Methodenartikel

Ein Suppressor-Bildschirm zur Charakterisierung genetischer Links, die die chronologische Lebensdauer in Saccharomyces cerevisiae regulieren

DOI:

10.3791/61506

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17. September 2020

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1Department of Biology, William Paterson University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier ist ein Protokoll, um genetische Wechselwirkungen durch eine erhöhte Kopierzahl Suppressor-Bildschirm in Saccharomyces cerevisiaezu identifizieren. Diese Methode ermöglicht es Forschern, Suppressoren in kurzlebigen Hefemutanten zu identifizieren, zu klonen und zu testen. Wir testen den Effekt der Erhöhung der Kopierzahl von SIR2 auf die Lebensdauer in einem autophagy null Mutant.

Zusammenfassung

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Altern ist die zeitabhängige Verschlechterung der normalen biologischen Prozesse eines Organismus, die die Wahrscheinlichkeit des Todes erhöht. Viele genetische Faktoren tragen zu Veränderungen im normalen Alterungsprozess bei. Diese Faktoren kreuzen sich auf komplexe Weise, wie die Fülle dokumentierter Verbindungen zeigt, die in vielen Organismen identifiziert und konserviert werden. Die meisten dieser Studien konzentrieren sich auf Funktionsverlust, Nullmutanten, die ein schnelles Screening vieler Gene gleichzeitig ermöglichen. Es gibt viel weniger Arbeit, die sich darauf konzentriert, die Rolle zu charakterisieren, die die Überexpression eines Gens in diesem Prozess überträgt. In der vorliegenden Arbeit präsentieren wir eine einfache Methodik zur Identifizierung und Klonung von Genen in der angehenden Hefe, Saccharomyces cerevisiae, zur Untersuchung zur Unterdrückung des kurzlebigen chronologischen Lebenserwartungsphänotyps, der in vielen genetischen Hintergründen zu sehen ist. Dieses Protokoll soll Forschern unterschiedlichster Herkunft und verschiedenen akademischen Stadien zugänglich sein. Das SIR2-Gen, das für eine Histon-Deacetylase kodiert, wurde für das Klonen im pRS315-Vektor ausgewählt, da es widersprüchliche Berichte über seine Auswirkungen auf die chronologische Lebensdauer gegeben hat. SIR2 spielt auch eine Rolle in der Autophagie, die entsteht, wenn durch das Löschen mehrerer Gene gestört, einschließlich des Transkriptionsfaktors ATG1. Als Beweis des Prinzips klonen wir das SIR2-Gen, um einen Suppressor-Bildschirm auf dem verkürzten Lebensdauer-Phänotyp, der für den autophagie-Mangel-Atg1-Mutant charakteristisch ist, durchzuführen und es mit einem ansonsten isogenen, wilden genetischen Hintergrund zu vergleichen. atg1Δ

Einleitung

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Altern ist der zeitabhängige Verlust der Integrität in unzähligen biologischen Prozessen, der letztlich die Wahrscheinlichkeit eines Organismustodes erhöht. Das Altern ist für alle Arten fast unvermeidlich. Auf zellulärer Ebene gibt es mehrere gut charakterisierte Kennzeichen, die mit dem Altern verbunden sind, einschließlich: genomische Instabilität, epigenetische Veränderungen, Verlust der Proteostase, mitochondriale Dysfunktion, deregulierte Nährstoffsensorik, zelluläre Seneszenz und Telomerat1,2. Bei einzelligen Organismen, wie Hefen, führt dies zu einer Verringerung des reproduktiven Potentials und der chronologischen Lebensdauer3,4. Diese zellulären Veränderungen manifestieren sich in komplexeren Organismen, wie Menschen, als Pathologien, die Krebs, Herzinsuffizienz, Neurodegeneration, Diabetes, und Osteoporosegehören 5,6,7. Trotz der vielen Komplexitäten, die den Prozess des Alterns charakterisieren, gibt es die Erhaltung dieser molekularen Kennzeichen, die diesem Prozess über sehr unterschiedliche Organismen8,9,10zugrunde liegen. Die Identifizierung von Veränderungen dieser Wege während des Alterns führte zu der Erkenntnis, dass sie durch Lebensstiländerungen manipuliert werden können – Diät-Einschränkung wird gezeigt, dass die Lebensdauer in vielen Organismen wesentlich verlängert11. Diese Wege konvergieren und schneiden sich auf komplexe Weise untereinander und vielen anderen Pfaden. Die Aufklärung und Charakterisierung dieser Wechselwirkungen bietet Potenzial für therapeutische Interventionen zur Verlängerung der Lebensdauer und Der Gesundheitsspanne12,13,14.

Die Erhaltung der molekularen Grundlagen des Alterns ermöglicht eine funktionelle Zerlegung genetischer Wechselwirkungen, die dem Prozess durch den Einsatz einfacherer Modellorganismen zugrunde liegen – einschließlich der angehenden Hefe, Saccharomyces cerevisiae15,16. Es gibt zwei etablierte Arten von Alterung, die durch aufkeimende Hefe modelliert werden: chronologische Alterung (die chronologische Lebensdauer, CLS) und replizierende Alterung (die replizierische Lebensdauer, RLS)17. Die chronologische Alterung misst die Zeit, die eine Zelle in einem nicht dividierenden Zustand überleben kann. Dies ist analog zu der Alterung, die in Zellen gesehen wird, die den Großteil ihres Lebens in G0verbringen, wie Neuronen4. Alternativ ist die replizierende Lebensdauer die Anzahl der Male, die eine Zelle vor Erschöpfung teilen kann, und ist ein Modell für mitotisch aktive Zelltypen (z. B. die Anzahl der Tochterzellen, die eine Zelle haben kann)18.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein Protokoll zu präsentieren, das die funktionelle Zerlegung der Genetik des Alterns mit S. cerevisiaeermöglicht. Während es viele ausgezeichnete Studien von vielen Forschern durchgeführt haben, die zu unserem aktuellen Verständnis geführt haben, gibt es noch viele Möglichkeiten für angehende Forscher, um zum Alterungsfeld von Anfang an in ihrer akademischen Karriere beizutragen. Wir stellen eine klare Methodik vor, die es Forschern ermöglicht, den Bereich des Alterns weiter voranzutreiben. Dieses Protokoll ist so konzipiert, dass es für alle Forscher unabhängig von der Phase ihrer akademischen Laufbahn zugänglich ist, indem es die notwendigen Werkzeuge bereitstellt, um ihre eigenen neuen Hypothesen zu formulieren und zu testen. Der Vorteil unseres Ansatzes ist, dass dies eine kostengünstige Methode ist, die für alle Forscher unabhängig von der Institution leicht zugänglich ist – und keine teure, spezialisierte Ausrüstung erfordert, die für einige Protokolle erforderlich ist19. Es gibt mehrere verschiedene Möglichkeiten, diese Art von Bildschirm zu entwerfen, der in dieser Arbeit skizzierte Ansatz ist besonders geeignet, Nullmutanten von nicht-essentiellen Genen zu untersuchen, die eine starke Verringerung der chronologischen Lebensdauer im Vergleich zu einem isogenen Wildstamm von Hefe aufweisen.

Als Beweis des Prinzips klonen wir SIR2, eine Lysin-Deacetylase, die sowohl eine verlängerte als auch eine verkürzte CLS aufweist, wenn sie überexprimiert wird. SIR2 Überexpression wurde vor kurzem festgestellt, CLS in der Weinbereitung Hefen zu erhöhen; Mehrere Gruppen haben jedoch keine Verbindung zwischen SIR2 und CLS-Erweiterung gemeldet, so dass ihre Rolle unter den Merkmalen20,21,22bleibt. Aufgrund dieser widersprüchlichen Berichte in der Literatur haben wir dieses Gen ausgewählt, um unabhängige Forschung hinzuzufügen, um die Rolle von SIR2 in der chronologischen Alterung zu klären, falls vorhanden. Darüber hinaus verlängert das Erhöhen der Kopierzahl eines SIR2-Homologen die Lebensdauer in einem Nematoden-Wurmmodellsystem23.

Autophagie ist ein intrazelluläres Abbausystem, um zytosolische Produkte, wie Proteine und Organellen, an das Lysom24zu liefern. Autophagie ist eng mit Langlebigkeit durch seine Rolle bei der Erniedrigung beschädigter Proteine und Organellen verbunden, um zelluläre Homöostase zu erhalten25. Die Induktion der Autophagie hängt von der Orchestrierung der Expression vieler Gene ab, und die Deletion des ATG1-Gens führt zu einem ungewöhnlich kurzen CLS in angehender Hefe26. ATG1-Codes für eine Proteinserin/Threoninkinase, die für die Vesikelbildung in der Autophagie und den Zytoplasma-zu-Vakuole(das Pilzlysosomale Äquivalent) erforderlich ist27,28. Hier stellen wir unsere Methode für einen erhöhten Kopiernummernbildschirm vor und testen den Effekt einer erhöhten SIR2-Kopie auf dem CLS in einem Wild-Typ und einem atg1-null-Hintergrund. Diese Methode ist besonders für junge Forscher und Forschungsgruppen an vorwiegend studentisch untersuchten Einrichtungen zugänglich, von denen viele Gemeinschaften dienen, die in den Wissenschaften unterrepräsentiert sind und über begrenzte Ressourcen verfügen.

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Protokoll

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1. Identifizieren potenzieller genetischer Wechselwirkungen für das Screening

  1. Identifizieren Sie den genetischen Hintergrund(e) für die Charakterisierung, was zu einer ungewöhnlich verkürzten chronologischen Lebensdauer (CLS) in Saccharomyces cerevisiae mit der Saccharomyces Genome Database (der SGD, https://www.yeastgenome.org29,30) führt, die bekannte phänotypische Informationen für diesen Organismus zusammenstellt.
    1. Wählen Sie die Registerkarte Funktion aus den Optionen oben auf der Webseite aus.
    2. Wählen Sie Phänotyp aus, gefolgt von der Auswahl Alle Phänotypen durchsuchen.
    3. Aus der Yeast Phenotype Ontology-Optionen scrollen Sie zur Unterposition Entwicklung und wählen Sie Chronologische Lebensdaueraus, die unter der Unterposition Lifespan gefunden wird.
    4. Wählen Sie den Qualifizierer für verringerte, die die Identifizierung von Genen ermöglicht, die einen Phänotyp aufweisen, der zu einem verringerten chronologischen Lebensdauer-Phänotyp führt, wenn er gelöscht wird. Für diese Proof-of-Methode wurde atg1" ausgewählt, was zu einem kurzlebigen CLS-Phänotyp führt und bei Autophagie gestört ist26.
  2. Identifizieren Sie Zielgene, um genetische Wechselwirkungen zu untersuchen, die den Phänotyp des in Teil 1.2 identifizierten Mutanten auf der Grundlage von gemeldeten oder vorhergesagten ontologisch-Attributen unterdrücken können. Wiederholen Sie die Phänotypsuche, wie sie in den Schritten 1.1.1-1.1.4 oben zu finden ist, und fragen Sie nach Genen, die zu einem längeren CLS führen, wenn sie in einem Wildtyp-Hintergrund überexprimiert werden. SIR2 wurde auf der Grundlage des gemeldeten CLS-Phänotyps ausgewählt und berichtete Wechselwirkungen mit Autophagie31,32.

2. Reagenzien vorbereiten

HINWEIS: Sofern nicht anders angegeben, jede Lösung bei 121 °C für 20 min, um vor der Verwendung zu sterilisieren.

  1. YPAD flüssige Medien: Fügen Sie 1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Dextrose (Glukose) und 40 mg Adenin (als Adeninsulfatdehydrat) pro Liter doppelt destilliertes Wasser hinzu. Gut mit einem Magnetrührer mischen.
  2. LB flüssige Medien: Tryptone (10 g), Hefeextrakt (5 g) und Natriumchlorid (10 g) pro Liter doppelt destilliertes Wasser hinzufügen. Gut mit einem Magnetrührer mischen.
  3. 1000x (100 mg/ml) Ampicillinvorrat in doppelt destilliertem Wasser zubereiten. Gut mischen und sterilisieren.
  4. Synthetische sergänglich – Leucin (SC-LEU) flüssige Medien: Fügen Sie 1,7 g Hefestickstoffbasis mit Aminosäuren, 2% Glukose, 1,92 g SC-LEU Dropout-Mix, 5 g Ammoniumsulfat pro Liter doppelt destilliertes Wasser hinzu. Gut mit einem Magnetrührer mischen.
  5. TE-Puffer: Mix Tris (10 mM Endkonzentration), EDTA (1 mM Endkonzentration) in der Lösung mit doppelt destilliertem Wasser. Gut mit einem Magnetrührer mischen.
  6. 50% PEG 3350 in Lösung mit doppelt destilliertem Wasser vorbereiten. Gut mit einem Magnetrührer mischen.
  7. Bereiten Sie 1 M und 100 mM Lithiumacetat Lösung mit doppelt destilliertem Wasser vor. Gut mit einem Magnetrührer mischen.
    ANMERKUNG: Um feste Agarplatten zu machen, fügen Sie 20 g Agar (pro Liter mit doppelt destilliertem Wasser) zu den Medien hinzu, die in 2.1 und 2.2 oben vor dem Autoklavieren hergestellt wurden. Wenn die Vorbereitung von Ampicillinplatten 1ml des Ampicillins in 2,2 oben in das Medium geben, nachdem es auf etwa 60 °C abgekühlt ist. Gießen Sie in sterile Platten und lassen Sie für 48-72 h vor der Verwendung eingestellt. Platten bei 4 °C für längere Lagerung lagern.

3. Entwerfen Sie die Klonstrategie, um SIR2 in den pRS315-Vektor zu klonen

  1. Entwerfen Sie PCR-Primer, um das SIR2-Gen zum Klonen in den pRS315-Vektor zu verstärken.
    1. Designprimer manuell, um 21–22 Nukleotid Komplementarität zu den intergenen Regionen vor und flussabwärts des SIR2haben. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gen zusammen mit den nicht übersetzten Bereichen der mRNA geklont wird, indem diese Features aus den verfügbaren Datensätzen33,34zugeordnet werden.
    2. Stellen Sie sicher, dass das PCR-Primer-Design zu Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen führt, die eine Schmelztemperatur (Tm) über 53 °C und unter 60 °C haben.
      HINWEIS: Idealerweise sollten beide Primer ein Tm so nah beieinander haben, wie es die Sequenz erlaubt, mit einem ungefähren GC-Gehalt zwischen 40 und 50%, wobei sichergestellt ist, dass Dinukleotidwiederholungen vermieden werden und die GC- und AT-Verteilung in der gesamten Sequenz ausgeglichen wird.
    3. Nach dem Design der PCR-Primer, die die Erzeugung des Amplicons zum Klonen ermöglichen, fügen Sie zielstellen für Restriktionsenzyme (R.E.D.) an das 5'-Ende jedes Primers, die mit dem Plasmid-Klonvektor kompatibel sind. Bei dieser Methode wird dem vorgelagerten, vorwärts gerichteten Primer eine HindIII-Restriktionsenzym-Verdauungsstelle (5'-AAGCTT-3') und dem nachgeschalteten Reverse primer eine SacII-Restriktionsenzym-Verdauungsstelle (5'-CCGCGG-3') zugesetzt.
      HINWEIS: Die Verwendung der Standorte SacII und HindIII erfordert, dass die Konsensschnittstelle für jede Endonuklease nicht im Zielgen vorhanden ist. Wenn eines der beiden Enzymziele innerhalb des Zielgens liegt, sollten alternative Restriktionsenzyme ausgewählt werden. Es gibt viele, die mit dem Polylinker-Bereich auf dem pRS315-Vektor kompatibel sind.
    4. Fügen Sie schließlich einen Vier-Nukleotid-(5'-NNNN-3')-Sequenzüberhang an das 5'-Ende jedes Primers, damit das Restriktionsenzym das Amplikon bindet und verdauen kann. Sobald die Primer entworfen wurden, lassen Sie die Oligonukleotide kommerziell synthetisiert für die Verwendung klonen das SIR2-Gen.
    5. Resuspension der PCR-Primer: Zentrifugieren Sie die PCR-Primer mit einer Tischmikrofuge mit maximaler Geschwindigkeit für 4 min. Fügen Sie te-Lösung hinzu, um eine Lagerkonzentration von 100 M zu erzielen. Lagern Sie die Lagerkonzentration bei -20 °C und verdünnen Sie 1/10 für den Einsatz in PCR-Anwendungen.
      ANMERKUNG: Um einen 100-M-Bestand herzustellen, lösen Sie die Primer in einem Volumen sterilen TE-Puffers auf, der 10-fach der Nmolesmenge in der Primerrtube ist, mit Mikrolitern von TE. Wenn das Rohr z. B. 15,6 Nmoles Primer enthält, fügen Sie 156 L DES TE-Puffers hinzu.
  2. Isolieren Sie Wild-Hefe-gDNA zur SIR2 PCR-Verstärkung des SIR2-Klonkonstrukts.
    HINWEIS: Mehrere hochwertige Optionen sind im Handel verfügbar, um Hefe-gDNA zu isolieren. Die Verwendung eines Kits, das die Verdauung der Pilzzellwand mit Zymolyase beinhaltet, führt zu einer besseren Qualität der gDNA (höhere Ausbeute, weniger Verunreinigungen). Das folgende Protokoll gibt konsequent hohe Konzentration und Reinheit zurück. Details zu einem von uns empfohlenen Bausatz finden Sie in der Tabelle der Materialien.
    1. Wachsen Sie 5 ml Kultur der Wild-Typ-Hefe für 48-72 h zu Post-Log-Phase in angereicherten Medien, wie YPAD. Pellet die Hefezellen bei >800 x g für 3 min bei Raumtemperatur, entfernen Sie die Wachstumsmedien, und resuspendieren Sie in 120 l Zymolyase-Verdauungspuffer, ergänzt mit 5 l Zymolyase (2 Einheiten Enzym/ L). Mischen Sie die Probe durch Wirbeln und inkubieren Bei 37 °C für 40 min.
    2. Fügen Sie 120 L eines chaotropen Lysepuffers (z. B. Guanidiniumchlorid), 250 l Chloroform hinzu und wirbeln Sie die Probe für 60 s.
    3. Zentrifugieren Sie bei >8.000 x g für 2 min und übertragen Sie den Überstand in eine Reinigungskolonne in einem sterilen Sammelrohr.
    4. Zentrifugieren Sie bei >8.000 x g für 60 s und entsorgen Sie den Durchfluss. Die gDNA wird an die Spaltenmatrix gebunden.
    5. Waschen Sie die Säule zweimal mit 300 l eines Waschpuffers auf Ethanolbasis, wobei der Zentrifugationsschritt von oben wiederholt wird (3.2.4). Entsorgen Sie den Durchfluss nach jeder Drehung. Übertragen Sie die Säule in ein 1,5 ml Mikrofugenrohr, fügen Sie 60 L TE-Puffer hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 60 s. Flash drehen Sie die Probe für 30 s, um die DNA zu elute.
      HINWEIS: Bestimmen Sie die Konzentration der DNA in der Probe (Absorption bei 260nm) und die Qualität (Absorption 260nm/280nm). Eine typische Ausbeute liegt bei 100–200 ng/l gDNA mit einem Absorptionsverhältnis bei 260nm/280nm so nahe wie möglich bei 1,8.
  3. Verstärken und isolieren Sie den pRS315-Plasmidvektor zum Klonen.
    HINWEIS: Für die Reinigung von Plasmidvektoren sind mehrere hochwertige Optionen im Handel verfügbar. Für diesen Schritt wird eine auf Kieselsäure basierende Säulenchemie empfohlen. Die unten aufgeführten Änderungen haben zu höchster Konzentration und Reinheit geführt. Details finden Sie in der Tabelle der Materialien.
    1. Wachsen Sie eine 5 ml Kultur von E. coli, die den pRS315-Vektor über Nacht in LB+ Ampicillin (80 g/ml) Medien enthält. Pellet die Kultur durch Zentrifugation bei >8.000 x g für 2 min bei RT (15–25 °C).
    2. Re-suspend pelleted bakterienzellen in 250 l TE-Puffer mit RNase A (100 g/ml) und Übertragung in ein Mikrozentrifugenrohr. Stellen Sie sicher, dass keine Zellklumpen verbleiben.
    3. Fügen Sie 250 l Lysepuffer hinzu und mischen Sie, indem Sie das Rohr 6-8 Mal invertieren. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Lassen Sie die Lyse nicht mehr als 5 min an – etwas weniger ist vorzuziehen.
    4. Fügen Sie 350 L Neutralisationspuffer hinzu und mischen Sie sofort und gründlich, indem Sie das Rohr 10 Mal invertieren. Zentrifuge für 10 min bei >8.000 x g.
    5. Übertragen Sie den Überstand vorsichtig von oben auf eine Kieselsäure-Spin-Säule durch Pipettieren. Zentrifugieren Sie 30 s und entsorgen Sie den Durchfluss.
    6. Fügen Sie 500 l eines hohen Salzwaschpuffers und zentrifugen wie in Schritt 3.3.5 hinzu. Entsorgen Sie den Durchfluss. Waschen Sie die DNA-Bindungsspinsäule, indem Sie 750 L eines Waschpuffers auf Ethanolbasis hinzufügen, um Restsalze und Zentrifugen wie in Schritt 3.3.5 zu entfernen.
    7. Entsorgen Sie den Durchfluss und die Zentrifuge für weitere 2 min bei >8.000 x g, um den Restwaschpuffer zu entfernen. Legen Sie die Spinsäule in ein sauberes, beschriftetes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Um die DNA zu löschen, fügen Sie 20 L TE-Puffer in die Mitte der Spin-Säule, inkubieren für 1 min bei Raumtemperatur und Zentrifuge für 1 min bei >8.000 x g.
    8. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Menge (Absorption bei 260nm) und die Qualität (Absorptionsfähigkeit 260 nm/280 nm) der DNA zu bestimmen. Eine typische Ausbeute wird 1–2 g/ l betragen.
  4. PCR-Verstärkung des Kandidatengens SIR2 aus genomischer Wild-DNA
    1. Um ein Amplicon herzustellen, das zum Klonen geeignet ist, verwenden Sie eine High-Fidelity (HF) PCR-Polymerase, um zu vermeiden, dass die unbeabsichtigte Erzeugung von Mutationen in die Sequenz verstärkt wird.
      HINWEIS: Viele verschiedene High-Fidelity-PCR-Optionen sind im Handel erhältlich. Um die Optimierung der PCR-Reaktionsbedingungen zu erleichtern, verwenden Sie eine Zwei-Puffer-Kombination: eine, die ein Standard-HF-Puffer ist und eine für hohe GC und komplexe Amplicons optimiert. Details finden Sie in der Tabelle der Materialien.
    2. PCR verstärken das SIR2-Konstrukt für das Klonen, wie in Tabelle 1 beschrieben.
      ANMERKUNG: Um den Erfolg in den Klonschritten zu maximieren, können mehrere identische 50-L-Werte eingerichtet und durch einen PCR-Säulenbereinigungsschritt konzentriert werden. Achten Sie darauf, eine keine gDNA-Vorlagensteuerungsreaktion (negative Kontrolle) einzurichten.
    3. Richten Sie die PCR-Zyklusbedingungen ein, wie in Tabelle 2 beschrieben.
      HINWEIS: Verschiedene Primerpaare variieren je nach Annegentemperatur und verschiedene Polymerasen funktionieren bei unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Achten Sie darauf, die Amplifikationsbedingungen basierend auf dem ausgewählten Enzym und den Spezifikationen der Primer-Kombination in der entworfenen Entwicklung zu optimieren.
    4. Überprüfen Sie den Erfolg der PCR-Reaktion, indem Sie die PCR-Reaktion, die ein etwa 2,5 kb DNA-Fragment erzeugen würde, auf einem 1,0% TAE-Agarose-Gel (mit 0,5 g/ml Ethidiumbromid zur Visualisierung) visualisieren.
  5. Verdauung und Ligation des Kandidatengens SIR2in den pRS315-Plasmidvektor.
    1. Durchführung der Restriktionsverdauung des Vektors und des Inserts: 625 ng DNA (entweder vektor oder insert), q.s. Wasser, um das endgültige Reaktionsvolumen auf 50 l, 5 l Puffer, 1 L SacII und 1 L HindIII zu bringen. Inkubieren Sie die Restriktionsverdauungen bei 37 °C für 3 h, gefolgt von 80 °C für 20 min, um die Enzyme zu erhitzen. Digests können bei 4 °C gelagert werden, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    2. Richten Sie eine 15-L-Ligationsreaktion ein, um das gewünschte Plasmid zu erzeugen: 6 l steriles Wasser, 2 l verdauter Vektor (50 ng DNA), 4 l verdauter Insert (100 ng DNA), 2 L T4-Reaktionspuffer und 1 L T4-DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Ligationsreaktionen über Nacht bei 16 °C, gefolgt von 80 °C für 20 min, um das Enzym zu erhitzen.
      ANMERKUNG: Richten Sie eine No-Insert-Steuerung ein und ersetzen Sie anstelle des Einsatzes zusätzliche 4 l steriles Wasser (insgesamt 10 l).
    3. Verwandeln Sie die Ligationsreaktionen in E. coli.
      HINWEIS: Es stehen viele Optionen für kompetente Zellen zur Verfügung. Dieses Protokoll verwendet chemisch kompetente Zellen, die vor der Verwendung bei -80 °C gelagert werden.
      1. Eine 50-L-Röhre mit gefrorenen, kompetenten E. coli-Zellen auf Demeis auftauen, bis sie gerade aufgetaut ist, und sofort 15 l der Ligationsreaktion hinzufügen. Streichen Sie die Röhre mehrmals. Die Rohre sofort auf Eis zurückgeben und 30 min brüten.
      2. Die Zellen für 20 s in einem Wasserbad bei genau 42 °C erhitzen und die Rohre sofort für eine 2 min Inkubation ins Eis zurückgeben. Fügen Sie jeder Transformationsreaktion 450 L Raumtemperatur-Rückgewinnungsmedien (z. B. SOC oder LB) hinzu und inkubieren Sie 60 min bei 37 °C mit Schütteln.
      3. Machen Sie für jede Transformationsreaktion eine Verdünnung der Zellen um 1:10. Mit steriler Technik, Platte 150 l der unverdünnten Zellen und die 1:10 Verdünnungen auf LB + (80 g/ml) Ampicillinplatten35. Die Platten über Nacht bei 37 °C bebrüten.
  6. Bildschirm prospektive Transformationsmittel für den Überausdrucksvektor.
    1. Mit steriler Technik impfen Sie die potentiellen Transformationsmittel, die in 5 ml LB + (80 g/ml) Ampicillin wuchsen, und wachsen über Nacht. Nach dem in Abschnitt 3.3.1–3.3.7 beschriebenen Verfahren isolieren Sie die Plasmide von jedem potenziellen Transformant und Sieb für eine erfolgreiche Integration des Inserts durch Restriktionsverdauung, gefolgt von einer Gelelektrophorese auf einem 1,0% TAE-Agrose-Gel (mit 0,5 g/ml Ethidiumbromid zur Visualisierung).

4. Transformieren Sie den Vektor in atg1- und wilde Hefestämme

HINWEIS: Dies wird mit einem modifizierten Lithium-Acetat-Transformationsprotokoll36durchgeführt.

  1. Pellet 15 ml Wildtyp und atg1-null Hefezellen wachsen über Nacht in YPAD-Medien bis zur frühen bis mittleren Logphase (O.D. 600nm = 0,4-0,9) des Wachstums für 3 min bei > 800 x g bei Raumtemperatur.
  2. Dekantieren Sie den Überstand, setzen Sie das Zellpellet in 1 ml sterilem ddH2O wieder auf und übertragen Sie den Inhalt in ein 1,7 ml Mikrofugerohr. Pellet die Zellen für 3 min bei > 800 x g bei Raumtemperatur.
  3. Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie die Zellen in 250 l lithiumacetat mit sanfter Pipettierung wieder auf. Teilen Sie die Zellen in separate Mikrofugenröhren für jede der Transformationen, die Sie durchführen werden. Verwenden Sie 50 l des Zell-Lithium-Acetat-Mix pro Transformation.
  4. Richten Sie einen Transformationsmix ein. Zu jeder der Transformationen fügen Sie hinzu: 240 l von 50% PEG3350, 36 l von 1,0 m Lithiumacetat und 5 l LachsSperma (oder andere Träger) DNA, gekocht für 5 min und auf Eis.
    HINWEIS: PEG ist sehr zähflüssig. Pipette und sorgfältig messen. Mischen Sie durch Pipettieren nach dem Hinzufügen der einzelnen Komponenten, bevor Sie weiterfahren.
  5. Fügen Sie für jede durchgeführte Transformation 5 L des entsprechenden Plasmids hinzu. Wirbel jede Röhre gründlich zu mischen. Inkubieren Sie die Proben bei 30 °C für 45 min. Hitzeschockproben bei 42 °C für 10 min.
  6. Pelletzellen für 3 min bei > 800 x g bei Raumtemperatur, entfernen Sie vorsichtig die Transformationsmischung, und setzen Sie Proben in 300 l sterilen ddH2O. Pelletzellen wieder auf, indem Sie den obigen Spin wiederholen, wasservorsichtig entfernen und Ihre Proben in 200 l sterilen ddH2O wieder aufhängen.
  7. Richten Sie 1/10 und 1/100 Verdünnungen für jeden transformierten Hefestamm ein.
  8. Mit steriler TechnikPlatte 150 l von jeder Probe auf SC-Leucin-Platten, um für die Plasmide auszuwählen. Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig und gleichmäßig und lassen Sie die Platte trocknen, bevor sie invertieren und bei 30 °C inkubieren, um für 48-72 h zu wachsen.
    HINWEIS: Sobald der entsprechende Stamm erzeugt ist, kann er langfristig in 25% Glycerin bei -80 °C gelagert werden. Die Quantifizierung der vorhandenen Kopiernummer kann durch verschiedene Methoden bestimmt werden, einschließlich qPCR, RNA-FISH oder einer anderen geeigneten Maßnahme37,38.

5. Bestimmen Sie die chronologische Lebensdauer, um eine verkürzte CLS-Phänotypunterdrückung zu testen

  1. Testen Sie die Wirkung der Überexpression des vermeintlichen Suppressors auf CLS in der kurzlebigen Hefe, atg1-mutant, indem Sie die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) bestimmen, die als Funktion der Zeit39verbleiben.
    HINWEIS: Es ist notwendig, diesen Teil des Experiments mit den entsprechenden Steuerelementen einzurichten. Ein typisches Experiment vergleicht einen Wildtypstamm (WT) von Hefe mit dem leeren Vektor, WT mit dem Suppressorvektor, dem Löschmutanten mit dem leeren Vektor und dem Löschmutanten mit dem Suppressorvektor.
    1. Nehmen Sie eine einzige Kolonie der Sorte, um sie zu studieren und in SC-LEU-Medien zu impfen. Wachsen Sie die Kultur bei 30 °C für 72 h, mit Schütteln.
    2. Mit Hilfe eines Hämozytometers bestimmen Sie die Konzentration von Zellen, die in der Kultur40vorhanden sind.
    3. Verdünnen Sie ein Aliquot der Kultur, so dass das Ergebnis eine gleichmäßige Anzahl von Zellen in einem 150-L-Volumen sterilen Wassers ist. Die Kultur mit steriler Technik auf SC-LEU-Platten aufsieben und bei 30 °C für 72 h wachsen. Diese Platten sind der Tag drei Zeitpunkt und das Experiment wird zu diesem Zeitpunkt als 100% Lebensfähigkeit39normalisiert werden.
      HINWEIS: Die Anzahl der Zellen sollte 200–500 betragen, ausreichend groß für die Analyse und eine überschaubare Anzahl für die Zählung. In dieser Studie haben wir 200 Zellen für unsere Beschichtungsmenge verwendet.
    4. Die Hefekulturen bei 30 °C weiter bebrüten, regelmäßige Aliquots und Beschichtungen, wie in 5.1.3 beschrieben, einnehmen. Fahren Sie mit diesem Vorgang fort, bis die Stämme nicht mehr lebensfähig sind, und kompilieren und analysieren Sie die Ergebnisse.
      HINWEIS: Die vollständige Liste der in dieser Studie verwendeten Stämme finden Sie in Tabelle 3.

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Ergebnisse

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Da es widersprüchliche Berichte über die Rolle von SIR2 während des Alterns gibt, haben wir dieses Gen für die Studie als potentiellen Suppressor des shorten CLS-Phänotyps26des atg1-Mutanten gewählt. Die Rolle von SIR2 ist etwas kontrovers, mit widersprüchlichen Berichten über seine Rolle bei der Erweiterung von CLS, aber es wurde eindeutig mit erhöhter CLS in mindestens einem Hefe-Hintergrund verbunden, mit einer Rolle in der Autophagie und Mitophagie2...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Entschlüsselung der Genetik des Alterns ist eine schwierige Herausforderung, mit vielen Möglichkeiten für weitere Studien, die potenziell signifikante Einblicke in die komplexen Wechselwirkungen liefern können, die existieren. Es gibt viele Methoden, die die schnelle Erzeugung von Funktionsverlustmutanten für die Untersuchung von Nullstämmen von Hefeermöglichen 45,46. Diese Methode bietet einen einfachen Ansatz, um Gene für Überexpressionssuppressorstudien au...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

Danksagungen

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James T. Arnone möchte die Unterstützung der Studenten des Kurses Recombinant DNA Technologies in den Jahren 2017 und 2018 an der William Paterson University würdigen, die von Anfang an an diesem Projekt beteiligt waren, deren Bemühungen aber nicht die Schwelle für die Autorenschaft überschritten haben: Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie, Irvin Gamarra, Precious Isgiftibor , Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza'e, Gabriella Rector, Aida Shono und Matthew So. Ihr seid großartige Wissenschaftler und ich vermisse euch alle!

Die Autoren möchten die unschätzbare Unterstützung von Instruction and Research Technology an der William Paterson University für ihre Hilfe würdigen: Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella und Henry Heinitsh. Die Autoren möchten auch das Büro des Propstes für DIE ART-Unterstützung, das Dekanat und das Zentrum für Forschung am College of Science and Health ihre Unterstützung für diese Arbeit sowie die Abteilung für Biologie für die Unterstützung dieses Projekts würdigen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Pilz-/Bakterien-DNA-KitZymo ResearchD6005
HindIIIHF-EnzymNew England BiolabsR3104S
Phusion High-Fidelity DNA-PolymeraseNew England BiolabsM0530S
Plasmid-Miniprep-KitQiagen12123
SacII-EnzymNew England BiolabsR0157S
Lachs Spermien-DNAThermofisherAM9680
T4 DNA-LigaseNew England BiolabsM0202S

Referenzen

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