Gewinnung primärer Osteozyten durch murine Schädelstockfraktionierung von GFP-exprimierenden Osteozyten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Präparation von neonatalen dmp1-Topas-Mausschädeln und die Isolierung von Osteozyten, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, durch Zellverdau und Fraktionierung sowie die Osteozytenpräparation für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS).

Zusammenfassung

Der Ostezyt, von dem man einst annahm, dass er ein passiver Bewohner des Knochens ist, da er hinter den Kulissen die Funktion hat, mechanische Belastungen zu erfassen, wird nun ins Rampenlicht gerückt und es hat sich gezeigt, dass er mehrere Hauptfunktionen hat, wie z. B. die aktive Modifikation der extrazellulären Matrix und die Bildung eines endokrinen Organs mit dem lakunokanalikulären System, das es umschließt, das Nachrichten an entfernte Orte sendet. Dank der Methoden, die es ermöglichten, den Osteozyten in vitro zu testen, von der Isolierung primärer Osteozyten bis hin zu osteozytenähnlichen Zelllinien, erfahren Osteozyten heute ein durchschlagendes Interesse und einen Wissensschub über Struktur und Funktion. Viele Aspekte der Osteozytenbiologie und der Wechselwirkung mit anderen molekularen Komponenten sind noch nicht entdeckt. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die effiziente Isolierung von primären Osteozyten aus dmp1-topas-neonatalen Mausschäumen, die das grün fluoreszierende Protein in Osteozyten exprimieren, durch Zellfraktionierung und anschließenden Erwerb von Kulturen primärer Osteozyten mittels FACS.

Einleitung

Osteozyten sind terminale differenzierte Zellen aus osteoblastischen Vorläuferzellen, die in ihre sezernierte Matrix eingebettet wurden¹. Sie sind die am häufigsten vorkommenden und langlebigsten Zellen unter den Knochenzellpopulationen. Sie befinden sich in Lakunen und haben eine charakteristische Sternmorphologie mit Dendriten, die sich durch Kanäle erstrecken, die als Canaliculi bezeichnet werden und ein ausgedehntes Netzwerk der Kommunikation und des Stoffwechselaustauschs mit ihrer Umgebung und der Knochenoberfläche bilden². Osteozyten choreografieren sowohl die Rolle von Osteoblasten als auch von Osteoklasten beim ....

Protokoll

Alle Tierbehandlungen und die Tierpflege wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Tohoku-Universität durchgeführt.

1. Sektion der neugeborenen dmp1-Topas-Maus Calvaria

1. Verwenden Sie für dieses Protokoll 6 bis 7 Tage alte Welpen von C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J-Mäusen. Euthanasieren Sie Mäuse mit 5% Isofluran-Inhalation und setzen Sie die Welpen dann in 70% Ethanol um.
2. Übertragen Sie den eingeschläferten Welpen in eine unbehandelte Kulturschale.
3. Fassen Sie mit Schere und Pinzette die Haut an der Schädelbasis und machen Sie einen Schnitt.
4. Schneiden Sie mit dem ersten Schnitt als Au....

Ergebnisse

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, den Prozess der Gewinnung von Kulturen primärer Osteozyten aus dmp1-topaz neonatalen Mausschädeln durch einen Fraktionierungsprozess unter Verwendung von Kollagenase zum Abbau der Kollagenmatrix und EDTA für die Calciumchelation zu demonstrieren, wonach die Zellen für FACS vorbereitet werden, um Osteozyten von anderen Zellpopulationen zu trennen.

Methoden zur Gewinnung primärer Osteozyten aus neonatalen Mausschäumen beschreiben häufig die Verwendung v.......

Diskussion

Der erste isolierte Osteozyten stammte aus einer Huhn-Calvaria⁷ , die mit Hilfe von (OB7.3) oder der avianten Variante von PHEX isoliert wurde. Diese Methode ist jedoch durch die Verfügbarkeit von praktikablen Antikörpern begrenzt, da Osteozyten-spezifische Antikörper hergestellt werden müssen, die auch speziesspezifisch sind. Die Forscher verwendeten eine andere Modifikation des sequenziellen enzymatischen Prozesses, um Osteozyten aus langen Knochen von Mäusen und Ratten zu gewinnen. Die berichte.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BD FACSDiva Software	BD Biosciences		Datenerfassung und -analyse
BD Falcon Tube	BD Biosciences	352235	12 x 75 mm Röhrchen mit Cell Strainer Cap, 35 μ m Nylon-Mesh.
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich, MO, USA
Kollagenase	Wako, Osaka, Japan	034-22363	0,2 % (w/v), rohe Kollagenasemischung aus C. histolyticum.
EDTA	Dojindo, Kumamoto, Japan		5 mM EDTA, hergestellt mit 0,1 % BSA
FACSAriaTM II	BD Biosciences
Fetales Rinderserum (FBS)	Biowest, Nuaillé, Frankreich
Isolationspuffer			70 mM NaCl, 10 mM NaHCO, 60 mM Sorbit, 3 mM K2HPO4, 1 mM CaCl2, 0,1 % (w/v) BSA, 0,5 % (w/v) Glukose und 25 mM HEPES
Millex Sterilfiltereinheit	Merck Millipore, Irland	SLGV033RS	0.22μ m
Nylon-Zellsieb	FALCON, NY, USA		40μ m
Trypsin-EDTA	Life Technologies, NY, USA		0,5 % x10, verdünnt auf x1 in PBS
α-MEM	Wako, Osaka, Japan		Enthält 10 % fötales Rinderserum, 100 I.E./ml Penicillin G und 100 μM; g/ml Streptomycin