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Neuroscience

प्राथमिक माउस मिडब्रेन न्यूरॉन्स में सहज Ca2 + फ्लक्स और उनके डाउनस्ट्रीम प्रभावों की मात्रा निर्धारित करना

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61481
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Texas A&M University Health Science Center, College of Medicine, 2Texas A&M Institute for Neuroscience

Summary

यहां हम मिडब्रेन न्यूरॉन्स में इन विट्रो Ca2 + फ्लक्स को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और प्राथमिक माउस मिडब्रेन संस्कृतियों का उपयोग करके कैस्पास-3 पर उनके डाउनस्ट्रीम प्रभाव। इस मॉडल को मिडब्रेन न्यूरॉन्स में असामान्य सीए2 + गतिविधि से संबंधित रोगोफिजियोलॉजिक परिवर्तनों का अध्ययन करने और एंटी-एपोटोटिक गुणों के लिए उपन्यास चिकित्सीय को स्क्रीन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

Abstract

पार्किंसंस रोग (पीडी) डोपामिनेर्गिक (डीए) न्यूरॉन्स के पतन के कारण एक विनाशकारी न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार है। ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की असामान्य सक्रियता के कारण अत्यधिक सीए2 + आमद डीए एक्सेक्टॉक्सिकिटी में परिणाम है और डीए न्यूरॉन हानि के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र के रूप में पहचान की गई है। इस अध्ययन में, हम ED14 माउस भ्रूण के माउस वेंट्रल मेसेंसेफेलन (वीएम) से मिडब्रेन न्यूरॉन्स को अलग, अलग और संस्कृति मिडब्रेन न्यूरॉन्स करते हैं। फिर हम मानव न्यूरॉन-विशिष्ट सिनैप्सिन प्रमोटर, एचएसएन के नियंत्रण में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक, GCaMP6f व्यक्त करने वाले एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के साथ दीर्घकालिक प्राथमिक माउस मिडब्रेन संस्कृतियों को संक्रमित करते हैं। लाइव कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके, हम बताते हैं कि सुसंस्कृत माउस मिडब्रेन न्यूरॉन्स एएवी-एचएसएन-जीसीएएमपी 6एफ द्वारा पता किए गए सहज सीए2 + फ्लक्स प्रदर्शित करते हैं। मिडब्रेन संस्कृतियों के लिए ग्लूटामेट के स्नान आवेदन न्यूरॉन्स के भीतर इंट्रासेल्युलर सीए2 + में असामान्य ऊंचाई का कारण बनता है और यह दा न्यूरॉन्स में कैस्पास-3 सक्रियण के साथ होता है, जैसा कि इम्यूनोस्टेपिंग द्वारा प्रदर्शित किया जाता है। प्राथमिक माउस दा न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट-मध्यस्थता एपोप्टोसिस की पहचान करने की तकनीकों में डीए न्यूरॉन स्वास्थ्य को संरक्षित करने वाली दवाओं की उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए महत्वपूर्ण अनुप्रयोग हैं।

Introduction

पार्किंसंस रोग (पीडी) दुनिया भर में दूसरा सबसे आम न्यूरोडीजेनेरेटिव डिसऑर्डर है, जिसमें कोई ज्ञात इलाज नहीं है। अनुमान ों से पता चलता है कि पीडी की व्यापकता में वृद्धि जारी रहेगी औरअकेलेसंयुक्त राज्य अमेरिका में वर्ष 2030 तक 1 मिलियन निदानों को पार करने का अनुमान है । पीडी का मुकाबला करने के लिए वर्तमान में उपलब्ध कुछ प्रभावी उपचारों के साथ, अधिक प्रभावी उपचार विकसित करने की आवश्यकता है। पीडी मिडब्रेन डोपामाइन (डीए) न्यूरॉन्स2के एक तेजी से और प्रगतिशील नुकसान की विशेषता है । पीडी में न्यूरोडिजेनरेशन को रेखांकित करने वाले तंत्र खराब समझ में आते हैं। साक्ष्य कई तंत्रों के संभावित अभिसरण का सुझाव देते हैं, जैसे ऑक्सीडेटिव तनाव और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, आदि जो एपोटोटिक सिग्नलिंग कैस्केड और अंतिम सेल डेथ3की शुरुआत में योगदान देते हैं।

ऐसा ही एक अभिसरण तंत्र, ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्ससिटॉक्सिकिटी को पीडी4सहित कई न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में फंसाया गया है । जबकि ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्सेक्टॉक्सिकिटी को मुख्य रूप से इंट्रासेल्युलर सीए2 + एकाग्रता और एपोप्टोसिस की अंतिम शुरुआत में अत्यधिक वृद्धि के माध्यम से एनएमडीए रिसेप्टर्स की उत्तेजना के माध्यम से काम करने के लिए सोचा जाता है, सीए,2 +-पारगम्य एम्पा रिसेप्टर्स को भी एक्सिटोटॉक्सिक प्रतिक्रिया5,,6,7में फंसाया गया है। इसलिए, पीडी मॉडल के भीतर ग्लूटामेट-मध्यस्थता एपोप्टोसिस में एम्पा रिसेप्टर्स के योगदान को निर्धारित करना रुचि है। यह NBQX, एक AMPA और काइनेट अवरोधक का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, जो माइक्रोमोलर सांद्रता पर एम्पा रिसेप्टर्स8के लिए चयनात्मक है। ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्सटॉक्सिकिटी और एपोप्टोटिक सिग्नलिंग कैस्केड सेल मृत्यु की सीमा को मापने के लिए एक आदर्श डाउनस्ट्रीम लक्ष्य हैं, और चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए एक संभावित लक्ष्य है। इसलिए, कैल्शियम गतिविधि के ग्लूटामेट-मध्यस्थता मॉड्यूलेशन का आकलन करने और प्राथमिक वेंट्रल मेसेफेलिक (वीएम) न्यूरॉन्स में जुड़े डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग का आकलन करने के लिए एक उच्च सामग्री विधि विकसित करना न्यूरोनल स्वास्थ्य को संरक्षित करने की उनकी क्षमता पर उपन्यास उपचार विधियों की स्क्रीनिंग के लिए मूल्यवान होगा।

यहां, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसमें हम आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम इंडिकेटर (जीईसीआई), GCaMP6f को व्यक्त करते हैं, जो ग्लूटामेट आवेदन के जवाब में माउस वीएम प्राथमिक न्यूरॉन्स की सीए2 + गतिविधि को मापने के लिए मानव सिनैपिन (एचएसएन) प्रमोटर के साथ AAV2/5 का उपयोग करके व्यक्त करते हैं जिसे शारीरिक और आणविक स्तर पर मापा जा सकता है। इस उच्च सामग्री स्क्रीनिंग फार्मास्यूटिकल्स या उपचार है कि Ca2 + गतिविधि मिलाना वीएम न्यूरॉन्स के स्वास्थ्य को बनाए रखने की खोज के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हम प्रस्ताव करते हैं कि यह प्राथमिक संस्कृति मॉडल उपन्यास पीडी हस्तक्षेपों के लिए स्क्रीन करने का एक प्रभावी तरीका है, जो वीएम न्यूरॉन्स के स्वास्थ्य को संरक्षित करने और पीडी की प्रगति को कम करने की उनकी क्षमता के आधार पर है।

Protocol

पशु विषयों के उपयोग से जुड़ी सभी प्रक्रियाओं को टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (25 नवंबर 2019) द्वारा अनुमोदित किया गयाहै; AUP # 2019-0346) ।

नोट: सेल संस्कृति समाधान की तैयारी जैविक सुरक्षा कैबिनेट में बाँझ प्रक्रिया का उपयोग करके की जानी चाहिए और संदूषण को रोकने के लिए 0.2 माइक्रोन पर फ़िल्टर की जानी चाहिए।

1. समाधान और संस्कृति माध्यम की तैयारी

  1. 1 मिलीग्राम/एमएल लैमिनिन स्टॉक के 20 माइक्रोन को कमजोर करके लैमिनिन कोटिंग समाधान तैयार करें बाँझ आसुत एच 2 ओ के2एमएल में विच्छेदन के दिन तैयार करें।
  2. 1x हैंक के बैलेंस्ड सॉल्ट सॉल्यूशन (एचबीएसएस) के 45 एमएल में ईएस के 5 एमएल जोड़कर 10% घोड़े (घोड़ा) सीरम (ईएस) स्टॉप सॉल्यूशन तैयार करें। बाँझ फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर सिस्टम या सिरिंज फिल्टर टिप का उपयोग कर. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 2 ग्राम बीएसए पाउडर जोड़कर और 45 एमएल की अंतिम मात्रा में लाकर 4% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) स्टॉक समाधान तैयार करें। बाँझ फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर सिस्टम या सिरिंज फिल्टर टिप का उपयोग कर. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 1x एचबीएसएस में 3 मिलीग्राम/एमएल के लिए पापीन को पतला करके पैपिन स्टॉक समाधान तैयार करें। बाँझ फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर सिस्टम या सिरिंज फिल्टर टिप का उपयोग कर. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. बाँझएच2 ओ में 20 मिलीग्राम DNase पाउडर जोड़कर और 20 एमएल की अंतिम मात्रा में लाकर डिऑक्सीरिबोक्यूक्लाज (DNase) समाधान तैयार करें। बाँझ फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर सिस्टम या सिरिंज फिल्टर टिप का उपयोग कर. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. एस्कॉर्बिक एसिड स्टॉक समाधान बाँझ आसुत एच 2 ओ में 352 मिलीग्राम एस्कॉर्बिक एसिड जोड़कर तैयार करें और20एमएल की अंतिम मात्रा में लाएं। यदि आवश्यक हो तो भंग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में गर्मी। बाँझ फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर सिस्टम या सिरिंज फिल्टर टिप का उपयोग कर. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. न्यूरोबेसल माध्यम के 50 एमएल में निम्नलिखित जोड़कर सेल कल्चर मीडियम तैयार करें: ग्लूटामैक्स (100x), 500 माइक्रोन घोड़े सीरम के 500 माइक्रोन, बी-27 का 1 एमसीएल, एस्कॉर्बिक एसिड का 100 माइक्रोन, पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन का 500 माइक्रोन, कानमाइसिन का 50 माइक्रोन और एम्पिसिलिन का 50 माइक्रोन। बाँझ फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर सिस्टम का उपयोग कर. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. 10% समाधान बनाने के लिए 1x पीबीएस के 9 मिलील में ट्राइटन एक्स-100 के 1 एमएल जोड़कर 0.01% ट्राइटन एक्स-100 सॉल्यूशन तैयार करें। ट्राइटन एक्स-100 चिपचिपा है, धीरे-धीरे टिप को पूरी तरह से भरने की अनुमति देने के लिए पिपेट। यदि आवश्यक हो तो भंग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में गर्मी। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. 10% ट्राइटन एक्स-100 स्टॉक को 0.01% तक पतला करने के लिए, 3 सीरियल 1:10 कमजोर करने का प्रदर्शन करें। 1% समाधान बनाने के लिए 1x पीबीएस के 9 एमसीएल में 10% स्टॉक का पतला करें। 0.1% समाधान बनाने के लिए 1x पीबीएस के 9 एमसीएल में 1% समाधान का 1 मिलियन 1 मिलियन का पतला करें। 0.01% समाधान बनाने के लिए 1x पीबीएस के 9 एमएल में 0.1% समाधान के 1 मिलील।
  10. 10% समाधान के लिए 1x पीबीएस के 9 एमएल में एनजीएस के 1 एमएल जोड़कर 10% और 1% सामान्य बकरी सीरम (एनजीएस) समाधान तैयार करें। 1% समाधान बनाने के लिए 1x पीबीएस के 9.9 एमएल में 100 μL जोड़ें।
  11. ग्लूटामेट स्टॉक सॉल्यूशन (100 mM) को बाँझ आसुत एच2ओ में 735 मिलीग्राम एल (+) जोड़कर तैयार करें और 50 मिलीएल की अंतिम मात्रा में लाएं। इस एकाग्रता पर घुलनशीलता एक मुद्दा होगा । 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड की छोटी मात्रा (100 माइक्रोन) जोड़ना घुलनशीलता बढ़ाने के लिए पर्याप्त है।
  12. एनबीक्यूएक्स स्टॉक सॉल्यूशन (10 एमएम) को बाँझ आसुत एच2ओ में 50 मिलीग्राम NBQX जोड़कर तैयार करें और 13 एमएल के अंतिम वॉल्यूम में लाएं।

2. संस्कृति व्यंजन और कवर्लिप्स की तैयारी (विच्छेदन से पहले दिन किया)

नोट: हमने पाया है कि तीन कोटिंग एजेंटों, पॉली-एल-लाइसिन, पॉली-एल-ऑर्निथिन और लेमिनिन के संयोजन से आदर्श कोशिका आसंजन और व्यवहार्यता की अनुमति मिलती है।

  1. जैविक सुरक्षा कैबिनेट में 10 35 मिमी पेट्री व्यंजन रखें। प्रत्येक डिश में दो गोलाकार 12 मिमी कवरलिप रखें और 10 मिनट के लिए 70% एटोह से भरें। प्रत्येक डिश से शेष एटोह को एस्पिरेट करने के लिए वैक्यूम लाइन का उपयोग करें, जिससे एटोह पूरी तरह से वाष्पित हो जाता है।
  2. प्रत्येक कवरस्लिप पर 0.1% पॉली-एल-लिसिन समाधान का पिपेट ~ 90-100 माइक्रोन, यह सुनिश्चित करता है कि पूरा कवरस्लिप पॉली-एल-लिसिन समाधान द्वारा कवर किया गया है। बर्तन को ढक्कन के साथ कवर करें और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  3. प्रत्येक कवरस्लिप से शेष पॉली-एल-लिसिन समाधान को एस्पिरेट करें और बाँझ एच2ओ के साथ कुल्ला करें।
  4. 0.1% पॉली-एल-ऑर्निथिन समाधान के साथ चरण 2.2 - 2.3 दोहराएं।
  5. फिर, 0.01% लेमिनिन समाधान के साथ चरण 2.2 - 2.3 दोहराएं। अगले दिन सेल चढ़ाना के लिए तैयार होने तक 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।

3. माउस भ्रूण विच्छेदन

नोट: हम संस्कृति प्रति 4 से 6 समय पर गर्भवती चूहों के बीच उपयोग करते हैं। जबकि विच्छेदन प्रक्रिया के बहुत एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के बाहर होता है यह अभी भी बाँझ प्रक्रिया को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । विच्छेदन माइक्रोस्कोप के पास और सर्जिकल उपकरणों पर सतहों पर 70% एटोह का भरपूर उपयोग आदर्श है। विच्छेदन के दौरान एक मुखौटा भी पहना जा सकता है ताकि प्रदूषण को रोका जा सके। इसके अतिरिक्त, हम संस्कृति माध्यम में 4 अलग एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करें, तो संदूषण की संभावना नहीं है । हालांकि, यदि एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग समस्याग्रस्त है, तो इस विच्छेदन सेटअप को बाँझ हुड के अंदर ले जाया जा सकता है। कोशिका व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए सभी विच्छेदन समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-ठंडा होना चाहिए, और विच्छेदन जितनी जल्दी हो सके पूरा किया जाना चाहिए। हम बर्फ पर विच्छेदन नहीं करते हैं। माउस भ्रूणीय मिडब्रेन न्यूरॉन्स के विच्छेदन की विधि पहले वर्णित तरीकों के समान है9,10.

  1. एक शोषक पैड के साथ एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के पास एक बेंच पर एक जगह तैयार करें और 70% एटोह के साथ उदारतापूर्वक स्प्रे करें।
  2. 70% एटोह के साथ दो 100 x 15 मिमी ग्लास पेट्री व्यंजन और एक 50 x 10 मिमी ग्लास पेट्री डिश स्प्रे करें और एटोह को वाष्पित होने दें। एक बार सुखाया, प्रत्येक 100 x 15 मिमी पेट्री डिश में बाँझ 1x एचबीएसएस के 50 एमएल रखें।
  3. 10 मिनट न्यूनतम के लिए 70% एटोह में सर्जिकल कैंची, संदंश और माइक्रोटॉम ब्लेड को जलमग्न करें। उपकरणों को सुखाने के लिए शोषक पैड पर रखें।
  4. सीओ2 का उपयोग करना गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद, भ्रूण दिवस 14 पर 2-3 महीने पुराने समय पर गर्भावस्था चूहों इच्छामृत्यु ।
  5. 70% एटोह के साथ इच्छामृत्यु चूहों के पेट स्प्रे। संदंश का उपयोग करना निचले पेट को पकड़ें और सर्जिकल कैंची का उपयोग करके पेट की गुहा खोलें। जहां संदंश पेट पकड़ रहे हैं के पास काटना शुरू करें, प्रत्येक तरफ पार्श्व कटौती कर रहे हैं जब तक पेट की दीवार को वापस नहीं जोड़ा जा सकता है और गर्भाशय स्पष्ट रूप से दिखाई देता है।
  6. सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, गर्भाशय सींग के दोनों सिरों को काट दें। इसके बाद गर्भाशय निकालकर 1x एचबीएसएस के साथ पेट्री डिश में रखें।
  7. सीधे टिप संदंश का उपयोग ध्यान से गर्भाशय से भ्रूण को दूर। इस प्रक्रिया के दौरान एचबीबीएस में भ्रूण छोड़ दें। या तो संदंश या एक माइक्रोटॉम ब्लेड का उपयोग करना, जल्दी से गर्दन के पास काटने से भ्रूण को काटना। स्तर के रूप में संभव के रूप में एक कटौती करना।
  8. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक भ्रूण सिर को सूखे 50 मिमी पेट्री डिश में ले जाएं और वेंट्रल साइड पर रखें। आंखों/थूथन के पास रखकर और मर्मज्ञ करके संदंश के साथ सिर को स्थिर करें। मेसेंसेफेलन को भेदने से बचने के लिए फोर्स्प्स को ~ 45 डिग्री पर नीचे की ओर कोण किया जाना चाहिए।
  9. दूसरे हाथ में संदंश का उपयोग करना, ध्यान से मेसेंसेफेलन के प्रमुख रिज से ठीक पहले त्वचा और खोपड़ी की पारदर्शी परत को हटा दें। मिडलाइन के पास शुरू करें और त्वचा और खोपड़ी को हटा दें जब तक कि मेसेंसेफेलन पूरी तरह से उजागर न हो जाए।
  10. कॉर्टेक्स और मेसेएंफेलन के बीच एक टिप के साथ उजागर मेसेंसेफेलन के लिए कंप्लेंट को पकड़ें और दूसरा सेरिबैलम के पास। पूरे मिडब्रेन को हटाने के लिए एक साथ संदंश दबाएं और चुटकी लें। मिडब्रेन सेगमेंट लगभग 0.5 मिमी मोटा होना चाहिए। मिडब्रेन सेगमेंट को फ्रेश 1x एचबीएसएस से भरी दूसरी पेट्री डिश में रखें । प्रत्येक भ्रूण के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  11. विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, मस्तिष्क खंड को वेंट्रल साइड का सामना करना पड़ रहा है। यदि मेनिंग अभी भी जुड़े हुए हैं, तो इसे संदंश के साथ हथियाने और मस्तिष्क खंड से ऊपर और दूर करके सावधानी से हटा दें।
  12. ब्रेन सेगमेंट में 4 दृश्यमान क्वाड्रंट्स होने चाहिए। सेगमेंट को इस तरह से रखें कि दो छोटे क्वाड्रंट दो बड़े क्वाड्रंट्स से बेहतर तैनात हों। अवर दो (बड़े) क्वाड्रंट्स से बेहतर दो (छोटे) क्वाड्रंट को अलग करने वाला एक प्रमुख रिज है।
  13. संदंश चुटकी का उपयोग करना और अवर चतुर्भुज से बेहतर चतुर्भुज को अलग करें, और फिर बेहतर चतुर्भुज को त्यागें। शेष अवर चतुर्भुज में पृष्ठीय पक्ष पर अतिरिक्त ऊतक होंगे, यह ऊतक शेष वेंट्रल ऊतक की तुलना में कम अपारदर्शी दिखेगा। कम घने पृष्ठीय ऊतक को हटा दें और त्यागें। शेष खंड में सबस्टेंटिया निग्रा पार्स कॉम्पैक्टा (एसएनसी) और वेंट्रल टेगमेंटल एरिया (वीटीए) दोनों होनी चाहिए।
  14. संदंश का उपयोग करके शेष वेंट्रल ऊतक खंड को 4 छोटे टुकड़ों में काट दिया जाता है और 1mL वाइड बोर पिपेट का उपयोग करके इन सेगमेंट को 1x एचबीबीएस के साथ 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित किया जाता है। प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर मस्तिष्क खंडों के साथ शंकु नली रखें।
  15. शेष सभी मस्तिष्क खंडों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।

4. कोशिकाओं का वियोजन

  1. कोशिकाओं का एंजाइमेटिक पाचन
    1. ध्यान से 15 एमएल शंकुधारी ट्यूब से एचबीबीएस को एस्पिरेट करें जिसमें मिडब्रेन सेगमेंट होते हैं, जिससे सेगमेंट ट्यूब के नीचे हो जाते हैं।
    2. ट्यूब में पैपिन समाधान के ~ 800 μL जोड़ें और 7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। ट्यूब को फ्लिक करके कोशिकाओं को फिर से स्थापित करें और अतिरिक्त 7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर को बदलें।
    3. एक चौड़े बोर 1 एमएल पिपेट टिप के साथ केवल मिडब्रेन सेगमेंट को DNase के 1 एमएल एलिकोट में हटा दें। सेगमेंट को एलिकोट के नीचे या लगभग 1 मिनट के एक्सपोजर तक पहुंचने की अनुमति दें।
    4. एक चौड़े बोर 1 एमएल पिपेट टिप के साथ केवल मिडब्रेन सेगमेंट को 15 एमएल शंकु नली में हटा दें जिसमें स्टॉप सॉल्यूशन का 2 एमएल होता है। खंडों को ट्यूब के नीचे बसने की अनुमति दें और स्टॉप समाधान से भरे अतिरिक्त शंकु नली में कुल्ला दोहराएं।
  2. कोशिका निलंबन का यांत्रिक ट्रिट्यूशन
    1. दूसरे स्टॉप समाधान कुल्ला ट्यूब में, एक चौड़े बोर 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके, कोशिकाओं को 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें जब तक कि कोई बड़े ऊतक खंड दिखाई न दें। न्यूनतम सेल लाइसिस के लिए अधिक ट्रिट्यूशन से बचना महत्वपूर्ण है।
    2. धीरे-धीरे मस्तिष्क खंडों वाले 15 एमएल शंकु नली के नीचे 4% बीएसए समाधान के 300 माइक्रोन पिपेट करें। निलंबन परत बनाए रखने के लिए पिपेट टिप को सावधानी से हटा दें। 3 मिनट के लिए 0.4 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। फिर सावधानी से कोशिका संस्कृति माध्यम के 400 माइक्रोन में सुपरनैंट और रिसिम्प कोशिकाओं को एस्पिरेट करें।

5. कोशिकाओं चढ़ाना

नोट: अनुभव के आधार पर, प्रति भ्रूण लगभग 100,000 व्यवहार्य कोशिकाएं एकत्र की जाती हैं। 2-3 महीने पुराने समय पर गर्भवती चूहों आम तौर पर 8-10 भ्रूण के कूड़े आकार है; इसलिए, प्रति समयित गर्भवती माउस कोशिकाओं की कुल उपज के लिए एक मोटा अनुमान लगभग 1 मिलियन कोशिकाएं हैं।

  1. एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करना एक सेल गिनती preform और फिर सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग कर २,००० कोशिकाओं/μL के लिए निलंबन पतला । मिश्रण करने के लिए संक्षेप में ट्राइटुरेट करें।
  2. इनक्यूबेटर से स्टेप 2 से लेमिनिन समाधान के साथ कवरस्लिप निकालें और वैक्यूम का उपयोग करके कोटेड कवर्लिप्स से शेष लेमिनिन समाधान को बढ़ाएं। पूरी तरह से सूखने से कवरस्लिप से बचने के लिए जल्दी से प्लेट करें। प्रत्येक कवरस्लिप पर पिपेट 100 माइक्रोन (2.0 x10 5 कोशिकाएं/कवरलिप) और पेट्री व्यंजन को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
  3. ध्यान से प्रत्येक डिश के लिए सेल संस्कृति माध्यम के 3 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस जगह है। 2 सप्ताह के लिए प्रति सप्ताह 2 बार आधे मध्यम परिवर्तन को प्रीफॉर्म करें।

6. एडेनो से जुड़े वायरल (AAV) वैक्टर के साथ 14 DIV में सेल संस्कृति का संक्रमण

  1. प्रत्येक डिश के लिए सीरम मुक्त DMEM माध्यम के 1 μL के साथ तैयार hSyn-GCaMP6f AAV (1.0 x 1013 titer)
  2. प्रत्येक डिश से सेल कल्चर माध्यम को एस्पिरेट करें और सीरम मुक्त डीएमईएम के 1 मिलील के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें एचएसएन-जीसीएएमपी 6एफ होता है। व्यंजन को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस रखें।
  3. एएवी युक्त सीरम मुक्त माध्यम को एस्पिरेट करें और सेल कल्चर माध्यम के 3 एमएल के साथ बदलें। व्यंजन को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस रखें। हमने पाया है कि एएवी संक्रमण के 5-7 दिन GCaMP अभिव्यक्ति के आदर्श स्तर के लिए अनुमति देता है। वायरल इंफेक्शन की इस अवधि में हर 2-3 दिन में मीडियम बदलते रहें।

7.19-21 DIV के बीच लाइव कॉन्फोकल Ca 2 + इमेजिंग

नोट: जैसा कि चरण 6.3 में उल्लेख किया गया है, वायरल संक्रमण के बाद इमेजिंग 5-7 दिनों के बीच की जा सकती है। यह उन स्तरों पर फ्लोरोफोर की दृश्यमान अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए आदर्श खिड़की है जो सहज सीए2 + गतिविधि का पता लगाने की अनुमति देते हैं।

  1. बफ़र्स रिकॉर्डिंग की तैयारी
    1. हेपेस रिकॉर्डिंग बफर के 1 एल बनाने के लिए, जोड़ें: 9.009 ग्राम NaCl, केसीएल के 0.3728 ग्राम, डी-ग्लूकोज के 0.901 ग्राम, एचईपीई के 2.381 ग्राम, 1 एम सीएसीएल2 स्टॉक सॉल्यूशन के 2 एमएल, और 1 एम एमजीसीएल के 500 माइक्रोन2 स्टॉक सॉल्यूशन को 800 मीटर बाँझ आसुत एच2ओ. पीए को 7.4 तक लाओ। 1 एल की अंतिम मात्रा में लाओ।
    2. 20 माइक्रोन ग्लूटामेट रिकॉर्डिंग बफर के 200 मिलियन μl बनाने के लिए, ऊपर वर्णित हेपेट रिकॉर्डिंग बफर के 200 मिलील में 100 मिलियन ग्लूटामेट स्टॉक समाधान के 40 माइक्रोन को पतला करें।
    3. 10 μM NBQX रिकॉर्डिंग बफर के 200 मिलीएल बनाने के लिए, 10 m M NBQX स्टॉक समाधान के 200 μL को एचईपी रिकॉर्डिंग बफर के 200 मिलियन में पतला करें।
  2. कॉन्फोकल इमेजिंग
    1. रिकॉर्डिंग बफर के 3 एमएल के साथ एक बाँझ 35 मिमी पेट्री डिश भरें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से संक्रमित संस्कृतियों के साथ 35 मिमी पेट्री डिश निकालें। ठीक टिप संदंश का उपयोग करना, ध्यान से एक कवरस्लिप के किनारे हड़पने और यह पेट्री रिकॉर्डिंग बफर से भरा पकवान में जल्दी से हस्तांतरण । शेष कवरलिप को मध्यम पीठ में 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। कंफोकल माइक्रोस्कोप के लिए बफर रिकॉर्डिंग के साथ पकवान परिवहन।
    3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करें। शुरू करते समय अगले चरण पर आगे बढ़ें।
    4. पेरिस्टाल्टिक पंप शुरू करें और लाइन को रिकॉर्डिंग बफर में रखें। प्रवाह की गति को 2 एमएल/न्यूनतम होने के लिए कैलिब्रेट करें ।
    5. 35 मिमी पेट्री डिश से संक्रमित कवरस्लिप को रिकॉर्डिंग बाथ में स्थानांतरित करें।
    6. 10x पानी विसर्जन उद्देश्य और BF प्रकाश का उपयोग करना, ध्यान के विमान को खोजने के लिए और न्यूरॉन सेल निकायों के एक उच्च घनत्व के साथ एक क्षेत्र के लिए देखो । 40x पानी विसर्जन उद्देश्य पर स्विच करें और बीएफ लाइट का उपयोग करके नमूना फिर से केंद्रित करें।
    7. FluoView के भीतर "Dyes सूची" विंडो में AlexaFluor 488 का चयन करें और इसे लागू करें।
    8. एएवी अभिव्यक्ति परिवर्तनीय हो सकती है; इसलिए, फ्लोरोफोरस के ओवरएक्सपोजर और फोटोब्लैचिंग को रोकने के लिए, कम एचवी और लेजर पावर सेटिंग्स के साथ शुरू करें। एलेक्साफ्लूर 488 चैनल के लिए, हाई वोल्टेज (एचवी) को 500 तक सेट करें, 1x का लाभ, और 0 को ऑफसेट करें। 488 लेजर लाइन के लिए 5% करने के लिए बिजली निर्धारित किया है। जेड-प्लेन में इमेज्ड प्रभावी वॉल्यूम को बढ़ाने के लिए पिनहोल का साइज बढ़ाकर 300 माइक्रोन करें। उत्सर्जन संकेतों को उप-संतृप्ति स्तरों पर बेहतर ढंग से समायोजित करने के लिए "फोकस x2" स्कैनिंग विकल्प का उपयोग करें। यहां से, सेटिंग्स को तब तक समायोजित किया जा सकता है जब तक कि प्रत्येक चैनल की आदर्श दृश्यता प्राप्त न हो जाए।
      नोट: GCaMP के साथ सीए2 + फ्लक्स की पूरी श्रृंखला को सही ढंग से कैप्चर करने के लिए, बेसलाइन एचवी और लेजर पावर सेटिंग्स को समायोजित करें ताकि डिटेक्टर को ओवरएटैच किए बिना फ्लोरोसेंट तीव्रता में वृद्धि की अनुमति दी जा सके।
    9. एक बार माइक्रोस्कोप सेटिंग्स अनुकूलित कर रहे हैं, तो GCaMP6f फ्लोरेसेंस में सहज परिवर्तन प्रदर्शित करने वाली कई कोशिकाओं के साथ एक क्षेत्र का पता लगाने के लिए मंच को स्थानांतरित करें और इमेजिंग के लिए वांछित विमान पर ध्यान केंद्रित करें।
    10. इमेजिंग फ्रेम को एक आकार में क्लिप करने के लिए "क्लिप रेक्ट" टूल का उपयोग करें जो सिर्फ 1 सेकंड के तहत एक फ्रेम अंतराल प्राप्त कर सकता है। इमेजिंग इंटरवल को 1 फ्रेम प्रति सेकंड सेट करना जरूरी है।
    11. 1.0 के मूल्य के लिए "अंतराल" विंडो और 600 के लिए "Num" विंडो सेट करें।
      नोट: वांछित समय बिंदु (300 एस) पर विभिन्न रिकॉर्डिंग बफ़र्स देने के लिए, स्नान के लिए नया समाधान देने के लिए पंप की विलंबता को जांचना महत्वपूर्ण है। यह समाधान परफ्यूजन दर (2 एमएल/मिनट) और समाधान पंप करने के लिए उपयोग की जाने वाली लाइन की लंबाई पर निर्भर करेगा।
    12. एक टी-सीरीज फिल्म पर कब्जा करने के लिए "समय" विकल्प का चयन करें और फिर इमेजिंग शुरू करने के लिए "XYt" स्कैनिंग विकल्प का उपयोग करें।
    13. इमेजिंग प्रगति बार देखें और उचित समय बिंदु पर 20 माइक्रोन ग्लूटामेट रिकॉर्डिंग बफर में हेपेस रिकॉर्डिंग बफर से लाइन को स्थानांतरित करें (उदाहरण के लिए, यदि पंप की विलंबता को 60 एस पर समाधान देने के लिए कैलिब्रेट किया जाता है, तो 300 एस पर ग्लूटामेट देने के लिए 240 फ्रेम पर लाइन को ग्लूटामेट बफर में ले जाएं)।
    14. इमेजिंग पूरी होने पर, सीरीज किए गए बटन का चयन करें और तैयार टी-सीरीज फिल्म को बचाएं। अतिरिक्त 5 मिनट के लिए 20 माइक्रोन ग्लूटामेट को छिद्रित करना जारी रखें, ताकि सुसंस्कृत न्यूरॉन्स कुल 10 मिनट के लिए ग्लूटामेट के संपर्क में आ जाएं। प्रत्येक कवरस्लिप को इमेज्ड करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    15. 20 माइक्रोन ग्लूटामेट के अतिरिक्त 5 मिनट के संपर्क में आने के बाद, स्नान से कवरस्लिप को हटा दें और इमेजिंग के दिन पूरा होने तक रिकॉर्डिंग बफर युक्त 35 मिमी पेट्री डिश में वापस रखें। समाप्त होने पर, 8 कदम के लिए आगे बढ़ें।
  3. Ca2+ ट्रेस विश्लेषण
    1. इमेजजे में इमेज एनालिसिस करें। इमेजजे के लिए बायो-फॉर्मेट प्लगइन स्थापित करें, जो अनुमति देगा। OIB छवि फ़ाइलें खोलने के लिए ।
    2. ImageJ टूलबार में, विश्लेषण पर क्लिक करें । माप सेट करें,और मीन ग्रे वैल्यू (एमजीवी) के लिए बॉक्स का चयन करें।
    3. ImageJ में, एक टी-सीरीज फिल्म को हाइपरस्टैक के रूप में खोलें।
    4. फिल्म के लिए स्लाइडर खींचें और ग्लूटामेट का जवाब देने वाले सभी न्यूरॉन्स की कल्पना करने के लिए अधिकतम ग्लूटामेट प्रतिक्रिया के साथ फ्रेम की पहचान करें। सभी दृश्यमान न्यूरॉन सेल निकायों का पता लगाने के लिए बहुभुज उपकरण का उपयोग करें, "आरओआई प्रबंधक" सूची में अपने आरओआई जोड़ते हैं।
    5. जब ट्रेसिंग और आरओआई जोड़ना समाप्त हो जाता है, तो आरओआई प्रबंधक विंडो के भीतर सभी आरओआई का चयन करें और विकल्पों की अधिक सूची में मल्टी माप चयन का उपयोग करें। इन डेटा को स्प्रेडशीट में कॉपी करें और चिपकाएं। सभी फिल्मों का विश्लेषण करने के लिए इस प्रक्रिया को पूरा करें।
    6. प्रत्येक आरओआई के लिए, प्रत्येक फ्रेम से कच्चे एमजीवी डेटा को समीकरण का उपयोग करके 1F/F0 मानों में परिवर्तित करें: ΤF/F0 = [एफ (टी)-एफ0]/F0। जहां एफ (टी) = किसी भी फ्रेम के MGV, और एफ0 = ~ 10 फ्रेम के औसत बेसलाइन MGV जहां कोई Ca2 + fluxes मौजूद हैं ।
    7. ओरिजिनप्रो 2020 जैसे सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, परिवर्तित ΤF/F0 निशान लाइन ग्राफ में बनाया जा सकता है। ग्लूटामेट प्रतिक्रिया के शिखर आयाम को मापने के लिए "पीक एनालाइजर" फ़ंक्शन का उपयोग किया जा सकता है (या समान कार्य) ग्लूटामेट प्रतिक्रिया के शिखर आयाम को मापने के लिए, ग्लूटामेट का जवाब देने के लिए विलंबता, और वक्र के तहत क्षेत्र।

8. संस्कृतियों का इम्यूनोदाता

नोट: फॉर्मेलिन के साथ निर्धारण के बाद, कवरस्लिप को 1x पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि इम्यूनोस्टेपिंग के लिए संसाधित होने के लिए तैयार न हो जाए। प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन एक धारावाहिक तरीके से किया गया था, जैसे कि एंटी-कैस्पेज़-3 प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन और इसके पूरक माध्यमिक एंटीबॉडी एंटी-टीएच प्राथमिक एंटीबॉडी और इसके पूरक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन से पहले।

  1. ग्लूटामेट एक्सपोजर के तुरंत बाद, कवरस्लिप को अपने 35 मिमी पेट्री डिश में वापस रखें, रिकॉर्डिंग बफर को एस्पिरेट करें, और 10% फॉर्मेलिन के 3 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 40 मिनट के लिए बैठने दें।
  2. 1x पीबीएस के साथ 3 बार डिश कुल्ला।
  3. पीबीएस को एस्पिरेट करें और 2 मिनट के लिए पीबीएस में 0.01% ट्राइटन एक्स-100 के 1 मिलील में कोशिकाओं को पार करें।
  4. 1x पीबीएस के साथ 3 बार डिश कुल्ला।
  5. पीबीएस में 10% एनजी के 1 मिलील में पीबीएस और ब्लॉक सेल को 40 मिनट के लिए एस्पिरेट करें।
  6. 1x पीबीएस के साथ 3 बार डिश कुल्ला।
  7. पीबीएस (1:1000 कमजोर पड़ने) में 1% एनजीएस के 1 एमसीएल में खरगोश विरोधी Caspase-3 प्राथमिक एंटीबॉडी के 1 μL जोड़ें। डिश से पीबीएस को एस्पिरेट करें और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ बदलें। आरटी में 1.5 घंटे के लिए एक शेखर और इनक्यूबेट पर रखें।
  8. 1x पीबीएस के साथ 3 बार डिश कुल्ला।
  9. पीबीएस (1:1000 कमजोर पड़ने) में 1% एनजीएस के 1 एमसीएल में बकरी विरोधी खरगोश एलेक्साफ्लूर 488 माध्यमिक एंटीबॉडी का 1 माइक्रोन जोड़ें। डिश से पीबीएस को एस्पिरेट करें और सेकेंडरी एंटीबॉडी सॉल्यूशन से बदलें। आरटी में 1 घंटे के लिए एक शेखर और इनक्यूबेट पर रखें । आगे बढ़ते हुए नमूनों को प्रकाश से बचाएं ।
  10. 1x पीबीएस के साथ 3 बार डिश कुल्ला।
  11. कदम 8.7 - 8.10 दोहराएं, लेकिन कदम 8.7 में चिकन एंटी-TH प्राथमिक एंटीबॉडी (1:1000) और बकरी विरोधी चिकन एलेक्साफ्लूर 594 माध्यमिक एंटीबॉडी (1:1000) का उपयोग चरण 8.9 में।
  12. अंतिम PBS कुल्ला के बाद, एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर बढ़ते माध्यम के 30 μL जगह है । संदंश का उपयोग 35 मिमी पेट्री डिश से एक कवरस्लिप हड़पने और बढ़ते माध्यम में नीचे का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ कवरस्लिप जगह है। दोनों कवरस्लिप सही ढंग से रखे जाने पर एक ही माइक्रोस्कोप स्लाइड पर फिट होंगे। एक सूखे, अंधेरे क्षेत्र में रखें और बढ़ते माध्यम को रात भर सूखने दें।

9. इम्यूनो दाग संस्कृतियों के कॉन्फोकल इमेजिंग

  1. कॉन्फोकल इमेजिंग
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करें। नमूना माइक्रोस्कोप चरण पर रखें।
    2. माइक्रोस्कोप आईपीस के साथ, एक ट्राइटीसी फिल्टर के साथ 20x आवर्धन उद्देश्य और एपिफ्लोरोसेंट प्रकाश का उपयोग करके, नमूना केंद्रित करें और टीएच + सेल बॉडी की खोज करें।
    3. एक बार TH + सेल शरीर का पता लगाने के बाद, इसे देखने के क्षेत्र में केंद्र और फिर 60x आवर्धन उद्देश्य के लिए कदम ।
    4. "डाई सूची" खिड़की में एलेक्साफ्लूर 488 और एलेक्साफ्लूर 594 रंगों का चयन करें।
    5. लाइव इमेजिंग के साथ, फोटोब्लैचिंग को रोकने के लिए कम एचवी, लाभ, ऑफसेट और लेजर पावर सेटिंग्स के साथ शुरू करें। प्रत्येक चैनल की फ्लोरोसेंट तीव्रता का आकलन करने और तदनुसार समायोजित करने के लिए "फोकस x2" स्कैन विकल्प का उपयोग करें। चूंकि इन छवियों को बाद में फ्लोरोसेंट तीव्रता के लिए निर्धारित किया जाएगा, इसलिए इमेजिंग सेटिंग्स को देखने के सभी क्षेत्रों में सुसंगत रखना आवश्यक है। इसलिए, नमूनों में फ्लोरोसेंट तीव्रता की सीमा का विचार प्राप्त करने के लिए प्रत्येक स्थिति के कुछ उदाहरणों को देखना सबसे अच्छा है।
    6. एक बार आदर्श इमेजिंग सेटिंग्स निर्धारित कर रहे हैं, "फोकस x2" स्कैन विकल्प का चयन करें और देखने के क्षेत्र के केंद्र में ब्याज की कोशिका ले जाएँ। "ज़ूम" स्लाइडर का उपयोग करके डिजिटल ज़ूम को 3x तक बढ़ाएं।
    7. फोकस घुंडी का उपयोग करना, प्रतिभाशाली फ्लोरेसेंस के साथ फोकस के विमान को ढूंढें और एक ही विमान XY छवि पर कब्जा करें। छवि को खत्म करने के लिए सहेजें।
    8. एक और TH + सेल के लिए खोज करने के लिए 20x आवर्धन उद्देश्य पर वापस स्विच करें। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि प्रत्येक स्थिति से वांछित संख्या में कोशिकाओं का नमूना न लिया जाए।
  2. छवि विश्लेषण
    1. ImageJ टूलबार में, विश्लेषण पर क्लिक करें । माप सेट करें,और क्षेत्र, एकीकृत घनत्व, और मतलब ग्रे मूल्य के लिए बक्से का चयन करें।
    2. इमेजजे टूलबार में खींचकर और छोड़ने या फ़ाइल मेनू के माध्यम से छवि का चयन करके अलग किए गए प्रत्येक चैनल के साथ हाइपरस्टैक के रूप में एक छवि खोलें।
    3. सेल शरीर के चारों ओर आरओआई आकर्षित करने के लिए TH चैनल (594 एनएम) का उपयोग करें। इमेजजे में बहुभुज ट्रेसिंग टूल का उपयोग करके, सेल शरीर के बाहरी किनारे को बारीकी से ट्रेस करें। जहां कोशिका झिल्ली और कोशिका नाभिक के बीच की दूरी सबसे छोटी है, साइटोसोल के माध्यम से नाभिक के किनारे तक एक सीधी रेखा का पता लगाइए और फिर इसे बाहर करने के लिए नाभिक की रूपरेखा का बारीकी से पालन करें। फिर बाहरी झिल्ली में वापस एक सीधी रेखा का पता लगाएं, प्रारंभिक रेखा की सीमा के रूप में संभव के रूप में बारीकी से, और आरओआई पूरा होने तक सेल शरीर की रूपरेखा का पालन करना जारी रखें।
    4. कीबोर्ड शॉर्टकट "टी" का उपयोग करना या टूलबार मेनू पथ का उपयोग करना विश्लेषण करना । उपकरण । आरओआई प्रबंधक,आरओआई प्रबंधक खोलें और आरओआई जोड़ें जो अभी सूची में खींचा गया था।
    5. कैस्पे-3 चैनल (488 एनएम) की विंडो का चयन करें, और फिर "आरओआई प्रबंधक" सूची में जोड़े गए आरओआई का चयन करें।
    6. आरओआई प्रबंधक विंडो में, उपाय बटन का चयन करें। परिणाम विंडो पहले सेट किए गए मापों के साथ दिखाई देगी। इन्हें स्प्रेडशीट पर कॉपी करें और प्रत्येक सेल के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।

Representative Results

कोशिकाओं की प्रारंभिक खेती के बाद, हम AAV hSyn-GCaMP6f के 1 μL के साथ 14 DIV में वीएम संस्कृति व्यंजन का इलाज किया और वायरल अभिव्यक्ति के 5 दिनों के लिए अनुमति दी । इमेजिंग HEPES रिकॉर्डिंग बफर के दिन ताजा तैयार किया गया था। हमने दो शर्तों का इस्तेमाल किया; एक शर्त में 20 माइक्रोन ग्लूटामेट 10 मिनट के लिए लागू किया गया था, जबकि दूसरी स्थिति में 10 μM NBQX आवेदन के 5 मिनट से पहले 10 मिनट के सह-आवेदन 10 μM NBQX + 20 μM ग्लूटामेट । दोनों स्थितियों में, हमने GCaMP6f फ्लोरेसेंस में विषम और सहज परिवर्तन देखे, जो सहज सीए2 + फ्लक्स का संकेत देते हैं, जैसा कि प्रतिनिधि निशान(चित्रा 1ए, बी, पूरक फिल्म 1-2)में दिखाया गया है। 20 माइक्रोन ग्लूटामेट के आवेदन ने अनायास सक्रिय और शांत न्यूरॉन्स(चित्रा 1A, पूरक फिल्म 1)दोनों में एक मजबूत और निरंतर सीए2 + प्रतिक्रिया उत्पन्न की। 10 μM NBQX के आवेदन ने सहज गतिविधि को कम कर दिया, और ग्लूटामेट प्रतिक्रिया(चित्रा 1 बी, पूरक मूवी 2)को आंशिक रूप से अवरुद्ध कर दिया। जिस हद तक ग्लूटामेट आवेदन ने प्रत्येक स्थिति में सीए2 + प्रतिक्रिया को प्रेरित किया था, वक्र, पीक आयाम और जवाब देने के लिए विलंबता के तहत क्षेत्र का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किया गया था। वक्र और शिखर आयाम के अंतर्गत दोनों क्षेत्र ग्लूटामेट और एनबीक्यूएक्स + ग्लूटामेट उपचारित स्थितियों(चित्रा 1C)दोनों के समान थे, जबकि एनबीक्यूएक्स + ग्लूटामेट स्थिति(चित्रा 2ए, बी)में प्रतिक्रिया के लिए विलंबता में काफी वृद्धि हुईथी। ग्लूटामेट उपचार के लिए सीए2 + प्रतिक्रिया की मात्रा निर्धारित करने के अलावा, हमने ग्लूटामेट-मध्यस्थता एपोप्टोसिस के उपाय के रूप में एंटी-कैस्पाज़-3 एंटीबॉडी के साथ नमूने तय किए और दाग दिए। हमने शर्तों में कैपेस-3 सक्रियण की एक श्रृंखला देखी(चित्र 3ए, बी)। Caspase-3 सक्रियण क्षेत्र को मापने और मतलब caspase-3 तीव्रता द्वारा निर्धारित किया गया था । अनुपचारित नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में, ग्लूटामेट और एनबीक्यूएक्स + ग्लूटामेट स्थितियों के तहत कैस्पास-3 सक्रियण वाली कोशिकाओं का औसत क्षेत्र महत्व(चित्रा 3B)की ओर रुझान है। अनुपचारित नियंत्रण(चित्रा 3B)की तुलना में ग्लूटामेट और एनबीक्यूएक्स + ग्लूटामेट स्थितियों में मतलब कैपेस-3 तीव्रता काफी अधिक थी। साथ में, ये परिणाम एक उच्च सामग्री ढांचे को प्रदर्शित करते हैं जिसमें न्यूरॉन्स के एपोप्टोसिस को एक्सटोटॉक्सिक एजेंटों के लिए सीए2 + प्रतिक्रियाओं की मात्रा निर्धारित करके मापा जा सकता है और संस्कृतियों के एक ही सेट में कैस्पाज़-3 सक्रियण जैसे डाउनस्ट्रीम एपोप्टोटिक घटनाओं के विश्लेषण के साथ पीछा किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: सुसंस्कृत वेंट्रल मेसेंसेफेलिक न्यूरॉन्स सहज सीए2 + गतिविधि प्रदर्शित करते हैं और ग्लूटामेट एप्लिकेशन द्वारा मजबूती से उत्तेजित होते हैं। (A)वीएम न्यूरॉन्स में सहज सीए2 + गतिविधि के प्रतिनिधि निशान और 20 माइक्रोन ग्लूटामेट आवेदन के लिए उनकी प्रतिक्रिया। (ख)वीएम न्यूरॉन्स में सहज सीए2 + गतिविधि के प्रतिनिधि निशान और 10 μM NBQX + 20 μM ग्लूटामेट आवेदन करने के लिए उनकी प्रतिक्रिया । (ग)जनसंख्या डेटा सीए2 + निशान के वक्र और चोटी आयाम के तहत क्षेत्र दिखा रहा है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: NBQX के साथ AMPAR नाकाबंदी सुसंस्कृत वेंट्रल मेसेंसेफेलिक न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट आवेदन के जवाब में देरी करता है। (A)ग्लूटामेट (ग्रे) और एनबीक्यूएक्स + ग्लूटामेट (नीला) के प्रतिनिधि सीए2 + निशान प्रतिक्रियाएं पैदा करते हैं । ग्लूटामेट (काला) और एनबीक्यूएक्स + ग्लूटामेट (लाल) के औसत सीए2 + निशान मढ़ा दिखाया गया है। (ख)ग्लूटामेट और एनबीक्यूएक्स + ग्लूटामेट के लिए प्रतिक्रिया के लिए विलंबता दिखाने वाले जनसंख्या डेटा ने प्रतिक्रियाएं पैदा कीं । ग्लूटामेट और एनबीक्यूएक्स + ग्लूटामेट स्थितियों के बीच प्रतिशत परिवर्तन सही पैनल में प्रदर्शित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: ग्लूटामेट एप्लिकेशन टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज (टीएच) पॉजिटिव वेंट्रल मेसेंसेफेलिक न्यूरॉन्स में कैस्पे-3 अभिव्यक्ति बढ़ाता है। (ए)वीएम संस्कृतियों की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां कैस्पेज-3 (ग्रीन) और टीएच (लाल), स्केल बार = 10 माइक्रोन के लिए इम्यूनोडाटांग करती हैं।(ख)जनसंख्या डेटा जो डीए न्यूरॉन क्षेत्र दिखाता है और प्रत्येक स्थिति में कैस्पा-3 अभिव्यक्ति का मतलब ग्रे मूल्य है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक मूवी 1: सहज सीए2 + गतिविधि और ग्लूटामेट आवेदन के लिए प्रतिक्रिया।
एचईपीईएस रिकॉर्डिंग बफर (0-300 एस) की उपस्थिति में सहज सीए2 + फ्लक्स 20 माइक्रोन ग्लूटामेट (301-600 एस) के आवेदन के बाद। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक मूवी 2: एनबीक्यूएक्स + ग्लूटामेट एप्लिकेशन के लिए सहज सीए2 + गतिविधि और प्रतिक्रिया।
एचईपीईएस रिकॉर्डिंग बफर (0-300 एस) की उपस्थिति में सहज सीए2 + फ्लक्स 10 माइक्रोन एनबीक्यूएक्स (301-600 एस) और 10 माइक्रोन एनबीक्यूएक्स + 20 माइक्रोन ग्लूटामेट (601-900 एस) के आवेदन के बाद। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

हम न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट-मध्यस्थता एपोप्टोसिस के उच्च सामग्री विश्लेषण के लिए दीर्घकालिक प्राथमिक वेंट्रल मेसेंसेफेलिक (वीएम) सेल कल्चर सिस्टम का वर्णन करते हैं। अध्ययनों ने पीडी मॉडल11 , 12,के संदर्भ में उत्तेजोटॉक्सिक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए प्राथमिक मिडब्रेन डोपामिनेर्गिक संस्कृतियों कोनियोजितकिया है । इस अध्ययन में, हम सीए2 + गतिविधि को मापने के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) का उपयोग करके एक संयोजन दृष्टिकोण को नियोजित करते हैं और इस गतिविधि को डाउनस्ट्रीम आणविक परिवर्तनों के साथ जोड़ते हैं, जैसे कि एपोप्टोटिक सिग्नलिंग कैस्केड4की शुरुआत। विधि अन्य समान सेल संस्कृति प्रणालियों के लिए कई फायदे हैं। जैसा कि हम पार्किंसंस रोग के संदर्भ में excitoxicity में विशेष रुचि है, प्राथमिक VM सेल संस्कृतियों का उपयोग आदर्श है । विभिन्न क्षेत्र स्थानांतरण तकनीकों का उपयोग करके, जैसे कि ग्रिड्ड कवरस्लिप या एक मोटराइज्ड XY माइक्रोस्कोप चरण TH इम्यूनोस्टेपिंग के साथ संयुक्त, हम सीधे वेंट्रल मिडब्रेन न्यूरॉन्स में ग्लूटामेट-मध्यस्थता एपोप्टोसिस के सेल प्रकार विशिष्ट प्रभावों का अध्ययन कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, 3 सप्ताह के सेल संस्कृति मॉडल न्यूरॉन्स के लिए अपने पूर्ण, परिपक्व आणविक प्रोफ़ाइल विकसित करने के लिए अनुमति देता है, वयस्क दा न्यूरॉन्स9को दर्शाती है । पिछले तरीकों में मुख्य रूप से ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्सटॉक्सिकिटी13,14के बाद आणविक परिवर्तनों पर ध्यान केंद्रित किया गया है। मॉडल की पहचान की कोशिका प्रकार में डाउनस्ट्रीम आणविक घटनाओं के साथ न्यूरोनल शरीर विज्ञान में तीव्र परिवर्तन सहसंबंधित करने की क्षमता में अद्वितीय है । प्राथमिक संस्कृति मॉडल की एक सीमा यह है कि विच्छेदन तकनीक डीए और गाबेर्गिक न्यूरॉन्स के साथ-साथ एसएनसी और वीटीए के न्यूरॉन्स सहित पूरे वेंट्रल मिडब्रेन को कैप्चर करती है। अब साक्ष्य से पता चलता है कि एसएनसी के डीए न्यूरॉन्स में पड़ोसी वीटीए15के डीए न्यूरॉन्स की तुलना में कैल्शियम और अंतिम कोशिका मृत्यु के लिए चयनात्मक भेद्यता है । दुर्भाग्य से, भ्रूणीय संस्कृतियों में वीटीए न्यूरॉन्स से एसएनसी अंतर भ्रूणीय मस्तिष्क में इन संरचनाओं को परिभाषित करने के लिए कुछ शारीरिक स्थलों के साथ मुश्किल साबित हुआ है।

हम प्रदर्शित करते हैं कि प्राथमिक संस्कृति तकनीक विषम सहज सीए2 + गतिविधि(चित्रा 1)के मात्राकरण के लिए अनुमति देती है। इसलिए, यह एक आदर्श कोशिका संस्कृति प्रणाली मॉडल है जो टोनिक रूप से सक्रिय कोशिकाओं का अध्ययन करता है, जैसे कि मिडब्रेन के पेसमेकिंग डोपामिनेर्गिक न्यूरॉन्स, नियोकॉर्टिकल न्यूरॉन्स, और सुपर्राचियामैटिक न्यूक्लियस (एससीएन)16, 17,17के गाबएर्गिक न्यूरॉन्स। अधिकांश अनुप्रयोगों में, सीए2 + इमेजिंग इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के समान लौकिक संकल्प को प्राप्त नहीं करता है। इसलिए, यह संभावना है कि एक भी सीए2 + घटना न्यूरोनल एक्शन क्षमता के फटने के अनुरूप है। इसका मतलब यह समझा जा सकता है कि सीए2 + इमेजिंग पेसमेकिंग कोशिकाओं में असामान्य फोड़ गतिविधि के अपेक्षाकृत सटीक उपायों के लिए अनुमति देता है और इसलिए सीए2 +-मध्यस्थताएक्सिटोटॉक्सिक सेल मृत्यु की उच्च सामग्री स्क्रीन के लिए उपयुक्त है।

सहज Ca2+ गतिविधि को प्राप्त करने और बनाए रखने के लिए, प्रोटोकॉल में दो प्रमुख बिंदुओं को संबोधित करना महत्वपूर्ण है। सबसे पहले विच्छेदन के बाद कोशिकाओं का चढ़ाना घनत्व है। प्राथमिक वीएम न्यूरॉन्स के लिए, पिछले अध्ययनों में लगभग 100,000 कोशिकाओं/29,10 हमने प्रोटोकॉल को 200,000 कोशिकाओं/सेमी2के घनत्व को प्लेट करने के लिए अनुकूलित किया है, जो सहज गतिविधि की एक विषम रेंज बनाता है और प्रत्येक कवरस्लिप पर मौजूद डोपामिनेर्गिक वीएम न्यूरॉन्स की संख्या बढ़ाता है। चूंकि विभिन्न पेसमेकिंग न्यूरॉन्स में अलग-अलग फायरिंग गुण16होते हैं, इसलिए सहज गतिविधि के आदर्श स्तर को प्राप्त करने के लिए प्लेटिंग घनत्व को सेल प्रकार के अध्ययन और अनुकूलित करने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। दूसरा AAVs के वायरल संक्रमण के बाद इनक्यूबेशन बार है । चढ़ाना घनत्व की तरह, यह अनुसंधान प्रश्न और AAV के प्रकार के विशिष्ट संदर्भ पर निर्भर किया जा रहा है इस्तेमाल किया जा रहा है । यहां उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट एएवी के लिए, वायरल संक्रमण के बाद इनक्यूबेशन के 5 दिन वांछित प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए आदर्श हैं, जो सीए2 + गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए GCaMP फ्लोरेसेंस में गतिशील परिवर्तनों की अनुमति देता है। कई कारक यह निर्धारित करते हैं कि एक एएवी अपने कार्गो को कितनी जल्दी और कुशलता से व्यक्त करेगा, जिनमें से अधिकांश इस विधि के दायरे से बाहर है, लेकिन संक्षेप में, प्रमोटर गतिविधि और उस दर पर विचार करना महत्वपूर्ण है जिस पर कार्गो प्रोटीन परिपक्व और सिलवटों।

विधि का एक और लाभ यह है कि यह प्रारूप, अभिव्यक्ति वैक्टर, इमेजिंग उपकरण के उपयोग, और वैज्ञानिक प्रश्नों की सीमा में काफी लचीलेपन की अनुमति देता है जिसे संबोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, विधि विशिष्ट प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला में जांच को सक्षम बनाती है जो पीडी में ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्सिटॉक्सिटी और तंत्रिका तंत्र की शिथिलता के अन्य मॉडलों को घेरे हुए हैं। उदाहरण के लिए, ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्ससिटॉक्सिटी में कई रिसेप्टर्स और सिग्नलिंग कैस्केड5शामिल हैं। विधि का उपयोग करके, और जैसा कि चित्रा 1में एएमपीएआर अवरोधक, एनबीक्यूएक्स के साथ प्रदर्शित किया गया है, शारीरिक और आणविक स्तर पर एक्सिटोक्सिक ग्लूटामेट प्रतिक्रिया के विशिष्ट घटकों को काटना संभव है। क़यास, दूसरे दूत प्रणालियों के अवरोधकों का उपयोग करके एक समान दृष्टिकोण का उपयोग उनके योगदान को उत्तेजित करने के लिए निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यहां उपयोग किए जाने वाले एएवी को सेल-विशिष्ट प्रमोटरों या एएवी-व्यक्त ऑप्टोजेनेटिक सेंसर के साथ जीईसीआई व्यक्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जिसका उपयोग न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज जैसे अन्य मापदंडों को मापने के लिए किया जा सकता है।

प्राथमिक भ्रूणीय विच्छेदन और कॉन्फोकल इमेजिंग के अलावा, अधिकांश प्रोटोकॉल बुनियादी प्रयोगशाला कौशल का उपयोग करता है जिन्हें विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए, मॉडल की सीमाओं में भ्रूण विच्छेदन तकनीक की कठिनाई शामिल है, कोशिकाओं को परिपक्वता तक पहुंचने के लिए सुसंस्कृत किया जाना चाहिए, और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप, या इसी तरह के इमेजिंग उपकरण तक पहुंच। विधि के कई लाभ और लचीलापन इन सीमाओं से अधिक है, जिससे तंत्रिका तंत्र विकारों में भूमिका ग्लूटामेट-मध्यस्थता एक्सटॉक्सिकिटी का अध्ययन करने के लिए यह एक आदर्श मॉडल है। अंत में, यह मॉडल एंटी-एपोप्टोटिक प्रभावों और डीए न्यूरॉन स्वास्थ्य को संरक्षित करने की उनकी क्षमता के लिए उपन्यास यौगिकों को स्क्रीन करने के लिए एक प्रभावी उपकरण हो सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

अमेरिकन पार्किंसंस डिजीज एसोसिएशन (एपीडीए) और एनआईएच आर01एनएस115809-01 से अनुदान द्वारा समर्थित रुपये । हम प्राथमिक डोपामिनेर्गिक संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए समय पर गर्भवती चूहों को उपलब्ध कराने के लिए टेक्सास ए एंड एम इंस्टीट्यूट फॉर जीनोमिक मेडिसिन (TIGM) का शुक्रिया अदा करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formalin/PBS VWR 100496-506
10X NA 0.3 water-immersion objective Olympus UMPLFLN10XW
12 mm circular cover glass No. 1 Phenix Research Products MS20-121
20X NA 0.85 oil-immersion objective Olympus UPLSAPO20XO
35 mm uncoated plastic cell culture dishes VWR 25382-348
40X NA 0.3 water-immersion objective Olympus LUMPLFLN40XW
60X NA 1.35 oil-immersion objective Olympus UPLSAPO60XO
Ampicillin (sodium) Gold Bio A-301-25
B-27 supplement ThermoFisher 17504044 50x stock
Binolcular Microscope Kent Scientific KSCXTS-1121
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7030
Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous Sigma-Aldrich 746495
Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase Abcam ab76442
Deoxyribonuclease I (DNase) Sigma-Aldrich DN25
D-glucose, andydrous Sigma-Aldrich RDD016
DMEM + GlutaMAX medium ThermoFisher 10569010 500 mL
Equine serum ThermoFisher 26050088 heat-inactivated
Fiber Optic Illuminator, 100V Kent Scientific KSC5410
Filter System, PES 22UM 250ML VWR 28199-764
Fluoview 1000 confocal microscope Olympus
Fluoview 1200 confocal microscope Olympus
GlutaMAX supplement ThermoFisher 35050061
Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594 Abcam ab150176
Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594 Abcam ab150077
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x ThermoFisher 14175095 500 mL
HEPES VWR 101170-478
HeraCell 150 CO2 incubator Heraeus (ThermoFisher)
ImageJ v1.52e NIH
IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm RWD S12014-13
Kanamycin monosulfate Gold Bio K-120-25
Laminin Sigma-Aldrich L2020
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A7506
L-glutamic acid VWR 97061-634
Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous Sigma-Aldrich M8266
MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz Harvard Apparatus 70-2027
MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm RWD F11014-11
NBQX Hello Bio HB0443
Neurobasal medium ThermoFisher 21103049 500 mL
Normal goat serum (NGS) Abcam ab7481
Origin 2020 OriginLab
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40 Addgene 100837-AAV1 Titer: 1.00E+13 gc/ml
Papain Worthington Biomedical Corporation LS003126
Penicillin streptomycin ThermoFisher 15140122 10,000 U/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) 1x ThermoFisher 10010049 500 mL
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P4832
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957
Potassium Chloride (KCl), anhydrous Sigma-Aldrich 746436
Pump Head Tubing Pieces For MPII Harvard Apparatus 55-4148
Rabbit monoclonal anti-caspase-3 Abcam ab32351
Sodium Chloride (NaCl), anhydrous Sigma-Aldrich 746398
Sucrose Sigma-Aldrich S7903 BioXtra, ≥99.5% (GC)
Time-pregnant female C57BL/6 mice Texas A&M Institue for Genomic Medicine
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 500 mL
Wide-bore blue pipette tips P1000 VWR 83007-380

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References

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प्राथमिक माउस मिडब्रेन न्यूरॉन्स में सहज Ca<sup>2 +</sup> फ्लक्स और उनके डाउनस्ट्रीम प्रभावों की मात्रा निर्धारित करना
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Bancroft, E. A., Srinivasan, R.… More

Bancroft, E. A., Srinivasan, R. Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons. J. Vis. Exp. (163), e61481, doi:10.3791/61481 (2020).

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