Gewinnung menschlicher Mikroglia aus erwachsenem menschlichem Hirngewebe

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ist eine effiziente, kostengünstige und robuste Methode zur Isolierung primärer Mikroglia aus lebendem, erwachsenem, menschlichem Hirngewebe. Isolierte primäre menschliche Mikroglia kann als Werkzeug für die Untersuchung zellulärer Prozesse bei Homöostase und Krankheit dienen.

Zusammenfassung

Mikroglia sind ansässige angeborene Immunzellen des Zentralnervensystems (ZNS). Mikroglia spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung, bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und bei Infektionen oder Verletzungen. Mehrere unabhängige Forschungsgruppen haben die zentrale Rolle hervorgehoben, die Mikroglia bei Autoimmunerkrankungen, autoinflammatorischen Syndromen und Krebserkrankungen spielt. Die Aktivierung von Mikroglia bei einigen neurologischen Erkrankungen kann direkt an pathogenen Prozessen beteiligt sein. Primäre Mikroglia sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Immunantworten im Gehirn, Zell-Zell-Wechselwirkungen und dysregulierte Mikroglia-Phänotypen bei Krankheiten zu verstehen. Primäre Mikroglia imitieren in vivo mikroglia-Eigenschaften besser als verewigte mikrogliarische Zelllinien. Menschliche Erwachsene Mikroglia weisen unterschiedliche Eigenschaften im Vergleich zu menschlichen fetalen und Nagetier Mikroglia. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Methode zur Isolierung von primären Mikroglia aus erwachsenen menschlichen Gehirn. Das Studium dieser Mikroglia kann kritische Einblicke in Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Mikroglia und anderen ansässigen Zellpopulationen im ZNS liefern, einschließlich Oligodendrozyten, Neuronen und Astrozyten. Darüber hinaus können Mikroglia aus verschiedenen menschlichen Gehirnen für die Charakterisierung einzigartiger Immunantworten für personalisierte Medizin und eine Vielzahl von therapeutischen Anwendungen kultiviert werden.

Einleitung

Das Zentralnervensystem (ZNS) besteht aus einem komplexen Netzwerk von Neuronen und Gliazellen¹. Unter den Gliazellen fungieren Mikroglia als angeborene Immunzellen der ZNS^2,3. Microglia sind verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase im gesunden ZNS⁴. Mikroglia spielen auch eine wichtige Rolle in der Neuroentwicklung, durch den Schnitt von Synapsen². Mikroglia sind zentral für die Pathophysiologie mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf; Alzheimer-Krankheit⁵, Parkinson-Krankheit⁶, Schlaganfall⁷, Multiple Sklerose⁸, traumatische Hirnverletzung⁹, neuropathische Schmerzen¹⁰, Rückenmarksverletzung¹¹ und Hirntumoren wie Gliome¹².

Studien im Zusammenhang mit ZNS-Homöostase und Krankheiten nutzen Nagetier-Mikroglia aufgrund eines Mangels an kosteneffizienten und zeiteffizienten menschlichen primären Mikroglia-Isolationsprotokollen¹³. Nagetier-Mikroglia ähneln primären menschlichen Mikroglia in Der Expression von Genen wie Iba-1, PU.1, DAP12 und M-CSF-Rezeptor und haben wirksam beim Verständnis normaler sowie kranker Gehirn¹³. Interessanterweise variiert die Expression mehrerer immunbezogener Gene wie TLR4, MHC II, Siglec-11 und Siglec-3 zwischen menschlicher und Nagetier-Mikroglia¹³. Die Expression mehrerer Gene variiert auch in der zeitlichen Expression und bei neurodegenerativen Erkrankungen bei beiden Arten^14,15. Diese signifikanten Unterschiede machen menschliche Mikroglia zu einem wesentlichen Modell, um die Mikrogliafunktion bei Homöostase und Krankheit zu untersuchen. Primäre menschliche Mikroglia kann auch ein wirksames Werkzeug für das präklinische Screening von potenziellen Wirkstoffkandidaten¹⁶sein. Die oben genannten Gründe unterstreichen den wachsenden Bedarf an kostengünstigen Protokollen zur Isolierung primärer menschlicher Mikroglia.

Wir haben ein Protokoll zur Isolierung von primären menschlichen Mikroglia aus erwachsenen menschlichen Hirngewebe als Ergebnis der chirurgischen Fenster für Tumorresektionen oder andere chirurgische Resektionen erstellt entwickelt. Die Methode unterscheidet sich hier erheblich von den bestehenden Methoden. Wir waren in der Lage, Mikroglia nach einer Transitzeit von etwa 75 Minuten von der Gewebesammelstelle bis zum Start des Isolationsprotokolls im Labor zu isolieren und zu kultiieren. Wir haben den Überstand von L929-Fibroblastenzellen verwendet, um das Wachstum isolierter Mikroglia zu fördern. Diese Methode konzentriert sich speziell auf die Kultur und Entwicklung von nur primären Mikroglia. Die resultierende Kultur vorbereitet ist etwa 80% Mikroglia. Während andere Protokolle eine angereicherte Kultur der Mikroglia durch Dichtegradientzentrifugation, Durchflusszytometrie und magnetische Perlen bieten, ist das Protokoll eine schnelle, einfache, robuste und kostengünstige Möglichkeit, primäre menschliche Mikroglia^17,18,19,20zu kulturieren. Die Fähigkeit, chirurgisch entferntes lebendes erwachsenes Hirngewebe anstelle von festem Hirngewebe von Kadavern zu nutzen, erweist sich als zusätzlicher Vorteil dieser Methode im Gegensatz zu bestehenden Verfahren^18,21.

Protokoll

Alle Gewebe wurden nach ethischer Freigabe von den Ethikkommissionen des Indian Institute of Technology Jodhpur und all India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur erworben.

1.Gewebeerwerb und -verarbeitung (Tag 0)

1. Sammeln Sie das Gewebe in einem 50 ml Rohr mit 10 ml eiskalte künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) (2 mM CaCl₂2 H₂O, 10 mM Glukose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,5 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgCl₂-H₂O, 202 mM Saccharose)²⁰. Stellen Sie sicher, dass die Röhre auf Eis gehalten wird, wenn das Gewebe an einen anderen Ort übertragen werden muss.
   HINWEIS: Bereiten Sie aCSF in autoktoriertem destilliertem Wasser vor. Filtern Sie ihn mit 0,22 m Spritzenfilter in der laminaren Haube. Diese kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
2. Wischen Sie das Sammelrohr sorgfältig mit 70% Alkohol ab und übertragen Sie es in eine aseptische laminare Luftstromkammer.
3. Entsorgen Sie aCSF sorgfältig und wiegen Sie Gewebe in einem aseptischen Zustand. Gewebegewicht ist wichtig, um das Volumen von Trypsin-EDTA für nachfolgende Schritte benötigt zu berechnen.
4. Halten Sie das Gewebe in frischer Wärme aCSF bei 37 °C für 5 Minuten. Dieser Schritt ist entscheidend, um den Zelltod zu vermeiden.
5. ACSF entsorgen und Gewebe einmal mit 1x PBS (Phosphat gepufferte Saline) bei 37 °C waschen. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Blut mit wiederholten PBS-Waschungen (bei Bedarf) weggespült wird.
6. Inkubieren Sie das Gewebe in warmem PBS, bei 37 °C, für 5 min.
7. Entsorgen Sie PBS sorgfältig und übertragen Sie Gewebe in eine sterilisierte Petrischale. PBS kann mit einer Pipette entfernt werden. Dies wird jeden Verlust von Gewebe zu verhindern.
8. Das Gewebe mit einem sterilen Skalpell in kleine (mindestens 1 mm³⁾Stücke schneiden. Fein gewürfeltes Gewebe bietet eine höhere Gewebeoberfläche für die Gewebedissoziation durch Trypsin-EDTA, um eine höhere Ausbeute zu gewährleisten.
9. Übertragen Sie das gewürfelte Gewebe in ein 50 ml-Rohr mit 10 ml/g Gewebe von 0,25% Trypsin-EDTA und mischen Sie es durch Pipettieren durch eine 10 ml serologische Pipette. Fügen Sie 2 ml Trypsin/EDTA in eine Petrischale und waschen Sie den Teller gründlich mit Hilfe von Pipette. Fügen Sie dieses Trypsin wieder in das Falkenrohr. Dies minimiert den Verlust von Gewebe und Zellen beim Dicing.
10. Inkubieren Sie das Rohr 30 Minuten lang bei 37 °C bei 250 U/min. Dieser Schritt erhöht die Trennung von Zellen vom Gewebe.
11. Am Ende der Inkubation 10 ml neutralisierendes Medium (50% DMEM/50% F12 mit Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 10% FBS) hinzufügen, um Trypsin zu neutralisieren. Mit einer 10 ml serologischen Pipette mischen. Die Menge der hinzugefügten neutralisierenden Medien sollte der Menge an Trypsin entsprechen.
12. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 2.000 x g bei 4 °C für 10 Minuten.
13. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml Kulturmedium wieder auf (50% DMEM/50% F12 mit Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 20% L929 Überstand, 10% FBS).
    HINWEIS: L929-Zellen sind Kultur in DMEM (DMEM mit Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 10% FBS). Die empfohlene ATCC-Kulturmethode sollte für die Zellkultur befolgt werden. Überstand muss aus dem Kulturkolben gesammelt werden, der mindestens 75% konfluent ist. Es kann in loser Schüttung gesammelt und bei -80 °C gelagert werden, um eine Verschlechterung der Wachstumsfaktoren zu verhindern. Es wird empfohlen, L929 Überstand separat in Kolben hinzuzufügen, anstatt das Stoffkulturmedium hinzuzufügen.
14. Die Zellen in einem T-25-Kolben, geeignet für anhaftende Zellen, plattieren und 4 ml zusätzliches Kulturmedium hinzufügen. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 °C mit 5%_CO2. Schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um das Gewebe homogen zu zerstreuen. Vermeiden Sie es, die Medien an den Hals des Kolbens zu bringen, während Sie schütteln, da dies die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination erhöhen kann.

2.Zellkultur (Tag 2)

1. Sammeln Sie die Medien aus dem T-25 Kulturkolben, der am Tag 0 in drei 1,5 ml Zentrifugenröhren hergestellt wurde, indem Sie in jedem Rohr gleiche Medienmengen sammeln. Waschen Sie den Kolben einmal mit 1 x PBS. Schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um alle restlichen Gewebefragmente zu entfernen. Vermeiden Sie ein hartes Schütteln des Kolbens, da Restfragmente die Kultur nicht beeinträchtigen. Fügen Sie dem Kolben 5 ml frische Kulturmedien hinzu.
2. Zentrifugieren Sie die gesammelten Medien bei 1.466 x g (4000 U/min) bei 4 °C für 4 Minuten.
3. Entsorgen Sie den Überstand aus jedem Rohr und fügen Sie 1 ml Kulturmedium zu einem der Rohre hinzu. Mit Pipette gründlich mischen. Fügen Sie das Mischmedium mit Zellen seriell zu anderen Röhren hinzu. Mit Pipette gründlich mischen und die Zellen in einem Rohr bündeln.
4. Die Zellen in einem separaten T-25-Kolben, geeignet für anhaftende Zellen, verplatten. 4 ml Kulturmedium hinzufügen und den Kolben bei 37 °C mit 5%_CO2bebrüten.

3.Zellkultur (Tag 4)

1. Entsorgen Sie die Medien aus beiden Kolben und fügen Sie dem Kolben frische 5 ml Kulturmedien hinzu.
2. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 °C mit 5%_CO2 für 2 Tage.

4. Zellkultur (Tag 6)

1. Die Zellen werden für weitere Experimente bereit sein.

Ergebnisse

Durch die Verwendung des oben genannten Protokolls (Abbildung 1) konnten wir primäre menschliche Mikroglia aus lebendem chirurgisch resektiertem Hirngewebe isolieren. Kultivierte Zellen wurden mit Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) Lektin für Mikroglia (grün) und mit Glial fibrilläres saures Protein (GFAP) für Astrozyten (rot)(Abbildung 2) gefärbt, wie zuvor beschrieben^22,

Diskussion

Mikroglia sorgen für Homöostase im normalen Gehirn und spielen eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie verschiedener neurologischer Erkrankungen⁴. Mikroglia sind zentral für die Neuroentwicklung und Bildung von Synapsen². Mikroglia-Studien haben sich als entscheidend für das Verständnis der Entwicklung und des Fortschreitens verschiedener neurologischer Erkrankungen erwiesen⁴. Nagetier-Mikroglia sind das vorherrschende Modell der Wahl für primäre...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antibiotisch-antimykotische Lösung	Himedia	A002
Calciumchlorid	Sigma	223506
Zentrifuge (4 ° C)	Sigma	146532
Zentrifugenröhrchen	Abdos	P10203
CO2 Inkubator	New Brunswik	Galaxy 170 S
D-Glucose	Himedia	GRM077
DMEM Medium mit Glutamin	Himedia	AL007S
Fötales Rinderserum	Himedia	RM9955
Flakon-Tube (50 ml)	Thermo Fsiher Scientific	50CD1058
Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1	Vector	FL-1081
Fluoreszenzmikroskop	Leica	DM2000LED
Fluoroshield mit DAPI	Sigma	F6057
GFAP Antikörper	GA5	3670S
Inkubator Shaker	New Brunswik Scientific	Innova 42
L929 Zelllinie	ATCC	NCTC Klon 929 [L-Zelle, L-929, Derivat von Stamm L] (ATCC  CCL-1)
Laminare Luftströmung	Thermo Fsiher Scient	1386
Magnesiumchlorid	Himedia	MB040
Mononatriumphosphat	Merck	567545
Nährstoffmischung F-12 Schinken Medium	Himedia	Al106S
Petrischale	Duran Group	237554805
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung	Himedia	ML023
Kaliumchlorid	Himedia	MB043
Serologische Pipette	Laborbedarf	LW-SP1010
Natriumbicarbonat	Himedia	MB045
Saccharose	Himedia	MB025
Spritzenfilter (0,2 μm, Durchmesser 25 mm)	Axiva	SFPV25R
T-25 Gewebekulturflaschen, geeignet für adhärente Zellkulturen.	Himedia	TCG4-20X10NO
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	Artikel-Nr.: 25200-056