Phosphoproteomic Strategie zur Profilierung osmotischer Stresssignalisierung bei Arabidopsis

Chuan-Chih Hsu; Chia-Feng Tsai; W. Andy Tao; Pengcheng Wang

doi:10.3791/61489

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Methodenartikel

Phosphoproteomic Strategie zur Profilierung osmotischer Stresssignalisierung bei Arabidopsis

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DOI:

10.3791/61489

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25. Juni 2020

Chuan-Chih Hsu¹^,³ , Chia-Feng Tsai² , W. Andy Tao³^,⁴ , Pengcheng Wang⁵

¹Department of Plant Biology, Carnegie Institute for Science, ²Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University, ³Department of Biochemistry, Purdue University, ⁴Department of Chemistry, Purdue University, ⁵Shanghai Center for Plant Stress Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Chinese Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Präsentiert wird hier ein phosphoprotemischer Ansatz, nämlich Stop-and-Go-Extraktionsspitze Phosphoproteomic, die hohen Durchsatz und tiefe Abdeckung von Arabidopsis phosphoproteome bietet. Dieser Ansatz beschreibt den Überblick über osmotische Stresssignale in Arabidopsis.

Zusammenfassung

Die Proteinphosphorylierung ist entscheidend für die Regulierung der Enzymaktivität und der Genexpression unter osmottischen Bedingungen. Die Massenspektrometrie (MS)-basierte Phosphoproteomik hat die Art und Weise der Untersuchung der Pflanzensignaltransduktion verändert. Die Anforderung vieler Ausgangsstoffe und eine längere MS-Messzeit, um die Tiefe der Abdeckung zu erreichen, war jedoch der begrenzende Faktor für die Studie mit hohem Durchsatz globaler phosphoprotemischer Veränderungen in Pflanzen. Um die Empfindlichkeit und den Durchsatz von Pflanzenphosphoproteomik zu verbessern, haben wir einen Stop-and-Go-Extraktionsansatz (Stufen-)Spitzen-basierte Phosphoproteomik-Ansatz in Verbindung mit der Tandem Mass Tag (TMT)-Kennzeichnung für die schnelle und umfassende Analyse der Pflanzenphosphorylierungsstörung als Reaktion auf osmotischen Stress entwickelt. Unter Ausnutzung der Einfachheit und des hohen Durchsatzes der Bühnenspitzentechnik dauert das gesamte Verfahren etwa eine Stunde, indem zwei Tipps verwendet werden, um die Phosphopeptidanreicherung, Fraktionierung und Probenreinigungsschritte zu beenden, was auf eine benutzerfreundliche und hohe Effizienz des Ansatzes hindeutet. Dieser Ansatz bietet nicht nur eine eingehende Pflanzenphosphoproteomik-Analyse (> 11.000 Phosphopeptid-Identifikation), sondern zeigt auch die überlegene Trenneffizienz (< 5% Überlappung) zwischen benachbarten Fraktionen. Darüber hinaus wurde Multiplexing mit TMT-Etikettierung erreicht, um die phosphoproteomischen Veränderungen von Wildtyp- und Snrk2-Decuple-Mutantenpflanzen zu quantifizieren. Dieser Ansatz wurde erfolgreich verwendet, um die Phosphorylierungsereignisse von Raf-ähnlichen Kiinasen als Reaktion auf osmotischen Stress zu enthüllen, der Licht auf das Verständnis der frühen osmotischen Signalisierung in Landpflanzen wirft.

Einleitung

Hoher Salzgehalt, niedrige Temperatur und Trockenheit verursachen osmotische Spannungen, was ein wichtiger Umweltfaktor ist, der die Pflanzenproduktivität beeinflusst¹^,². Proteinphosphorylierung ist eine der bedeutendsten posttranslationalen Modifikationen, die Signalwahrnehmung und Transduktion in der pflanzlichen Reaktion auf osmotischen Stress³^,⁴^,⁵vermitteln. SNF1-bezogene Proteinkinase 2s (SnRK2s) sind an der osmotischen Stresssignalisierung⁶beteiligt. Neun von zehn Mitgliedern der SnRK2-Fa....