010).
  67. Webb, D. J., Brown, C. M. Epi-fluorescence microscopy. Cell Imaging Techniques. , 29-59 (2012).
  68. Day, R. N., Davidson, M. W., Press, C. The fluorescent protein revolution. , Elseiver. (2014).
  69. Fine, A., Amos, W., Durbin, R., McNaughton, P. Confocal microscopy: applications in neurobiology. Trends in Neurosciences. 11 (8), 346-351 (1988).
  70. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  71. Pan, Y. A., Livet, J., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Schier, A. F. Multicolor Brainbow imaging in zebrafish. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (1), 5546(2011).
  72. Fu, X., et al. Brain Region Specific Single-Molecule Fluorescence Imaging. Anals in Chemistry. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  73. Snell, A. A., et al. Cell-Derived Vesicles for in Vitro and in Vivo Targeted Therapeutic Delivery. ACS Omega. 4 (7), 12657-12664 (2019).
  74. Edgar, R. J., et al. Discovery of glycerol phosphate modification on streptococcal rhamnose polysaccharides. Nature Chemical Biology. 15 (5), 463-471 (2019).
  75. Kailas, L., et al. Immobilizing live bacteria for AFM imaging of cellular processes. Ultramicroscopy. 109 (7), 775-780 (2009).
  76. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  77. Wilson, T. The role of the pinhole in confocal imaging system. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 167-182 (1995).

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