Dieses Protokoll ist eine effiziente, kostengünstige und robuste Methode zur Isolierung primärer Mikroglia aus lebendem, erwachsenem, menschlichem Hirngewebe. Isolierte primäre menschliche Mikroglia kann als Werkzeug für die Untersuchung zellulärer Prozesse bei Homöostase und Krankheit dienen.
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Methodenartikel
Gewinnung menschlicher Mikroglia aus erwachsenem menschlichem Hirngewebe
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mikroglia sind ansässige angeborene Immunzellen des Zentralnervensystems (ZNS). Mikroglia spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung, bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und bei Infektionen oder Verletzungen. Mehrere unabhängige Forschungsgruppen haben die zentrale Rolle hervorgehoben, die Mikroglia bei Autoimmunerkrankungen, autoinflammatorischen Syndromen und Krebserkrankungen spielt. Die Aktivierung von Mikroglia bei einigen neurologischen Erkrankungen kann direkt an pathogenen Prozessen beteiligt sein. Primäre Mikroglia sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Immunantworten im Gehirn, Zell-Zell-Wechselwirkungen und dysregulierte Mikroglia-Phänotypen bei Krankheiten zu verstehen. Primäre Mikroglia imitieren in vivo mikroglia-Eigenschaften besser als verewigte mikrogliarische Zelllinien. Menschliche Erwachsene Mikroglia weisen unterschiedliche Eigenschaften im Vergleich zu menschlichen fetalen und Nagetier Mikroglia. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Methode zur Isolierung von primären Mikroglia aus erwachsenen menschlichen Gehirn. Das Studium dieser Mikroglia kann kritische Einblicke in Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Mikroglia und anderen ansässigen Zellpopulationen im ZNS liefern, einschließlich Oligodendrozyten, Neuronen und Astrozyten. Darüber hinaus können Mikroglia aus verschiedenen menschlichen Gehirnen für die Charakterisierung einzigartiger Immunantworten für personalisierte Medizin und eine Vielzahl von therapeutischen Anwendungen kultiviert werden.
Einleitung
Das Zentralnervensystem (ZNS) besteht aus einem komplexen Netzwerk von Neuronen und Gliazellen1. Unter den Gliazellen fungieren Mikroglia als angeborene Immunzellen der ZNS2,3. Microglia sind verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase im gesunden ZNS4. Mikroglia spielen auch eine wichtige Rolle in der Neuroentwicklung, durch den Schnitt von Synapsen2. Mikroglia sind zentral für die Pathophysiologie mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf; Alzheimer-Krankheit5, Par....
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Protokoll
Alle Gewebe wurden nach ethischer Freigabe von den Ethikkommissionen des Indian Institute of Technology Jodhpur und all India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur erworben.
1.Gewebeerwerb und -verarbeitung (Tag 0)
- Sammeln Sie das Gewebe in einem 50 ml Rohr mit 10 ml eiskalte künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) (2 mM CaCl22 H2O, 10 mM Glukose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2-H2O, 202 mM Saccharose)20. Stellen Sie sicher, dass die Röhre auf Eis gehalten wird, wenn das Gewebe an einen anderen Ort übe....
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Ergebnisse
Durch die Verwendung des oben genannten Protokolls (Abbildung 1) konnten wir primäre menschliche Mikroglia aus lebendem chirurgisch resektiertem Hirngewebe isolieren. Kultivierte Zellen wurden mit Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) Lektin für Mikroglia (grün) und mit Glial fibrilläres saures Protein (GFAP) für Astrozyten (rot)(Abbildung 2) gefärbt, wie zuvor beschrieben22,
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Diskussion
Mikroglia sorgen für Homöostase im normalen Gehirn und spielen eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie verschiedener neurologischer Erkrankungen4. Mikroglia sind zentral für die Neuroentwicklung und Bildung von Synapsen2. Mikroglia-Studien haben sich als entscheidend für das Verständnis der Entwicklung und des Fortschreitens verschiedener neurologischer Erkrankungen erwiesen4. Nagetier-Mikroglia sind das vorherrschende Modell der Wahl für primäre.......
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Offenlegungen
Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Das Labor des SJ wurde mit institutionellen Zuschüssen des IITJ eingerichtet und wird durch Zuschüsse der Abteilung Biotechnologie (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) und des Ministeriums für Elektronik und Informationstechnologie der indischen Regierung (Nr. 4(16)/2019-ITEA) finanziert. Die menschlichen Hirngewebeabschnitte wurden vom All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur nach der Freigabe der institutionellen Ethikkommission bezogen. Wir danken Mayank Rathor, B.Tech Student Mitglied der Design and Arts Society IIT Jodhpur, für die Videofilmunterstützung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Antibiotisch-antimykotische Lösung | Himedia | A002 | |
| Calciumchlorid | Sigma | 223506 | |
| Zentrifuge (4 ° C) | Sigma | 146532 | |
| Zentrifugenröhrchen | Abdos | P10203 | |
| CO2 Inkubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM Medium mit Glutamin | Himedia | AL007S | |
| Fötales Rinderserum | Himedia | RM9955 | |
| Flakon-Tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield mit DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP Antikörper | GA5 | 3670S | |
| Inkubator Shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 Zelllinie | ATCC | NCTC Klon 929 [L-Zelle, L-929, Derivat von Stamm L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminare Luftströmung | Thermo Fsiher Scient | 1386 | |
| Magnesiumchlorid | Himedia | MB040 | |
| Mononatriumphosphat | Merck | 567545 | |
| Nährstoffmischung F-12 Schinken Medium | Himedia | Al106S | |
| Petrischale | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphat gepufferte Kochsalzlösung | Himedia | ML023 | |
| Kaliumchlorid | Himedia | MB043 | |
| Serologische Pipette | Laborbedarf | LW-SP1010 | |
| Natriumbicarbonat | Himedia | MB045 | |
| Saccharose | Himedia | MB025 | |
| Spritzenfilter (0,2 μm, Durchmesser 25 mm) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 Gewebekulturflaschen, geeignet für adhärente Zellkulturen. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | Artikel-Nr.: 25200-056 |
Referenzen
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9
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Nachdrucke und Genehmigungen
