Laser-Capture Microdissection RNA-Sequenzierung für räumliche und zeitliche gewebespezifische Genexpressionsanalyse in Pflanzen

Lim Chee Liew; Yan Wang; Marta Peirats-Llobet; Oliver Berkowitz; James Whelan; Mathew  G. Lewsey

doi:10.3791/61517

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Methodenartikel

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequenzierung für räumliche und zeitliche gewebespezifische Genexpressionsanalyse in Pflanzen

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DOI:

10.3791/61517

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5. August 2020

Lim Chee Liew¹^,² , Yan Wang¹^,² , Marta Peirats-Llobet¹ , Oliver Berkowitz¹^,²^,³ , James Whelan¹^,²^,³ , Mathew G. Lewsey¹^,³

¹Department of Animal, Plant and Soil Science, AgriBio Building, La Trobe University, ²Australian Research Council Centre of Excellence in Plant Energy Biology, La Trobe University, ³Australian Research Council Research Hub for Medicinal Agriculture, AgriBio Building, La Trobe University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) von Pflanzengeweben vorgestellt. LCM ist eine mikroskopische Technik zur kontaminationsfreien Isolierung von Gewebebereichen. Das Verfahren umfasst Gewebefixierung, Paraffineinbettung, Schnitt, LCM und RNA-Extraktion. RNA wird in der nachgeschalteten gewebespezifischen, zeitlich aufgelösten Analyse von Transkriptomen eingesetzt.

Zusammenfassung

Die Entwicklung eines komplexen mehrzelligen Organismus wird von unterschiedlichen Zelltypen bestimmt, die unterschiedliche Transkriptionsprofile aufweisen. Um transkriptionelle regulatorische Netzwerke zu identifizieren, die Entwicklungsprozesse steuern, ist es notwendig, die räumlichen und zeitlichen Genexpressionsprofile dieser einzelnen Zelltypen zu messen. Daher ist die Einsicht in die räumlich-zeitliche Kontrolle der Genexpression unerlässlich, um zu verstehen, wie biologische und Entwicklungsprozesse reguliert werden. Hier beschreiben wir eine Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) Methode, um eine kleine Anzahl von Zellen aus drei Gersten-Embryo-Organen während eines Zeitverlaufs während der Keimung zu isolieren, gefolgt von Transkriptprofilierung. Die Methode besteht aus Gewebefixierung, Gewebeverarbeitung, Paraffineinbettung, Schnitt, LCM und RNA-Extraktion, gefolgt von Echtzeit-PCR oder RNA-Seq. Diese Methode hat es uns ermöglicht, räumliche und zeitliche Profile von Samenorgan-Transkriptomen aus unterschiedlicher Anzahl von Zellen (Zehn bis Hunderte) zu erhalten, was eine viel größere Gewebespezifität als typische Massengewebeanalysen bietet. Aus diesen Daten konnten wir transkriptionelle regulatorische Netzwerke definieren und vergleichen sowie kandidatenregulatorische Transkriptionsfaktoren für einzelne Gewebe vorhersagen. Die Methode sollte auf andere Pflanzengewebe mit minimaler Optimierung anwendbar sein.

Einleitung

Pflanzenentwicklung und -wachstum beinhalten die koordinierte Wirkung transkriptionsregulatorischer Netzwerke innerhalb verschiedener Zellen, die in einer komplexen zellulären Umgebung existieren. Um die Aktivität dieser regulatorischen Netzwerke zu verstehen, benötigen wir das Wissen über die räumliche und zeitliche Genexpression innerhalb verschiedener Zelltypen über Entwicklungsstadien hinweg. Aufgrund der technischen Herausforderung, eine kleine Anzahl von Zellen zu isolieren und zu analysieren, werden jedoch häufiger Analysen der Genexpression in ganzen Organen oder Massengewebeproben durchgeführt. Die Methode, die wir hier beschreiben, hat es ermöglicht, eine rä....