Summary
Fibrin er ansvarlig for blodpropdannelse under hæmostase og trombose. Turbiditet assays og tromboelastograhy (TEG) kan udnyttes som synergistiske værktøjer, der giver supplerende vurdering af en blodprop. Disse to teknikker tilsammen kan give mere indsigt i, hvordan koagulationsforhold påvirker fibrinpropdannelse.
Abstract
Trombose er en førende dødsårsag på verdensplan. Fibrin(ogen) er det protein, der primært er ansvarlig for blodpropdannelse eller trombose. Derfor karakteriserer fibrin blodprop dannelse er gavnligt for studiet af trombose. Turbiditet og tromboelastografi (TEG) er begge meget udnyttet in vitro assays til overvågning af blodprop dannelse. Turbiditeten måler dynamisk lystransmissionen gennem en fibrinpropstruktur via et spektrometer og anvendes ofte i forskningslaboratorier. TEG er en specialiseret viskoelastisk teknik, der direkte måler blodprop styrke og er primært udnyttet i kliniske miljøer til at vurdere patienternes hæmostase. Ved hjælp af disse to værktøjer beskriver denne undersøgelse en metode til at karakterisere en in vitro fibrin blodprop ved hjælp af en forenklet fibrinogen/trombin blodprop model. Datatendenser på tværs af begge teknikker blev sammenlignet under forskellige koagulationsforhold. Menneske- og kvægknbrinpropper blev dannet side om side i denne undersøgelse, da kvægpropper ofte anvendes som erstatninger for menneskelige koagulationsfaktorer i kliniske miljøer og forskningsmiljøer. Resultaterne viser, at TEG og turbiditet spor blodprop dannelse via to forskellige metoder, og når de anvendes sammen giver komplementær blodprop styrke og fiber strukturelle oplysninger på tværs af forskellige koagulationsbetingelser.
Introduction
Trombose er den patologiske dannelse af en blodprop i kroppen, der blokerer blodcirkulationen fører til høj sygelighed og dødelighed på verdensplan. Der er 1 til 2 tilfælde af venøs tromboemboli og 2 til 3 tilfælde af trombose-induceret vaskulære sygdomme pr 1000 menneskerårligt 1,,2. Præsenteret her er en metode til at udnytte tromboelastografi (TEG) og turbiditet til at overvåge blodprop dannelse under forskellige koagulationsforhold. Fibrin(ogen) er det primære protein, der er ansvarlig for blodpropdannelse i kroppen. I de sidste trin i koagulationskaskade, fibrinopeptider er kløvet fra fibrinogen ved trombin initiere polymerisering af uopløselige fibrin monomerer som blodprop udvikler3,4. For at forstå blodprop dannelse i patologisk trombose, er det nødvendigt at karakterisere fibrin dannelse under forskellige koagulations omstændigheder. Flere blodprop overvågning analyser er blevet udnyttet til at studere fibrin blodprop dannelse in vitro. Prothrombin tid (PT / INR) og aktiveret delvis tromboplastin tid (aPTT) er to fælles kliniske analyser, der måler integriteten af en bestemt koagulationsvej. Men de bruger tid som den eneste variabel, der giver ingen indikation af fysiske blodprop egenskaber5. Elektronmikroskopi giver mulighed for visualisering af mikrostrukturen af en helt dannet fibrinprop, men giver ingen oplysninger om selve blodproppensformningsproces6. Blandt alle analyser, turbiditet analyser og TEG tilbyde evnen til at spore blodprop egenskaber dynamisk over tid. Disse teknikker gør det muligt at måle omfattende koagulationsprofiler og giver derfor en vis fordel i forhold til andre fibrinprop-karakteriseringsværktøjer.
Specifikt, turbiditet assays (eller blodprop turbidimetri) er meget udbredt til forskning og kliniske anvendelser på grund af dens forenklet gennemførelse og den brede tilgængelighed af spektrometre i forskningslaboratorier. Denne analyse giver mulighed for en dynamisk måling af lystransmission gennem en dannende blodprop ved at tage individuelle gentagne aflæsninger ved en defineret bølgelængde (oftest ved en bølgelængde i intervallet 350 – 700 nm)7. Temperaturen i læsekammeret kan også justeres. Som fibrin gel former, mængden af lys, der rejser gennem proteinnetværket er reduceret forårsager en stigning i absorbans over tid. På samme måde falder absorbansen, når blodpropnetværket forringes. Turbiditetsanalyser kan nemt multipleks ved hjælp af et flerb godt pladeformat for at give mulighed for høj gennemløbsprøvescreening i både 96- og 384-brøndplader. Flere blodprop egenskaber kan udledes af en turbiditet sporing kurve (absorbans over tid måling), der omfatter: maksimal turbiditet, tid til maksimal turbiditet, tid til at størkne debut, og blodprop dannelse sats (Vmax). En fibrin fiber masse / længde forhold kan også udledes af rå turbiditet data til at anslå fibrin fibertykkelse 8,9,10.
TEG anvendes primært i den kliniske indstilling til at vurdere patienternes hæmostase og blodproplysis. Det er også almindeligt anvendt i kirurgiske applikationer til at bestemme, hvornår anti-fibrinolytiske lægemidler eller hæmostatiske blodprodukter bør administreres11,,12. Clot dannelse opstår inde i en TEG kop med alle de koagulationskomponenter, der tilsættes til koppen før indledningen af analysen. Koppen, med udviklende blodprop, roterer fysisk mod en pin, der indsættes i dens centrum og en elektromekanisk torsionssensor måler den stigende viskoelastiske styrke af blodproppen. Denne analyse udføres typisk ved den fysiologiske temperatur på 37 °C; Temperaturen kan dog justeres manuelt på instrumentet. Maksimal amplitude (MA), reaktionshastighed (R), kinetiktid (K), α-vinkel (vinkel) og tid til maksimal amplitude (TMA) udvindes af TEG-softwaren fra den dynamiske TEG-sporing. Disse værdier sammenlignes typisk med kliniske normalområder for at vurdere en patients koagulationstilstand. Mens TEG er ikke netop et viscometer, da det måler blodprop styrke i millimeter enheder, det giver vigtige viskoelastiske blodprop data og fungerer som et værdifuldt klinisk beslutningsværktøj for læger til at beslutte at administrere specifikke blodprodukter og justere terapeutiske dosering13. Når både TEG og turbiditet analyser udnyttes sammen, de giver supplerende blodprop karakterisering oplysninger som blodprop styrke og kinetik er let udvindes fra TEG og fibrin fiber tykkelse kan tilgås ved optisk turbiditet målinger.
Da fibrin er en kritisk komponent i en blodprop, kan fibrinprop-blodpropkarakterisering under forskellige blodpropdannelsesforhold give værdifuld indsigt i, hvordan en bestemt variabel bidrager til blodpropdannelsesprocessen og ultimativ blodpropegenskaber. Forståelse af dette kan give vejledning til trombose diagnose og udvikling af terapeutiske. For at opnå en mere repræsentativ fibrin blodprop karakterisering, plasma kan erstattes for at overvåge blodprop dannelse, da det ligner in vivo koagulation betingelser tættere end en forenklet fibrinogen / thrombin model system. Men på grund af den indviklede karakter af koagulationkaskade, blodprop dannelse ved hjælp af plasma øger kompleksiteten, hvilket gør det vanskeligere at isolere virkningen af de enkelte faktorer. Ved hjælp af en forenklet fibrinogen/thrombin model forhindrer behovet for at indlede hele koagulationkaskade giver mulighed for isolering af den endelige fibrin dannelse trin. Ved at inkludere to store fibrindannende komponenter (fibrinogen og trombin), skaber denne opsætning en stærkt kontrolleret blodpropdannelsestilstand. Det er også vigtigt at bemærke, at mens den forenklede blodprop model bruges her, denne protokol kan også bruges til at karakterisere mere komplekse blodpropper ved at inkludere yderligere koagulationsfaktorer. I denne undersøgelse udføres fibrinprop-figurisering ved hjælp af turbiditet og TEG ved varierende fibrinogen- og trombinkoncentrationer, ionisk styrke, pH og total proteinkoncentration i koagulationsopløsningen for at efterligne forskellige in vivo-koagulations omstændigheder14. Nærmere oplysninger om disse ændringer af protokollen er medtaget i afsnit 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af fosfatbuffersatil (PBS)
BEMÆRK: PBS blev anvendt i hele denne undersøgelse, da de beskrevne analyser ikke krævede tilsætning af calcium. Det er vigtigt at bemærke, at når tilsætning af calcium, ofte anvendes til at genkalke citrated blodprodukter, PBS bør undgås som calcium er kendt for at bundfald i fosfat buffere.
- Lav en 0,01 M, pH 7,4 PBS buffer ved blanding 137 mM natriumchlorid, 1,8 mM kaliumphosphat monobasic, 10 mM natriumphosphat dibasic og 2,7 mM kaliumchlorid i DI vand.
- Kontroller bufferpH-zonen ved hjælp af en pH-sonde, og juster pH-zonen med natriumhydroxid eller saltsyre efter behov.
- Brug denne PBS til fremstilling af fibrinogen og koagulationsanalyser (medmindre andet er angivet).
BEMÆRK: Buffer foreslås at rekonstituere fibrinogenpulver, da rehydrering i DI-vand kan resultere i fibrinogenudfældning selv ved 37 °C.
2. Fremstilling og opbevaring af proteiner
BEMÆRK: I hele protokollen fremstilles proteinlagrene i forskellige koncentrationer for turbiditet og TEG for at muliggøre det ensartede forhold mellem salt, DI-vand, PBS og andre restfaktorer i de endelige koagulationsopløsninger.
- Tilberedning og opbevaring af fibrinogen
BEMÆRK: Forurenende stoffer i kommercielt tilgængelige fibrinogen omfatter en betydelig mængde faktor XIII, resterende mængder af andre koagulationsfaktorer, opbevaringsbuffer og salte. Ved tilstedeværelse af calcium er faktor XIII kendt for at krydse fibrinpropnetværket. Denne effekt bidrager til en strammet blodprop struktur og forbedret blodprop styrke påvirker fibrin karakterisering. Kommercielt tilgængelige aktivitetssæt kan bruges til at bestemme aktiv faktor XIIIa niveauer. For at minimere variabilitet forårsaget af faktor XIIIa bør forsøg udformes med udelukkelse af calcium eller yderligere trin til at fjerne faktor XIIIa bør indarbejdes i denne protokol. Desuden bør proteinlagringssalt og -buffertype vurderes, og om nødvendigt kan der foretages dialyse for at overføre den til en foretrukken analysebearbejdningsbuffer.- Der vejes og aliquotlyophilized fibrinogenpulver (kvæg eller menneske) i 2 ml-rør ved 20 mg protein pr. rør og opbevares aliquots ved -20 °C i op til 6 måneder.
- Lad fibrinogen aliquot akklimatisere til RT (stuetemperatur) i 10 minutter på eksperimentets dag. Rekonstituer fibrinogen ved at tilsætte 600 μL PBS til aliquot 20 min før brug.
- Tag 10 μL fibrinogen og fortyndes med 190 μL PBS i en UV gennemsigtig 96-brøndplade eller en kuvette. Fibrinogenkoncentrationen bestemmes ved at tage absorbans ved 280 nm via et kommercielt spektrometer og dets software.
- Udregn fibrinogenkoncentrationen (mg/ml) ved hjælp af øls lovgivning. Der tilberedes 12 mg/ml (for turbiditetsanalyser) og 3,2 mg/ml (for TEG) fibrinogen stamopløsninger ved yderligere fortynding med PBS (medmindre andet er angivet).
BEMÆRK: Fibrinogenkoncentrationsbestemmelse (mg/ml) efter øls lovgivning:
Molarudryddelseskoefficient: ɛ = 513.400 L mol-1 cm-1 ved 280 nm; Pathlength (L); Fortyndingsfaktor (D) Molekylvægt (MW) = 340.000 Da. ɛ udledes ved at gange E0,1% = 1,51 (280 nm) (udryddelseskoefficient, givet af leverandøren) med MW.
- Klargøring og opbevaring af trombin
- Rekonstitueret lyophiliseret trombin (kvæg eller menneske, 1000 U-bestand) i 200 μL deioniseret (DI) vand til at gøre 200 μL af 5000 U/ml trombin lageropløsning.
- Der skal laves 5 μL (20 U/tube) aliquots af opløsningen, og aliquots indefryses ved −20 °C.
- Optø trombin aliquots på RT i 15 min på forsøgsdagen og gøre trombin arbejdsopløsning ved at fortynde det til 20 U/ ml for turbiditet assays og 18 U / ml for TEG med DI vand (medmindre andet er angivet).
BEMÆRK: Der bør træffes forholdsregler for at opretholde enzymaktivitet, som kan opnås ved at opretholde enzymer på is under optøning og brug; der blev imidlertid ikke observeret nogen reduktion i trombinaktiviteten, når den blev anvendt direkte efter optøning hos RT.
3. Turbiditet
- Brug ethvert kommercielt tilgængeligt spektrometer med et absorbansområde på 350 -700 nm og en tilsvarende software til at overvåge blodprop turbiditet over tid (se Tabel over materialer).
- Tænd for spektrometeret, og åbn den tilsvarende analysesoftware.
- Vælg fanen Indstillinger for plade 1 og åbn pladeindstillinger. Klik på ABS-tilstand og Kinetic for at overvåge en dynamisk absorbansaflæsning over tid.
- Vælg 550 nm (eller en værdi i intervallet 350 – 700 nm) i bølgelængdefanen, og juster den samlede gennemløbstid til at være 60 min med et interval på 30 s i tidsfanen. Vælg brønde af interesse for at læse ved at fremhæve brøndene. Juster andre indstillinger, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Hvis du vælger en bølgelængde i den nederste ende af området (ca. 350 nm), er der en bedre følsomhed, men absorbansen kan også overstige spektrometerets detektionsgrænse. Den mest almindeligt anvendte bølgelængde for turbiditet måling er 405 nm i litteraturen; Denne protokol bruger dog 550 nm til at sikre, at værdierne for dynamisk turbiditet ligger inden for detektionsgrænsen for alle forsøg. Det valgte læseinterval skal være så kort som muligt for at opnå den højeste grad af assayfølsomhed. Dette vil afhænge af spektrometeret og antallet af brønde, der læses under en given analyse. - Tag en UV gennemsigtig 96-brønd plade. Pipette 140 μL PBS i en brønd, der er valgt til aflæsning. Der tilsættes og blandes 10 μL trombin (20 U/ml) i brønden.
BEMÆRK: Brug ikke højbindende analyseplader for at minimere uspecifikke proteinbindinger til brøndoverfladen. Dette kan påvirke proteinspredningen i opløsningen og resultere i høj analysevariation. - Koagulation straks ved at tilsætte 50 μL fibrinogen (12 mg/ml) i brønden for at opnå en 200 μL koagulationsopløsning med en endelig koncentration på 3 mg/ml fibrinogen og 1 U/mL trombin. Bland indholdet i brønden ved pipettering op og ned fem gange at passe på at undgå oprettelsen af bobler i opløsningen, da de vil påvirke absorbans ved at sprede lys.
BEMÆRK: Brug en multikanalpipette, når der køres flere blodpropprøver på samme plade på samme tid. Optag tidsforskelle på tværs af brønde og tidsperioden før den første læsning af instrumentet for at udligne koagulationstider. - Placer 96-brønd plade i holderen og klik start i softwaren for at starte turbiditet læsning på RT.
BEMÆRK: Hvis analysen udføres ved en forhøjet temperatur, skal spektrometeret, pladen og reagenserne alle holdes ved den ønskede temperatur, før der opstår blodprop. - Når den er færdig, skal du hente turbiditetsdataene og opnå en turbiditetssporingskurve ved at afbilde absorbansændring over tid i en plottesoftware.
- Udlede TurbMax (maksimal turbiditet vejledende for fibrin fibertykkelse og fibrin netværk tæthed) ved at tage max absorbans værdi af kurven over tid.
BEMÆRK: Fibrin fiber masse / længde forhold kan beregnes ud fra turbiditet værdier ved hjælp af ligningen i følgende manuskript8. - Beregn 90% maksimal turbiditet ved at gange TurbMax med 90%. Aftænt TurbTime ved at beregne tid fra blodprop indledningen til 90% maksimal turbiditet.
BEMÆRK: Tiden til 90% maksimal turbiditet er en mere pålidelig metrisk end tid til absolut maksimal turbiditet, da det bedre repræsenterer blodprop tid ved at fjerne den meget variable endelige blodprop dannelse periode. Yderligere koagulationsparametre såsom størkningsdebuttid (tid fra testens start til det tidspunkt, hvor absorbansen begynder at stige), og dannelseshastigheden for blodprop (Vmax, den største hældning i det lineære område i turbiditetssporingskurven) kan også udvindes fra turbiditetssporingerne.
4. Tromboelastografi (TEG)
- Tænd for tromboelastoanalysatoren og vent på, at temperaturen stabiliseres ved 37 °C.
- Åbn TEG - software. Når du er logget ind, skal du oprette et eksperimentnavn under id-sektionen.
- Udvis en e-test for alle kanaler ved at følge vejledningen på skærmen. Placer håndtaget tilbage til belastningspositionen, når alle kontroller er afsluttet.
BEMÆRK: Der kræves en TEG e-test, som skal udføres hver gang, når instrumentet anvendes. TEG koagulation kontrol analyser (ved hjælp af TEG niveau 1 og niveau 2 kontrol) er påkrævet på den regelmæssige fabrikanten foreslåede intervaller, når de anvendes til kliniske prøver. - Klik på fanen TEG, input eksempel oplysninger for kanaler, der vil blive brugt. Placer en klar ubestrøget TEG-kop i den tilsvarende kanal. Skub holderen op til toppen, og tryk på koppens bund 5 gange for at anbringe stiften på torsionsstangen. Sænk luftfartsselskabet, og tryk koppen nedad i bærebasen, indtil den "klikker".
- Pipette 20 μL trombinopløsning (18 U/ml) i TEG-koppen. Koagulation straks ved at tilføje 340 μL fibrinogen (3,2 mg/ ml) i TEG kop for at opnå en 360 μL koagulationsopløsning med en endelig koncentration på 3 mg/ml fibrinogen og 1 U/ml trombin i koppen. Bland indholdet ved at pipettere op og ned fem gange.
BEMÆRK: Potentielle koagulationsfaktorer eller andre komponenter af interesse bør tilføjes i løbet af dette trin, og der skal altid være et slutvolumen på 360 μL i TEG-koppen. - Skub koppen lastet luftfartsselskab op, skal du flytte håndtaget til læsepositionen og klik på Start i softwaren for at starte TEG-aflæsningen.
- Når TEG er fuldført (efter ca. en time), skal du hente TEG-parametre og opnå en TEG-sporingskurve ved at afbilde amplitude over tid i en plottesoftware.
- Saml MA som TEGMax (maksimal amplitude er tegn på blodpropstyrke) og TMA somTEG-tid (tid til maksimal amplitude) fra softwaren.
BEMÆRK: MA beregnes af softwaren som den maksimale amplitude på det tidspunkt, hvor amplituden har mindre end en 5% afvigelse over en 3-minutters periode. TMA bestemmes som tiden fra den maksimale trombegenereringshastighed (nær splitpunktet) til markedsføringstilladelsen. Andre parametre kan også være nyttige at vurdere, når der udføres blodpropanalysen. Nogle eksempler på disse parametre omfatter: R-tid (tiden fra starten af testen til, når amplitude når 2 mm), K (tiden fra slutningen af R til når amplitude når 20 mm), alpha (hældning af linje mellem R og K), og CLT (blodprop lysis tid).
5. Fibrin karakterisering under forskellige koagulationsforhold
BEMÆRK: Udfør fibrin karakterisering eksperimenter ved at modulere en bestemt variabel i koagulationsopløsninger såsom: fibrinogen og thrombin koncentrationer, ionisk styrke, pH, og samlede protein koncentrationer. Forsøgspræparater med disse eksempelvariabler er beskrevet i dette afsnit. dog kan andre koagulationsfaktorer og betingelser af interesse også erstattes. Vælg omhyggeligt et egnet buffersystem under hensyntagen til de enkelte unikke analysekrav. For turbiditet og TEG-analyser, omfatter en buffer kun kontrol for at sikre en nøjagtig baggrund subtraktion, mens analysere effekten af disse variabler.
- Varierende fibrinogenkoncentration (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml)
- Trin 2.1.4 justeres for at forberede fibrinogenbestanden i forskellige koncentrationer (4, 8, 12, 16, 20 mg/ml for turbiditetsanalyser og 1,1, 2,1, 3,2, 4,2, 5,3 mg/ml for TEG).
- Juster trin 3.6 til "tilsæt 50 μL fibrinogen (4, 8, 12, 16, 20 mg/ml) i flere brønde af de 96 brøndpladen" for turbiditetsanalyser.
- Juster trin 4.5 for at "tilsætte 340 μL fibrinogen (1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/ml) i klare TEG-kopper" til TEG.
- Varierende trombinkoncentration (0,1, 0,3, 0,6, 0,8, 1, 2,5, 5, 10 U/ml)
- Trin 2.2.3 justeres for at forberede trombinlageret i forskellige koncentrationer (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/ml for turbiditetsanalyser og 1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 U/ml for TEG).
- Juster trin 3.5 for at "tilsætte 10 μL trombin (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/ml) i flere brønde af de 96 brønde af de 96 brønde" for turbiditetsanalyser.
- Juster trin 4.5 til "pipette 20 μL trombin (1,8, 5,4, 10,8, 14,4, 18, 45, 90, 180 U/ml) i klare TEG-kopper" til TEG.
- Varierende ionstyrke (0,05, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 og 0,3 M)
- Natriumchlorid opløses (21 101, 111, 121, 131, 141 og 271 mM) sammen med 1,8 mM kaliumphosphat monobasic, 10 mM natriumphosphat dibasic og 2,7 mM kaliumchlorid i DI vand til at gøre 0,01 M PBS løsninger med varierende ionic styrker.
- Juster trin 1.3 for at bruge PBS fremstillet ved forskellige ioniske styrker til at forberede fibrinogen- og koagulationsopløsninger til både turbiditet og TEG-analyser.
- Varierende pH (5,8, 6,6, 7,3, 7,4, 7,5 og 8,0)
- Natriumphosphatdibasic (0,7, 3,2, 7,7, 8,1, 8,4, 9,5 mM) og kaliumphosphatmonobasic (8.2, 6.0, 2.0, 1.7, 1,4, 0,5 mM) sammen med 2,7 mM kaliumchlorid og natriumchlorid (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM) til at gøre 0,01 M PBS løsninger med varierende pH og en endelig ionstyrke ved 0,165 M.
- Kontroller bufferpH-værdien via pH-sonden, og juster pH,hvis det er nødvendigt.
- Juster trin 1.3 for at bruge PBS fremstillet ved forskellige pH-3'er til fremstilling af fibrinogen- og koagulationsopløsning til både turbiditet og TEG-analyser.
- Varierende albuminkoncentration (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/ml)
- 2 g frysetørret albumin opløses i 500 μL PBS på RT i 20 min på forsøgsdagen.
- Albuminkoncentrationen bestemmes ved hjælp af den samme fremgangsmåde, der er nævnt i trin 2.1.3 og 2.1.4, med en molære udryddelseskoefficient på 43.800 L mol−1 cm−1 (ved 280 nm) for albumin.
- Forbered albumin lager på forskellige koncentrationer.
- Trin 3.5 justeres til "Pipette 40 μL PBS i en brønd, der er valgt til aflæsning, og der tilsættes 10 μL trombin (20 U/ml)". Trin 3.6 justeres til "Start straks-koagulation ved at tilsætte 50 μL fibrinogen (12 mg/ml) med 100 μL albumin (0, 40, 80, 100, 120, 160, 200 mg/ml) i flere brønde til en endelig koncentration på 3 mg/ml fibrinogen, 1 U/ml thrombin og 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/ml albumin i brønde."
- Juster trin 4.5 for at "Indlede koagulation straks ved at tilføje en blanding af 200 μL albumin (36, 72, 90, 108, 144, 180 mg/ml) og 140 μL 7,7 mg/ml fibrinogen i TEG-kopper for at opnå en 360 μL koagulationsopløsning med en endelig koncentration på 3 mg/ml fibrinogen, 1 U/ml trombin og 0 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/ml albumin i TEG kopper."
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De forsøg, der er vist i figur 1, er repræsentative turbiditetssporingskurver for menneske- og kvægfibrinpropper på forskellige fibrinogenniveauer. Repræsentative TEG-sporingskurver for fibrinpropdannelse ved forskellige fibrinogenniveauer er vist i figur 2. Begge sporingskurver viser, at efter en forsinkelsesperiode efter clot indledning, blodprop turbiditet eller blodprop amplitude stiger over tid og niveauer ud i slutningen af blodprop dannelse. En slutpunktsværdi af maksimal blodpropdannelse og tiden til maksimal dannelse af blodprop fra hver analyse anvendes til at vurdere funktionerne i en fuldstændig dannet blodprop og den samlede koagulationsproces. Maksimal turbiditet (TurbMax) og tid til maksimal turbiditet (Turb-tid) er de to parametre, der stammer fra turbiditet, mens maksimal amplitude (TEGMax) og tid til maksimal amplitude (TEG-tid) er afledt af TEG.TimeTime
Desuden er TurbMax et optisk mål for blodprop struktur, som er tegn på fibrin fibertykkelse og fibrin netværkstæthed. TEGMax er en mekanisk foranstaltning, der afspejler absolut blodprop styrke. De repræsenterer forskellige aspekter af en blodprop, der kan ændre sig uafhængigt af hinanden baseret på vores tidligere resultater14. Samlet set giver de to værdier supplerende indsigt i blodpropmikrikstrukturerne, såsom hvor tætte fibrene er pakket i fibrinnetværket. For eksplicit at se, hvordan modulering af en koagulationsvariabel påvirker resultaterne, blev dataene yderligere organiseret og præsenteret ved hjælp af tendensområder. Repræsentative eksempler på både turbiditet og TEG-datatendenser er vist i figur 3. På et højere niveau af fibrinogen i koagulationsopløsningen stiger alle fire værdier (TurbMax,TEGMax,TurbTime og TEGTime). Ud fra disse resultater kan det fortolkes, at et højere fibrinogen substratniveau resulterer i et tværrerfibrøst netværk, der begrænser lystransmissionen gennem blodproppen (større TurbMax). Dette stramme netværk øger også blodpropstyrken (større TEGMax). Forlængelsen af både TurbTime og TEGTime indikerer, at fibrin polymerisering hæmmes ved forhøjede fibrinogenniveauer. Tendenserne i TurbMax og TEGMax for variabler testet af vores gruppe og deres fortolkninger er vist i tabel 1.
Figur 1: Repræsentative eksempler på blodprop turbiditet sporing kurve (0 til 30 min). Turbiditetssporinger af kvæg (A) og human (B) fibrindannelse over tid ved forskellige fibrinogenkoncentrationer (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml) med 1 U/ml-arter matchede trombin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative eksempler på TEG-sporingskurve (0 til 30 min.). TEG amplitude sporinger af kvæg (A) og human (B) fibrindannelse over tid ved forskellige fibrinogenkoncentrationer (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml) med 1 U/ml arter matchede trombin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative eksempler på turbiditet og TEG-datatendenser. Datatendenser for TurbMax og TurbTime (A) og tendenserne i TEGMax og TEGTime (B) for forskellige kvæg- eller humane fibrinogenkoncentrationer (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml) med 1U/ml-arter, der svarede til trombin. Alle datapunkter og fejllinjer er gennemsnit og standardafvigelser for tre eksemplarer (turbiditet) og dubletter (TEG). Dette tal er blevet genbrugt fra [Zeng, 2020]14. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Variabler | Udviklingsresultater | Fortolkninger |
| Øget fibrinogenniveau | Øget TurbMax og TEGMax | Dannelse af strammere fibrinfibre og tættere fibernet |
| Øget trombinniveau, pH og ionisk styrke | Nedsat TurbMax, øget TEGMax | Dannelse af tyndere og strammere fibrinfibre |
| Øget albumin niveau | Øget TurbMax, Nedsat TEGMax | Dannelse af tykkere og løsere fibrinfibre |
Tabel 1: Resultater og fortolkninger af TurbMax og TEGMax.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol demonstrerer udnyttelsen af to forskellige blodprop karakterisering værktøjer teste en forenklet fibrinogen / trombin blodprop model ved hjælp af kommercielt tilgængelige komponenter. Både TEG og turbiditet assays er nemme at gennemføre. De giver ikke kun slutpunktspropundersøgelser såsom max blodpropdannelse (TurbMax og TEGMax)og dannelsestider for blodprop (Turb-tid og TEG-tid), men vurderer også den dynamiske blodpropdannelsesproces.Time Time Dette gør TEG og turbiditet værdifulde værktøjer til blodprop karakterisering at tilføje til alternative metoder såsom: SEM, PT, APTT, eller blodprop reologi, som kan have komplicerede eksperimentelle procedurer eller fokusere kun på test af en enkelt blodprop aspekt. Turbiditet og TEG resultater sammen også tilbyde en mere komplet profil af, hvordan en koagulation variabel virkninger blodprop egenskaber.
Ud over de koagulationsvariabler, der er beskrevet i denne protokol, er der mange andre variabler, der kan studeres ved hjælp af disse teknikker. Denne protokol kan ændres ved at justere: temperatur, calcium niveauer, koagulationsfaktor niveauer, tilsætning af blodprop aktivatorer eller inhibitorer, eller tilsætning af farmaceutiske midler, for at nævne nogle få. Disse variabler kan potentielt undersøges ved hjælp af både det forenklede fibrinogen/thrombin modelsystem eller ved hjælp af plasma. Undersøgelse koagulationsfaktorer kræver nøje overvejelse og opsætning at sørge for korrekt opstrøms blodprop aktivering indlede koagulation vej. Turbiditet og TEG er også effektive værktøjer, der anvendes til at overvåge blodprop fordøjelsen. Protokollen kan ændres til at karakterisere fibrin blodprop dannelse og lysis i nærvær af antikoagulanter eller trombolytiske midler. Det er vigtigt at bemærke, at det terapeutiske middel skal tilsættes før påbegyndelse af blodprop, når teg'en anvendes, da koagulationssystemet er funktionelt lukket, når instrumentet er i drift med stiften siddende i TEG-analysekoppen. Når det er sagt, teg er ude af stand til at blive brugt til at teste den terapeutiske profil af en trombolytisk middel i en eksisterende blodprop.
I denne protokol, begge analyser blev udført under deres almindeligt anvendte eksperimentelle betingelser. TEG udføres almindeligvis ved 37 °C, og turbiditetsanalyser udføres ved stuetemperatur (RT). Vægten af denne karakteriseringsmetode er at bestemme og fortolke de trendresultater, som en bestemt variabel har på koagulation. Vigtigere er det, at kontrollere temperaturen udnytte TEG er ligetil som reagenser er pipettet direkte ind i en temperaturstyret TEG kop. Temperaturkontrol i en turbiditetsanalyse er mindre ligetil, da koagulationsreagenser blandes og initieres i en brøndplade, før de placeres i et opvarmet spektrometer. Den hastighed, hvormed pladen og koagulationsopløsningen varm i kammeret er langsom i forhold til blodpropdannelseshastigheden og fastholdelse af alle reagenser og pladen ved forhøjet temperatur, før den sættes ind i det opvarmede kammer, kan være vanskelig og ofte resulterer i dårlig analysereformabilitet. Opretholdelse af en stabil temperatur, bortset fra stuetemperatur for turbiditet assays er yderligere kompliceret, når multiplexing på tværs af mange brønde. Et andet vigtigt skridt for at sikre en pålidelig og reproducerbar turbiditet resultat er at blande brønden til at indlede koagulation. Som direkte trombin-fibrinogen spaltning er hurtig, blanding af godt før blodprop indledning kan omgå ikke-ensartet fibrin dannelse.
Denne protokol kan også let ændres til at karakterisere en blodprop dannet af kliniske prøver såsom blodplade-rige plasma eller blodplade-fattige plasma. Citrated blod trækker anbefales, da de er blevet valideret tidligere af standard TEG protokoller. Trombocyt-rige og blodplade-fattige plasma kan adskilles fra citrated fuldblod via centrifugering ved 200 og over 2.000 x g i 15 min ved RT, hhv. I turbiditet eller TEG-analyser kan blodpropper påbegyndes med tilsætning af overskydende calciumchlorid (11 mM). Da fosfat kan binde sig til calcium, der resulterer i udfældning, bør PBS dog undgås, når calcium anvendes som blodprop igangsætter. Når man studerer blodprop-rige plasma blodprop dannelse, er det vigtigt at overveje blodplade afregning som en betydelig confounder, når du kører blodprop dannelse assays under forhold, hvor blodprop dannelse er langsom. Spørgsmål vedrørende ptændelsafregning er mindre virkningsfulde, når blodpropdannelsen er hurtig. Dette er især vigtigt for turbiditetsanalyser, hvor analysens nøjagtighed og reproducerbarhed i høj grad afhænger af homogeniteten af reagenserne i brønden. Hvis eksperimentelle design tillader det, kaolin (ofte brugt som en blodprop initiativtager til TEG) eller andre negativt ladede partikel aktivatorer kan bruges til at fremskynde plasma blodprop indledning ved at give yderligere overfladeareal for hurtigere kontakt vej aktivering af koagulation kaskade. Det er vigtigt, at aktivatorsuspensioner blandes grundigt med koagulationsopløsninger for at undgå bundfældning. Ved anvendelse af et overfladeareal eller en opladet partikelbaseret blodpropaktivator skal det sikres, at der tages hensyn til de nødvendige baggrundsbetjeningsforanstaltninger, da reagenserne selv kan bidrage til absorptivitet i turbiditetsanalyser. Derudover kan afregning være et problem med større partikelbaserede tilsætningsstoffer såsom kaolin.
Fuldblodsprøver bør behandles omhyggeligt, når man overvejer at anvende turbiditetsanalyser, da røde blodlegemer bidrager væsentligt til absorbans ved standard turbiditetsbølgelængder. Af denne grund overskrider målingen af fuldblod via turbiditet ofte detektionsgrænsen for de fleste spektrometre og er typisk ikke mulig. Alternative metoder til at karakterisere fuldblod kan være nødvendigt eller fortynding før kørsel turbiditet analyser på blodprøver, der indeholder røde blodlegemer er også muligt. TEG og turbiditet, når de anvendes sammen, giver omfattende blodprop dannelse og fordøjelse karakterisering ved at kombinere forskellige målinger for blodprop styrke og fibrin fiber / netværk morfologi for både stærkt kontrollerede minimal protein koagulationsanalyser og kliniske plasmaprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 4 Suppl 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L.
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
