Methodenartikel

Sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell für ischämische Netzhauterkrankungen bei Nagetieren

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DOI:

10.3791/61482

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16. September 2020

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1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University & Tampere University Hospital, 2Experimentica Ltd, 3Eye Centre, Tampere University Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die sauerstoffinduzierte Retinopathie (OIR) kann verwendet werden, um ischämische Netzhauterkrankungen wie Retinopathie der Frühreife und proliferative diabetische Retinopathie zu modellieren und als Modell für Proof-of-Concept-Studien zur Bewertung antiangiogener Medikamente für neovaskuläre Erkrankungen zu dienen. OIR induziert eine robuste und reproduzierbare Neovaskularisation in der Netzhaut, die quantifiziert werden kann.

Zusammenfassung

Eines der am häufigsten verwendeten Modelle für ischämische Retinopathien ist das sauerstoffinduzierte Retinopathie-Modell (OIR). Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle für die INduktion des OIR-Modells und deren Auslesungen bei Mäusen und Ratten. Die retinale Neovaskularisation wird in OIR induziert, indem Nagetierwelpen entweder Hyperoxia (Mäuse) oder abwechselnden Hyperoxia- und Hypoxie-Werten (Ratten) aussetzen. Die primären Auslesungen dieser Modelle sind die Größe der neovaskulären (NV) und avaskulären (AVA) Bereiche in der Netzhaut. Dieses präklinische In-vivo-Modell kann verwendet werden, um die Wirksamkeit potenzieller antiangiogener Medikamente zu bewerten oder um die Rolle bestimmter Gene in der retinalen Angiogenese durch den Einsatz genetisch manipulierter Tiere zu thematisieren. Das Modell weist eine gewisse Belastungs- und herstellerspezifische Variation in der OIR-Induktion auf, die bei der Gestaltung der Experimente berücksichtigt werden sollte.

Einleitung

Zuverlässige und reproduzierbare experimentelle Modelle sind erforderlich, um die Pathologie hinter angiogenen Augenerkrankungen zu untersuchen und neue Therapeutika für diese verheerenden Krankheiten zu entwickeln. Die pathologische Angiogenese ist das Kennzeichen für die nasse altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und für viele ischämische Netzhauterkrankungen, darunter Retinopathie der Frühreife (ROP), proliferative diabetische Retinopathie (PDR) und Netzhautvenenverschluss (RVO)1,2,3,4. Menschliche und Nagetier Netzhaut folgen einem ähnlichen Muster der Entwicklung, da sowohl menschliche und Nagetier Netzhaut gehören zu den letzten Geweben, die vaskularisiert werden. Bevor sich die Netzhautvaskulatur vollständig entwickelt hat, erhält die Netzhaut ihre Nährstoffzufuhr aus der hyaloiden Vaskulatur, die wiederum nachlässt, wenn die Netzhautvaskulatur beginnt,1,2zu entwickeln. Bei der menschlichen, retinalen Gefäßentwicklung wird vor der Geburt abgeschlossen, während bei Nagetieren das Wachstum der netzretinalen Vaskulatur nach der Geburt auftritt. Da die retinale Gefäßentwicklung postnatal bei Nagetieren auftritt, bietet sie ein ideales Modellsystem, um die Angiogenese2,3zu untersuchen. Die neugeborenen Nagetiere haben eine avaskuläre Netzhaut, die sich allmählich entwickelt, bis die vollständige vaskuläre Netzhautentwicklung bis zum Ende der dritten postnatalen Woche4erreicht ist. Die wachsenden Blutgefäße der neonatalen Maus sind plastisch, und sie durchlaufen Regression während Hyperoxia Stimulus5.

ROP ist die Hauptursache für Kinderblindheit in westlichen Ländern, da es fast 70% der Frühgeborenen mit Geburtsgewicht unter 1.250 g6,7betrifft. ROP tritt bei Frühgeborenen auf, die geboren werden, bevor Netzhautgefäße ihr normales Wachstum vollenden. ROP schreitet in zwei Phasen voran: In Phase I verzögert die Frühgeburt das retinale Gefäßwachstum, wobei nach Phase II die unvollendete Vaskularisation der sich entwickelnden Netzhaut Hypoxie verursacht, die die Expression angiogener Wachstumsfaktoren induziert, die das Wachstum neuer und abnormaler Blutgefäße stimulieren8. Das OIR-Modell ist ein weit verbreitetes Modell, um die Pathophysiologie von ROP und anderen ischämischen Retinopathien zu studieren sowie neuartige Wirkstoffkandidaten2,3,9zu testen. Es wird weithin als reproduzierbares Modell für die Durchführung von Proof-of-Concept-Studien für potenzielle antiangiogene Medikamente für Augen- und Nicht-Augenerkrankungen angesehen. Die beiden Nagetiermodelle, d.h. Maus und Ratte OIR unterscheiden sich in ihrem Modell Induktion und Krankheit Phänotyp. Das Rattenmodell imitiert den ROP-Phänotyp genauer, aber das Mausmodell bietet ein robusteres, schnelleres und reproduzierbareres Modell für die retinale Neovaskularisation (NV). Im Mausmodell entwickelt sich NV zur zentralen Netzhaut. Diese pathologische Auslesung ist wichtig in pharmakologischen Wirksamkeitsstudien für viele ischämische Retinopathien, wie PDR, RV und exsudative AMD sowie für nicht-okuläre, angiogene Erkrankungen wie Krebs. Darüber hinaus macht die Verfügbarkeit von genetisch manipulierten (transgenen und Knockout) Mäusen das Maus-OIR-Modell zu einer beliebteren Option. Allerdings erzeugt weder das OIR-Modell der Maus noch der Ratte eine Netzhautfibrose, die typisch für menschliche Krankheiten ist.

Das Verständnis, dass ein hoher Sauerstoffgehalt zur Entwicklung von ROP in den 1950er Jahren10,11 führte zur Entwicklung von Tiermodellen. Die ersten Studien über die Wirkung von Sauerstoff auf die Netzhautvaskulatur wurden 195012,13,14 durchgeführt und bis in die 1990er Jahre gab es viele Verfeinerungen des OIR-Modells. Die Forschung von Smith et al. im Jahr 1994 setzte einen Standard für das aktuelle Maus-OIR-Modell, das Hyaloidopathie von Retinopathietrennt 15. Eine breite Anwendung der Methode zur Quantifizierung von Vaso-Obliteration und pathologischer NV durch Connor et al. (2009) steigerte seine Popularitätweiter 16. In diesem Modell werden Mäuse bei 75% Sauerstoff (O2) für 5 Tage bei P7 platziert, gefolgt von 5 Tagen unter normoxischen Bedingungen. Hyperoxia von P7 bis P12 bewirkt, dass die Netzhautvaskulatur in der zentralen Netzhaut zurückgeht. Nach der Rückkehr zu normoxischen Bedingungen wird die avaskuläre Netzhaut hypoxisch (Abbildung 1A). Aufgrund der hypoxischen Reize der avaskulären zentralen Netzhaut sprießen einige der retinalen Blutgefäße in Richtung des Glaskörpers und bilden präretinale NV, sogenannte präretinale Büschel2,3. Diese Büschel sind unreif und hyperpermeable. Die NV-Spitzenmenge bei P17, danach geht sie zurück. Die Netzhaut ist vollständig reaskularisiert und NV wird vollständig durch P23 - P25 (Abbildung 2A)2,3zurückgedrängt.

Das OIR-Modell der Ratte (mit unterschiedlichenO2-Werten)wurde erstmals in den 1990er Jahren beschrieben und zeigte, dass unterschiedlicheO2-Werte bei 80 % und 40 % eine ausgeprägtere NV verursachen als unter 80 %O2 konstante Exposition17. Später wurde entdeckt, dass das intermittierende Hypoxie-Modell, bei demO2 aus Hyperoxia (50%) Hypoxie (10-12 %), verursacht noch mehr NV als das 80/40% O2 Modell18. Im 50/10%-Modell sind Rattenwelpen 20 % lang 50 % ausgesetzt, gefolgt von 24 Stunden in 10 % O2. Diese Zyklen werden bis P14 fortgesetzt, wenn die Rattenwelpen an normoxische Bedingungen zurückgegeben werden (Abbildung 1B). Wie bei menschlichen ROP-Patienten entwickeln sich im Rattenmodell die avaskulären Bereiche aufgrund eines unreifen retinalen Gefäßplexus zur Peripherie der Netzhaut (Abbildung 3).

In beiden Modellen sind die Hauptparameter, die normalerweise quantifiziert werden, die Größe von AVA und NV. Diese Parameter werden in der Regel von retinalen flachen Halterungen analysiert, wo die Endothelzellen mit4,16beschriftet sind. Zuvor wurde die Menge an präretinalen NV aus Netzhautquerschnitten durch Zählen von Blutgefäß- oder Gefäßzellkernen, die sich über der inneren grenzenden Membran bis hin zu Glaskörpern ausdehnten, ausgewertet. Die Hauptbeschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass es nicht möglich ist, die AVAs zu quantifizieren.

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Protokoll

Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Finnischen Tierschutzkommission (Protokollnummer ESAVI/9520/2020 und ESAVI/6421/04.10.07/2017) genehmigt.

1. Versuchstiere und Maus OIR Modell Induktion

HINWEIS: Verwenden Sie zeitgepaarte Tiere, z. B. häufig verwendete C57BL/6J-Mäuse, um Welpen am selben Tag zur Welt zu bringen. Verwenden Sie Pflegedämme, z. B. 129 Stamm (129S1/SvImJ oder 129S3/SvIM) laktierende Dämme, um die Welpen während und nach der Induktion von Hyperoxia zu pflegen. Alternativ können Sie auch sicherstellen, dass zusätzliche laktierende Dämme zur Verfügung stehen, falls die Pflegedämme aufgrund von Erschöpfung ausgetauscht werden müssen. Beschränken Sie die Wurfgröße auf 6-7 Welpen für jeden Damm, wenn C57BL/6J Mäuse/Dams verwendet werden (wenn die Würfe größer sind als die Welpen tendenziell eine eingeschränkte Gewichtszunahme haben)16.

  1. Zeichnen Sie das Gewicht der Tiere vor und nach der Hyperoxia-Induktion und zum Zeitpunkt des Opfers auf.
  2. Stellen Sie sicher, dass es genügend Nahrung auf dem Boden des Käfigs gibt, damit die Dämme einen einfachen Zugang zu Nahrung haben.
  3. Fügen Sie Sodakalk mit Farbanzeige an der Unterseite der Kammer hinzu, um überschüssiges CO2 zu absorbieren, wenn kein Filtersystem verwendet wird.
  4. Überwachen Sie die Luftfeuchtigkeit und Temperatur in der Kammer und halten Sie die Luftfeuchtigkeit zwischen 40 und 65%. Erhöhen Sie die Feuchtigkeit der Kammer, wenn nötig, indem Sie Geschirr mit Wasser auf den Boden der Kammer (z.B. Petrischalen) legen.
  5. Kalibrieren Sie den O2-Sensor mit 100%O2 und normaler Raumluft.
  6. Legen Sie die P7-Mäuse in eine Kammer und richten Sie die O2-Ebene auf 75% ein. Halten Sie die Mäuse in der Kammer für 5 Tage, bis P12. Vermeiden Sie das Öffnen der Kammer während der Hyperoxia-Induktion. Überprüfen Sie den Gasdruck des O2-Zylinders und ersetzen Sie den Zylinder bei Bedarf. Überwachen Sie die Tiere während der Induktion.
  7. Nehmen Sie die Mauskäfige aus der Kammer und wiegen Sie alle Welpen. Gruppieren Sie die Welpen nach dem Gewicht, so dass jede Versuchsgruppe eine ähnliche Gewichtsverteilung in Welpen hat.

2. Versuchstiere und Ratten-OIR-Modellinduktion (mit halbgeschlossenem System)

HINWEIS: Verwenden Sie zeitgebundene Tiere, um die Welpen am selben Tag zur Welt zu bringen. Verwenden Sie für Ratten-OIR eine erhöhte Wurfgröße von ca. 18 Welpen/Damm, um eine ausreichende NV-Induktion im Rattenmodell zu erhalten. Pool Welpen aus mehreren Würfen, um genügend Welpen zu jedem Wurf zu erhalten.

  1. Zeichnen Sie das Gewicht der Tiere vor und nach der Induktion und zum Zeitpunkt des Opfers auf.
  2. Stellen Sie sicher, dass es genügend Nahrung auf dem Boden des Käfigs gibt, damit die Dämme einen einfachen Zugang zu Nahrung haben.
  3. Fügen Sie Sodakalk mit Farbanzeige an der Unterseite der Kammer hinzu, um überschüssiges CO2 zu absorbieren, wenn kein Filtersystem verwendet wird.
  4. Überwachen Sie die Luftfeuchtigkeit und Temperatur in der Kammer. Absorbieren Sie zusätzliche Feuchtigkeit (erzeugt von mehreren Ratten) durch Zugabe von Kieselgel auf der Unterseite der Kammer.
  5. Kalibrieren Sie den O2-Sensor mit 100% N2 und normaler Raumluft.
  6. Legen Sie die Ratten in die Kammer bei P0 (wenige Stunden nach der Geburt). Stellen Sie den O2-Pegel auf 50% ein und schließen Sie den O2-Zylinder für 24 h an die Kammer an. Danach schalten Sie die Einstellungen auf 10% O2 und verbinden Stickstoff (N2) Zylinder mit der Kammer für 24 h. Fahren Sie 14 Tage lang mit dem 24-Stunden-Radverkehr zwischen 50% und 10% O2-Stufen fort.
  7. Überwachen Sie den Gasverbrauch und das Wohlbefinden der Tiere während der Studie. Öffnen Sie die Kammer während des Wechsels zwischen 50/10%O2 und fügen Sie bei Bedarf mehr Nahrung und Wasser hinzu. Ändern Sie die Käfige der Tiere, um sie während der Induktion zu reinigen.
  8. Nehmen Sie die Rattenkäfige aus der Kammer und wiegen Sie alle Welpen. Gruppieren Sie die Welpen nach dem Gewicht, so dass jede versuchsweise Gruppe eine ähnliche Gewichtsverteilung in den Welpen hat.

3. Arzneimittelanwendung (optional)

HINWEIS: Häufig verwendete Arzneimittelverabreichungsroute in OIR erfolgt durch intravitreale Behandlung (ivt), bei P12-P14 für Mäuse und bei P14 für Ratten. Bestimmen Sie den Behandlungstag basierend auf dem Versuchsaufbau. Wenn mehrere Würfe von Welpen in Experimenten verwendet werden, teilen Sie die Behandlungsgruppen, um Tiere von allen Würfen zu haben. Vorzugsweise, injizieren Sie das Medikament auf nur ein Auge, und halten Sie das kontralaterale Auge als Kontrolle.

  1. Wiegen Sie die Tiere und machen Sie Identifikationszeichen an Schwanz und/oder Ohr.
  2. Anästhesieren Sie das Tier entweder mit injizierbarer Anästhesie (z. B. Mischung aus Ketamin und Medetomidin, 30 mg/kg und 0,4 mg/kg für Mäuse) oder mit Inhalationsanästhesie (Isofluran bei 2-3,5% Isofluran und 200-350 ml/min Luftstrom). Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Zehen kneifen. Halten Sie das Tier während der Behandlung auf einem Heizkissen.
  3. Für lokalanästhesien, tragen Sie einen Tropfen Schmerzmittel auf das Augenlid. Öffnen Sie das Augenlid vorsichtig mit Zange, bevor Sie die ivt durchführen, wie Mäuse und Ratten öffnen ihre Augen um P14. Tragen Sie einen Tropfen Schmerzmittel (z. B. Oxybuprocainhydrochlorid) auf die Hornhaut auf.
  4. Tragen Sie einen Tropfen Jod auf, bevor Sie die ivt-Injektion durchführen.
  5. Für die ivt-Injektion eine Glasspritze mit einer 33-34 G Nadel verwenden. Drücken Sie die Augenlider nach unten und grasen Sie den Augapfel mit Zangen. Machen Sie die Injektion nachtränk an den Limbus, etwa in 45° Winkelnadel, die auf den Sehnerv zeigt.
  6. Vermeiden Sie es, mehr als 1,0 l in den intravitrealen Raum zu injizieren. Halten Sie die Nadel an Ort und Stelle für 30 s nach der Injektion des Medikaments, um Reflux der injizierten Lösung zu vermeiden.
  7. Untersuchen Sie das Auge (z. B. mit einem Ophthalmoskop) auf Komplikationen wie Blutungen oder Netzhautschäden nach dem Entfernen der Nadel. Nach der Injektion antibiotikaische Salbe auf Hornhaut auftragen.
    HINWEIS: Das ivt-Injektionsvolumen für Mäuse sollte 0,5 – 1,0 l betragen.
  8. Umkehren Sie die Anästhesie (z.B. mit einem 2-Antagonisten für Medetomidin (2,5 mg/kg) und geben Sie den Welpen in den Käfig zurück. Den Müll normalerweise bis zum Ende der Studie unterbringen.

4. In-vivo-Bildgebung und Elektroretinographie (optional)

  1. Auf Wunsch führen Sie während der Nachbeobachtungszeit in vivo-Bildgebung an lebenden Tieren durch, um Veränderungen aufzuzeichnen, die sich in der Netzhaut während der angiogenen Reaktionen entwickeln. Führen Sie beispielsweise fluorescein-Angiographie (FA) oder Scanning-Laser-Konfokalmikroskopie19 durch, um die Vaskulatur zu visualisieren (Abbildung 4). Verwenden Sie die optische Kohärenztomographie (SD-OCT) der Spektraldomäne, um Netzhautschichten in vivo zu visualisieren (Abbildung 4).
  2. Auf Wunsch untersuchen Sie funktionelle Veränderungen in verschiedenen Netzhautzellpopulationen nach der INduktion durch DIE Verwendung der Elektroretinographie (ERG) (Abbildung 5).

5. Gewebesammlung und Vorbereitung von Retinal-Flachhalterungen

HINWEIS: Sammeln Sie das Gewebe gemäß der gewünschten Forschungshypothese. Bei Mäusen die Proben z.B. bei P12 (zur Untersuchung der Vaso-Obliteration nach der hyperoxischen Phase) oder in der hypoxischen Periode (P13-P17) sammeln. Sammeln Sie die Maus-OIR-Samples bei P17, dem häufigsten Zeitpunkt für die Probenahme, um den Peak in NV-Menge zu erkennen. In Ratte OIR, sammeln Sie die Proben bei P18-P21, um die höchste Menge an NV zu beobachten (Abbildung 3).

  1. Wiegen Sie die Tiere vor der Probenahme.
  2. Um die Netzhautvaskulatur zu kennzeichnen, können tief anästhesierte Tiere mit FITC-Dextran transkardial durchlässig werden. (Alternativ färben Sie die Retinal flach mit Isolectin später).
  3. Opfern Sie die Tiere entweder mit einer Überdosierung von Anästhesiemedikamenten (z. B. Mischung aus Ketamin und Medetomidin, 300 mg/kg und 4 mg/kg für Mäuse) oder CO2-Inhalation.
  4. Sammeln Sie die Augen der Tiere, indem Sie hinter dem Augapfel mit gekrümmten Zangen greifen, schneiden Sie das Gewebe um die Augen und heben Sie das Auge aus der Umlaufbahn.
  5. Inkubieren Sie die Augäpfel in frisch gemachtem, gefiltertem 4% Paraformaldehyd (in phosphatgepufferter Saline, PBS) für 1-4 h. Entfernen Sie die Fixierung und waschen Sie die Augäpfel 3 x 10 min mit PBS. Sezieren Sie die Netzhaut sofort oder lagern Sie sie in PBS bei +4 °C.
    VORSICHT: Paraformaldehyd ist durch Einatmen, Hautkontakt und Verschlucken giftig. Bitte lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt, bevor Sie damit arbeiten.
    HINWEIS: Nehmen Sie während der Probenahme oder einer Phase der Gewebeverarbeitung keinen Druck auf den Augapfel auf, um eine Netzhautablösung zu vermeiden, wenn Querschnitte von ganzen Augäpfeln durchgeführt werden.
  6. Bereiten Sie retinale flache Halterungen vor, um die Menge an NV und die Größe von AVAs zu quantifizieren. Alternativ können Sie die Augäpfel/Retinas für die Histologie oder RNA- oder Proteinanalyse verarbeiten. Sezieren Sie die Netzhaut unter einem Stereomikroskop mit Mikroschere und Zange.
    1. Legen Sie den Augapfel in PBS, um ihn feucht zu halten und den Augapfel am Limbus mit einer Nadel (23G) zu durchstechen und mit einer gekrümmten Mikroschere um den Limbus zu schneiden, um Iris und die Hornhaut zu entfernen.
    2. Legen Sie die Spitze der Schere vorsichtig zwischen Sklera und Netzhaut und schneiden Sie Sklera in Richtung des Sehnervs. Tun Sie das gleiche auf der anderen Seite des Augapfels, und schneiden/reißen Sie die Sklera sorgfältig, bis der Netzhautbecher ausgesetzt ist. Ziehen Sie die Linse aus der Netzhautschale und fügen Sie PBS in die Tasse.
    3. Entfernen Sie alle Hyaloidgefäße, Glaskörper und Schmutz, ohne die Netzhaut zu beschädigen. Waschen Sie die Netzhaut, indem Sie PBS in die Netzhauttasse einfügen. Führen Sie vier Einschnitte (bei 12, 3, 6 und 9 Uhr) zur Netzhaut mit gerader Mikroschere aus, um eine blütenähnliche Struktur zu bilden. Optional können Sie die Schnitte mit chirurgischer Klinge vor der Montage der Proben vornehmen. Heben Sie die Netzhaut mit einem weichen Pinsel auf eine well-Platte für die Färbung.
  7. Beschriften Sie die Netzhautvaskulatur mit Isolectin B4, das die Oberfläche von Endothelzellen färbt (wenn die Tiere nicht mit FITC-Dextran durchdrungen waren). Inkubieren Sie die Netzhaut im Blockierpuffer (10% NGS + 0,5% Triton in TBS) für 1 h und waschen Sie mit 1% NGS + 0,1% Triton in TBS für 10 min. Inkubieren Sie die Netzhaut mit fluoreszierendem Farbstoff konjugiertes Isolectin B4 (5-10g/ml) in 1% NGS + 0,1% Triton in TBS über Nacht bei +4 °C, während sie vor dem Licht geschützt sind.
    HINWEIS: Beschriften Sie auf Wunsch andere Zellen wie Entzündungszellen und Pericyten mit spezifischen Antikörpern.
  8. Waschen Sie die Netzhaut 3x für 10 min mit 1% NGS + 0,1% Triton in TBS und heben Netzhaut auf einem mikroskopischen Schiebeschlitten, innere Netzhaut nach oben gerichtet. Verteilen Sie die Netzhaut vorsichtig mit weichem Pinsel und entfernen Sie alle verbleibenden Hyaloidgefäße oder Schmutz. Fügen Sie das Montagemedium zu einem Decksschlupf hinzu und legen Sie es auf die Netzhaut. Netzhaut bei +4 °C lagern und vor Licht schützen.

6. Analyse der Flachhalterungen

  1. Nehmen Sie Bilder der retinalen flachen Halterungen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit 10-fachem Objektiv auf. Fokus simpere sich auf den oberflächlichen Gefäßplexus und die präretinale Neovaskularisation. Erstellen Sie ein Kachelscanbild, um die gesamte Netzhaut zu erfassen und die Kachelscans zusammenzuführen
  2. Quantifizieren Sie die Bilder, indem Sie die AVAs, den NV-Bereich und den gesamten Netzhautbereich mit einem Bildverarbeitungsprogramm messen (siehe Tabelle der Materialien).
    1. Zeichnen Sie die AVAs und den gesamten Netzhautbereich mit einem Freihand-Zeichnungswerkzeug und wählen Sie die neovaskulären Bereiche mit einem Auswahlwerkzeug aus. Die Software misst die Bereiche, die für Pixel von Interesse sind, und die AVA- und NV-Bereiche (ausgedrückt in Pixel) können verwendet werden, um ihren Prozentsatz im Verhältnis zur gesamten Netzhautfläche zu berechnen. Außerdem stehen einige Software-Tools zur Quantifizierung von NV zur Verfügung.
      HINWEIS: Kürzlich wurden ein Open-Source-Programm zur Quantifizierung von Schlüsselwerten von OIR-Bildern mit Deep Learning-Neuralnetzen eingeführt und bieten ein zuverlässiges Werkzeug für die reproduzierbare Quantifizierung von retinaler AVA und NV (z. B. https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.
  3. Wenn Sie Antikörper für den immunhistochemischen Nachweis einzelner Zellpopulationen verwenden, quantifizieren Sie die Anzahl der gefärbten Zellen (wie Mikroglia, Abbildung 2B) von den retinalen Flachhalterungen von Hand oder auf Wunsch durch automatisierte Bildanalysesysteme.

7. Statistik

  1. Analysieren Sie normal verteilte Daten nach Student es t Test oder One-Way ANOVA, je nach Dunnetts oder Tukeys Mehrfachvergleichstest. Verwenden Sie nichtparametrische Tests wie Mann-Whitney U-Test oder Kruskal Wallis-Test für nicht normal verteilte Daten. Berücksichtigen Sie die statistisch signifikanten Unterschiede auf der Ebene P < 0,05.

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Ergebnisse

Das Hauptergebnis des Modells ist der vaskuläre Phänotyp: die Größe der AVAs und die Menge an NV. Im Maus-OIR-Modell tritt die Vaso-Obliteration in der zentralen Netzhaut auf (Abbildung 2A), während sie sich im Rattenmodell in der Peripherie entwickelt, d.h. ähnlich wie der menschliche ROP22 (Abbildung 3A). Dies liegt daran, dass sich der oberflächliche Gefäßplexus bereits entwickelt hat, wenn Mäuse Hyperoxie ausgesetzt sind, während im R...

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Diskussion

Die Schwere des Krankheitsphänotyps hängt sowohl vom Stamm als auch vom Anbieter sowohl in den MOper- als auch in der Muhr der OIR-Modelle23ab. Dies deutet darauf hin, dass es eine breite genotypische Variabilität in der Pathologieentwicklung gibt. Im Allgemeinen entwickeln pigmentierte Nagetiere einen schwereren Phänotyp als die Albino-Nagetiere. Zum Beispiel, die netzhautvaskulatur von albino BALB/c revaskularisiert schnell nach Hyperoxien und entwickelt nV überhaupt nicht24

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Offenlegungen

Die Autoren Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD, und Rubina Thapa sind Mitarbeiter der Experimentica Ltd.

Der Autor Giedrius Kalesnykas, PhD, ist Mitarbeiter (Präsident und Chief Executive Officer) und Aktionär der Experimentica Ltd., die Vertragsforschungsdienstleistungen mit präklinischen OIR-Modellen anbietet, die in diesem Artikel verwendet werden.

Tero Järvinen, M.D., PhD, und Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., PhD, haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen und Anne Kankkunen für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von der Akademie Finnlands, der Päivikki and Sakari Sohlberg Foundation, der Tampere Tuberculosis Foundation, der Finnischen Medizinischen Stiftung, der Pirkanmaa Hospital District Research Foundation und dem Tampere University Hospital Research Fund finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
33 Gauge, Small Hub RN NadelHamilton Company7803-05, 10mm, 25°;, PS4Für intravitreale Injektion
Adobe PhotoshopAdobe Inc.Für die Bildanalyse
Luftpumpe air100Eheim GmbH & Co. KG.143207Für die Inhalationsanästhesie
Anästhesiegerät 410 APUniventor Ltd.2360309Für die Inhalationsanästhesie
AnalaR NORMAPUR NatronkalkVWR International Ltd22666.362Für die CO2-Kontrolle während der Modelleinleitung
Attane Vet 1000 mg/gVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 17 05 79Für die Inhalationsanästhesie
BürsteZur Vorbereitung von flachen Halterungen
KohlendioxidgasZum Opfern
Celeris D430 ERG SystemDiagnosys LLC121Für in vivo ERG
ZellkulturschalenGreiner Bio-One International GmbH664 160Für die Aufbereitung von Flat
Mounts Cepetor Vet 1 mg/mLVET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 08 78 96Für die Anästhesie
DeckgläserThermo Fisher Scientific15165452Zur Aufbereitung von Flat Mounts
O2-gesteuerter InVivo-Schrank, Aninalfiltrarian-System und LuftentfeuchterCoy LaborprodukteGeschlossenes System für die Induktion von Krankheitsmodellen, optional für halbgeschlossenes System
E702 O2-SensorBioSphenix, Ltd.E207, 1801901Für die Messung des Sauerstoffgehalts
Envisu R2200 Optischer Kohärenztomograph im Spektralbereich (SD-OCT)Bioptigen, Inc.BPN000668Für in vivo Bildgebung
von AugenspeerenBeaver-Visitec International, Inc.0008685Für die intravitreale Injektion und in vivo Bildgebung
Flexilux 600LL KaltlichtquelleMikron11140Für die intravitreale Injektion oder Gewebeentnahme
Fluoreszein-NatriumsalzMerck KGaAF6377-100GFür in vivo Bildgebung
Gasabsaugeinheit (+Doppeltes 3-Wege-Ventil, Maus- und Ratten-Gesichtsmasken, UNOsorb-Filter)UNO Roestvaststaal BVGEX 17015249Für die Inhalationsanästhesie
Glasspritze, Modell 65 RNHamilton Company7633-01Für die intravitreale Injektion
HRA2 Retina Angiograph (FA)Heidelberg Engineering GmbHSpec-KT-05488Für in vivo Bildgebung
Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 KonjugatThermo Fisher ScientificI21411Zur Markierung von retinalen Gefäßen auf flache Halterungen
Ketaminol Vet 50 mg/mLIntervet International B.V.vnr 51 14 85Für die Anästhesie
Medizinisches SauerstoffgasFür die Induktion von Krankheitsmodellen
Mäuse C57BL/6JRjJanvier LabsAuch andere Stämme möglich
ObjektträgerThermo Fisher ScientificJ1800AMNZZur Präparation von flachen Halterungen
Minims Povidon Jod 5% (Einheit)Bausch & Lomb U.K Limitedvnr 24 11 304Für die intravitreale
Injektion StickstoffgasFür die Induktion von Krankheitsmodellen (Ratte)
Oftan Chlora 10 mg/gSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 01 11Zur intravitrealen Injektion
Oftan Metaoksedrin 100 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 03 43Für in vivo ERG
Oftan Obucain 4 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 55 03 50Zur intravitrealen Injektion
Oftan Tropicamid 5 mg/mlSanten Pharmaceutical Co., Ltd.vnr 04 12 36Für in vivo Bildgebung
ProOx Modell 110 O2-Controller und TierkammerBioSphenix, Ltd.803Für die Induktion von Krankheitsmodellen, halbgeschlossenes System, optional für geschlossene Systeme
ProOx Modell P360 O2-Controller und TierkammerBioSphenix, Ltd.538Für die Induktion von Krankheitsmodellen, halbgeschlossenes System, optional für geschlossenes System
Ratten CD(SD)Charles River LaboratoriesAuch andere Stämme möglich
Revertor 5 mg/mL VET MEDIC ANIMAL HEALTH OYvnr 13 04 97Für die Anästhesieumkehr
KieselgelZur Feuchtigkeitskontrolle während der Modelleinleitung
Systane Ultra 10mlAlconTamro 2050250Für die Hydratation des Auges
Systane Ultra Einheit 0,7 mlAlconTamro 2064871Für die Hydratation des Auges
TransferpipetteThermo Fisher Scientific1343-9108Für die Vorbereitung von flachen Halterungen
VENTI-Line VL 180 PRIME TrockenschrankVWRVL180S 170301Zum Trocknen von Kieselgel
VisiScope SZT350 StereomikroskopVWR481067Für die intravitreale Injektion oder Gewebeentnahme

Referenzen

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