Summary
La fibrina è responsabile della formazione di coaguli durante l'emostasi e la trombosi. I saggi di turbidità e il tromboelastograhy (TEG) possono essere utilizzati come strumenti sinergici che forniscono una valutazione complementare di un coagulo. Queste due tecniche insieme possono dare maggiori informazioni su come le condizioni di coagulazione influenzano la formazione di coaguli di fibrina.
Abstract
La trombosi è una delle principali cause di morte in tutto il mondo. La fibrina (ogen) è la proteina principalmente responsabile della formazione di coaguli o trombosi. Pertanto, caratterizzare la formazione di coaguli di fibrina è utile per lo studio della trombosi. Turbidità e tromboelastografia (TEG) sono entrambi ampiamente utilizzati in vitro saggi per monitorare la formazione di coaguli. La turbidità misura dinamicamente la trasmissione della luce attraverso una struttura di coagulo di fibrina attraverso uno spettrometro ed è spesso utilizzata nei laboratori di ricerca. TEG è una tecnica viscoelastica specializzata che misura direttamente la forza del coagulo di sangue ed è utilizzata principalmente in ambienti clinici per valutare l'emostasi dei pazienti. Con l'aiuto di questi due strumenti, questo studio descrive un metodo per caratterizzare un coagulo di fibrina in vitro utilizzando un modello semplificato di coagulo di fibrinogeno/trombina. Le tendenze dei dati in entrambe le tecniche sono state confrontate in varie condizioni di coagulazione. I coaguli di fibrina umana e bovina sono stati formati fianco a fianco in questo studio, poiché i fattori di coagulazione bovina sono spesso utilizzati come sostituti di fattori di coagulazione umana in ambienti clinici e di ricerca. I risultati dimostrano che TEG e la turbidità tracciano la formazione di coaguli attraverso due metodi distinti e, se utilizzati insieme, forniscono informazioni complementari sulla resistenza del coagulo e sulla struttura delle fibre in diverse condizioni di coagulazione.
Introduction
La trombosi è la formazione patologica di un coagulo di sangue nel corpo che blocca la circolazione sanguigna che porta ad alta morbilità e mortalità in tutto il mondo. Ci sono da 1 a 2 casi di tromboembolismo venoso e da 2 a 3 casi di malattie vascolari indotte dalla trombosi ogni 1000 personeall'anno 1,2. Presentato qui è un metodo che sfrutta la tromboelastografia (TEG) e la torbidità per monitorare la formazione di coaguli in varie condizioni di coagulazione. Fibrin(ogen) è la proteina primaria che è responsabile della formazione di coaguli nel corpo. Nelle fasi finali della cascata di coagulazione, i fibrinopeptidi vengono sciolti dal fibrinogeno da thrombin iniziando la polimerizzazione dei monomeri fibrin insolubili man mano che il coagulo sisviluppa 3,4. Per comprendere la formazione di coaguli nella trombosi patologica, è necessario caratterizzare la formazione di fibrina in diverse circostanze di coagulazione. Sono stati utilizzati più saggi di monitoraggio dei coaguli per studiare la formazione di coaguli di fibrina in vitro. Il tempo di prothrombina (PT/INR) e il tempo di tromboplastin parziale attivato (aPTT) sono due saggi clinici comuni che misurano l'integrità di una specifica via di coagulazione. Tuttavia, utilizzano il tempo come unica variabile che non fornisce alcuna indicazione delle proprietà fisiche del coagulo5. La microscopia elettronica consente la visualizzazione della microstruttura di un coagulo di fibrina completamente formato, ma non fornisce informazioni sul processo di formazione del coagulostesso 6. Tra tutti i saggi, i saggi di torbidità e TEG offrono la possibilità di monitorare dinamicamente le caratteristiche dei coaguli nel tempo. Queste tecniche consentono la misura di profili di coagulazione completi e, pertanto, forniscono qualche beneficio rispetto ad altri strumenti di caratterizzazione del coagulo di fibrina.
In particolare, i saggi di torbidità (o torbidimetria del coagulo) sono ampiamente utilizzati per la ricerca e le applicazioni cliniche grazie alla sua implementazione semplicistica e all'ampia accessibilità degli spettrometri nei laboratori di ricerca. Questo saggio permette una misurazione dinamica della trasmissione della luce attraverso un coagulo di formatura prendendo singole letture ripetitive a una lunghezza d'onda definita (più comunemente a una lunghezza d'onda nell'intervallo di 350 – 700 nm)7. La temperatura nella camera di lettura può anche essere regolata. Con la forma del gel fibrina, la quantità di luce che viaggia attraverso la rete proteica si riduce causando un aumento dell'assorbimento nel tempo. Allo stesso modo, l'assorbimento diminuisce quando la rete di coaguli si degrada. I saggi di turbidità possono essere facilmente multiplex utilizzando un formato di piastra multi-pozzo per consentire lo screening del campione ad alta velocità effettiva in entrambe le piastre 96 e 384-well. Diverse caratteristiche del coagulo possono essere derivate da una curva di tracciamento della torbidità (assorbimento nel tempo di misurazione) che includono: massima torbidità, tempo alla torbidità massima, tempo per l'insorgenza del coagulo e tasso di formazione dei coaguli (Vmax). Un rapporto massa/lunghezza in fibra di fibrina può anche essere derivato dai dati grezzi di torbidità per stimare lo spessore della fibra di fibrina8,9,10.
TEG è utilizzato principalmente nell'ambiente clinico per valutare l'emostasi e la lisi coagulata dei pazienti. È anche comunemente usato in applicazioni chirurgiche per determinare quando i farmaci anti-fibrinolitici o prodotti ematici emostatici devono essere somministrati11,12. La formazione di coaguli avviene all'interno di una tazza TEG con tutti i componenti di coagulazione aggiunti alla coppa prima dell'inizio del saggio. La coppa, con coagulo in evoluzione, ruota fisicamente contro un perno che viene inserito nel suo centro e un sensore di torsione elettromeccanica misura la crescente forza viscoelastica del coagulo. Questo saggio viene in genere effettuato alla temperatura fisiologica di 37 gradi centigradi; tuttavia, la temperatura può essere regolata manualmente sullo strumento. L'ampiezza massima (MA), la velocità di reazione (R), il tempo di cinetica (K), l'angolo di z (Angolo) e il tempo di ampiezza massima (TMA) vengono estratti dal software TEG dal tracciamento DINAMICO TEG. Questi valori vengono in genere confrontati con intervalli normali clinici per valutare lo stato di coagulazione di un paziente. Mentre TEG non è esattamente un viscometro, in quanto misura la forza del coagulo in unità millimetriche, fornisce importanti dati di coaguli viscoelastici e funziona come un prezioso strumento decisionale clinico per i medici per decidere di amministrare specifici prodotti sanguigni e regolare il dosaggio terapeutico13. Quando si utilizzano insieme sia i saggi TEG che i saggi di torbidità, forniscono informazioni complementari sulla caratterizzazione dei coaguli, poiché la forza del coagulo e la cinetica sono facilmente estratte dallo spessore della fibra teG e lo spessore della fibra di fibrina è accessibile mediante misurazioni ottiche della torbidità.
Poiché la fibrina è una componente critica di un coagulo di sangue, la caratterizzazione del coagulo di fibrina in diverse condizioni di formazione dei coaguli può fornire preziose informazioni su come una variabile specifica contribuisce al processo di formazione del coagulo e alle proprietà finali del coagulo. Comprendere questo può fornire indicazioni per la diagnosi di trombosi e lo sviluppo di terapie. Per ottenere una caratterizzazione del coagulo di fibrina più rappresentativa, il plasma può essere sostituito per monitorare la formazione di coaguli in quanto assomiglia più da vicino alle condizioni di coagulazione in vivo rispetto a un sistema di modelli fibrinogeni/trombini semplificato. Tuttavia, a causa dell'intricata natura della cascata di coagulazione, la formazione di coaguli utilizzando il plasma aumenta la complessità, rendendo più difficile isolare l'impatto dei singoli fattori. L'utilizzo di un modello semplificato di fibrinogeno/trombo impedisce la necessità di avviare l'intera cascata di coagulazione consentendo l'isolamento della fase finale della formazione della fibrina. Includendo due componenti di formatura di fibrina principali (fibrinogeno e trombano), questa configurazione crea una condizione di formazione del coagulo altamente controllata. È anche importante notare che, mentre qui viene utilizzato il modello di coagulo semplificato, questo protocollo può essere utilizzato anche per caratterizzare coaguli più complessi includendo ulteriori fattori di coagulazione. In questo studio, la caratterizzazione del coagulo di fibrina utilizzando torbidità e TEG viene effettuata variando concentrazioni di fibrinogeno e trombano, forza ionica, pH e concentrazione totale di proteine nella soluzione di coagulazione per imitare diverse circostanze di coagulazione in vivo14. I dettagli relativi a queste variazioni del protocollo sono stati inclusi nella Sezione 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione della salina tampone di fosfati (PBS)
NOTA: PBS è stato utilizzato in tutto questo studio in quanto gli saggi descritti non richiedevano l'aggiunta di calcio. È importante notare che quando si aggiunge calcio, spesso utilizzato per ri-calcificare i prodotti sanguigni citratti, PBS dovrebbe essere evitato come calcio è noto per precipitare in tamponi di fosfati.
- Fare un tampone di 0,01 M, pH 7,4 PBS mescolando 137 mM di cloruro di sodio, 1,8 mM di monobasico di fosfato di potassio, 10 mM dibasico di sodio e cloruro di potassio 2,7 mM in acqua DI.
- Verificare il pH tampone utilizzando una sonda pH e regolare il pH utilizzando idrossido di sodio o acido cloridrico in base alle esigenze.
- Utilizzare questo PBS per la preparazione di fibrinogeno e saggi di coagulazione (se non diversamente specificato).
NOTA: Si suggerisce di ricostituire la polvere di fibrinogeno poiché la reidratazione nell'acqua DI può provocare precipitazioni di fibrinogeno anche a 37 gradi centigradi.
2. Preparazione e stoccaggio delle proteine
NOTA: Nel corso del protocollo le concentrazioni di stock proteico vengono preparate a diverse concentrazioni per torbidità e TEG per consentire il rapporto costante di sale, acqua DI, PBS e altri fattori residui nelle soluzioni di coagulazione finali.
- Preparazione e conservazione del fibrinogeno
NOTA: I contaminanti nei fibrinogeni disponibili in vendita includono una quantità significativa di fattore XIII, quantità residue di altri fattori di coagulazione, tampone di stoccaggio e sali. In presenza di calcio, fattore XIII è noto per crosslink la rete di coaguli di fibrina. Questo effetto contribuisce a una struttura di coaguli serrata e a una maggiore resistenza al coagulo che influisce sulla caratterizzazione della fibrina. I kit di attività disponibili in modo commerciale possono essere utilizzati per determinare i livelli di fattore attivo XIIIa. Per ridurre al minimo la variabilità causata dal fattore XIIIa, gli esperimenti devono essere progettati con l'esclusione del calcio o ulteriori passaggi per rimuovere il fattore XIIIa dovrebbero essere incorporati in questo protocollo. Inoltre, è necessario valutare il sale di immagazzinamento delle proteine e il tipo di tampone e, se necessario, eseguire la dialisi per il trasferimento in un buffer di lavoro di analisi preferito.- Pesare e aliquot polvere di fibrinogeno licofilizzato (bovino o umano) in tubi da 2 mL a 20 mg di proteine per tubo e conservare le quotte a -20 gradi centigradi per un massimo di 6 mesi.
- Lasciare che il fibrinogen aliquot si acclimata a RT (temperatura ambiente) per 10 minuti il giorno dell'esperimento. Ricostituire il fibrinogeno aggiungendo 600 L di PBS all'aliquot 20 min prima dell'uso.
- Prendere 10 L di fibrinogeno e diluirlo con 190 L di PBS in una piastra UV trasparente a 96 po ' o una cuvette. Determinare la concentrazione di fibrinogeno prendendo l'assorbimento a 280 nm tramite uno spettrometro commerciale e il suo software.
- Calcolare la concentrazione di fibrinogeno (mg/mL) utilizzando la legge della birra. Preparare le soluzioni di stock di fibrinogeno da 12 mg/mL (per i test di torbidità) e 3,2 mg/mL (per TEG) per un'ulteriore diluizione con PBS (se non diversamente specificato).
NOTA: Determinazione della concentrazione di fibrinogeno (mg/mL) dalla legge della birra:
Coefficiente di estinzione molare: ɛ 513.400 L mol-1 cm-1 a 280 nm; Lunghezza del percorso (L); Fattore di diluizione (D); Il peso molecolare (MW) - 340.000 Da. ɛ è derivato moltiplicando E0,1% - 1,51 (280 nm) (coefficiente di estinzione, dato dal fornitore) con MW.
- Preparazione e stoccaggio della tromba
- Trombose lyophilized ricostituito (bovino o umano, 1000 U stock) in 200 L di acqua deionizzata (DI) per fare 200 L di 5000 U/mL soluzione di stock di trombino.
- Fare 5 aliquots (20 U/tube) della soluzione e mantenere gli aliquots congelati a 20 gradi centigradi.
- Scongelare gli aliquots tromboni a RT per 15 min il giorno dell'esperimento e fare la soluzione di lavoro trombante diluizione a 20 U/mL per saggi di torbidità e 18 U/mL per TEG con acqua DI (se non diversamente specificato).
NOTA: Precauzioni devono essere prese per mantenere l'attività enzimatica che può essere eseguita mantenendo gli enzimi sul ghiaccio durante lo scongelamento e l'uso; tuttavia, nessuna riduzione dell'attività di tromba è stata osservata quando utilizzata direttamente dopo lo scongelamento a RT.
3. Turbidità
- Utilizzare qualsiasi spettrometro disponibile in modo commerciale con un intervallo di assorbimento di 350 - 700 nm e un software corrispondente per monitorare la torbidità del coagulo nel tempo (vedere Tabella dei materiali).
- Accendere lo spettrometro e aprire il software di analisi corrispondente.
- Selezionare la piastra 1 e aprire la scheda Impostazioni piastra. Fare clic su Modalità ABS e Cinetico per monitorare una lettura dinamica dell'assorbimento nel tempo.
- Selezionare 550 nm (o qualsiasi valore compreso tra 350 e 700 nm) nella scheda Lunghezza d'onda e regolare il tempo di esecuzione totale in modo che sia di 60 min con un intervallo di 30 s nella scheda temporizzazione. Selezionare i pozzetti di interesse per la lettura evidenziando i pozzetti. Se necessario, regolare altre impostazioni.
NOTA: La selezione di una lunghezza d'onda all'estremità inferiore dell'intervallo (circa 350 nm) porta una migliore sensibilità, ma l'assorbimento potrebbe anche superare il limite di rilevamento dello spettrometro. La lunghezza d'onda più comunemente utilizzata per la misurazione della torbidità è di 405 nm in letteratura; tuttavia, questo protocollo utilizza 550 nm per garantire che i valori di torbidità dinamica siano entro il limite di rilevamento per tutti gli esperimenti. L'intervallo di lettura selezionato deve essere il più breve possibile per ottenere il massimo livello di sensibilità al saggio. Questo dipenderà dallo spettrometro e dal numero di pozzi letti durante un dato saggio. - Prendere una piastra UV trasparente a 96 po '. Pipette 140 PBS in un pozzo selezionato per la lettura. Aggiungere e mescolare 10 L di tromba (20 U/mL) nel pozzo.
NOTA: Non utilizzare piastre di analisi ad alta legante per ridurre al minimo il legame proteico non specifico alla superficie del pozzo. Questo potrebbe influenzare la dispersione delle proteine nella soluzione e provocare un'elevata variabilità del saggio. - Iniziare immediatamente la coagulazione aggiungendo 50 L di fibrinogeno (12 mg/mL) nel pozzo per ottenere una soluzione di coagulazione di 200 lL con una concentrazione finale di 3 mg/mL di fibrinogeno e 1 trombo U/mL. Mescolare il contenuto nel pozzo pipettando su e giù cinque volte facendo attenzione a evitare la creazione di bolle nella soluzione in quanto avranno un impatto sull'assorbimento disperdendo la luce.
NOTA: Utilizzare una pipetta multicanale quando si eseguono più campioni di coagulo sulla stessa piastra contemporaneamente. Registrare le differenze di tempo tra i pozzetti e il periodo di tempo prima della prima lettura dallo strumento per compensare i tempi di coagulazione. - Posizionare la piastra 96-well nel supporto e fare clic su Start nel software per avviare la lettura torbidità a RT.
NOTA: Se si effettua il test ad una temperatura elevata, lo spettrometro, la piastra e i reagenti devono essere tutti mantenuti alla temperatura desiderata prima dell'inizio del coagulo. - Una volta completati, recuperare i dati di torbidità e ottenere una curva di tracciamento della torbidità tracciando la modifica dell'assorbimento nel tempo in un software di plottaggio.
- Derivare TurbMax (massima torbidità indicativa dello spessore della fibra di fibrina e densità di rete di fibrina) prendendo il valore massimo di assorbimento della curva nel tempo.
NOTA: il rapporto massa/lunghezza in fibra di fibrina può essere calcolato in base ai valori di torbidità utilizzando l'equazione fornita nel seguente manoscritto8. - Calcola la torbidità massima del 90% moltiplicando TurbMax per il 90%. Derivare Il tempoTurb dal tempo di calcolo dall'avvio del coagulo al 90% di torbidità massima.
NOTA: Il tempo al 90% di torbidità massima è una metrica più affidabile del tempo alla massima torbidità assoluta in quanto rappresenta meglio il tempo di coagulo eliminando il periodo di formazione del coagulo finale altamente variabile. Ulteriori parametri di coagulazione come il tempo di insordetta del coagulo (tempo dall'inizio del test a quando l'assorbimento inizia ad aumentare) e il tasso di formazione dei coaguli (Vmax, la pendenza più grande della regione lineare nella curva di tracciamento della torbidità) possono anche essere estratti dalle tracciazioni di torbidità.
4. Tromboelastografia (TEG)
- Accendere l'analizzatore di tromboelastografo e attendere che la temperatura si stabilizzi a 37 gradi centigradi.
- Aprire TEG - software. Una volta effettuato l'accesso, crea un nome di esperimento nella sezione ID.
- Eseguire un e-test per tutti i canali seguendo le istruzioni del software sullo schermo. Posizionare la leva nella posizione di carico una volta completati tutti i controlli.
NOTA: È necessario un test e-test TEG che deve essere condotto ogni volta che si utilizza lo strumento. I test di controllo della coagulazione TEG (utilizzando i controlli TEG di livello 1 e di livello 2) sono necessari a intervalli suggeriti dal produttore quando vengono utilizzati per campioni clinici. - Fare clic sulla scheda TEG, immettere informazioni di esempio per i canali che verranno utilizzati. Inserire una tazza TEG trasparente non rivestita nel canale corrispondente. Far scorrere il supporto verso l'alto e premere la tazza inferiore 5 volte per apporre il perno alla canna da torsione. Abbassare il supporto e premere la tazza verso il basso nella base del vettore fino a quando non "clic".
- Pipette 20 L di soluzione di tromba (18 U/mL) nella tazza TEG. Iniziare immediatamente la coagulazione aggiungendo 340 L di fibrinogeno (3,2 mg/mL) nella tazza TEG per ottenere una soluzione di coagulazione di 360 L con una concentrazione finale di 3 mg/mL di fibrinogeno e 1 tromba U/mL nella tazza. Mescolare il contenuto pipettando su e giù cinque volte.
NOTA: I potenziali fattori di coagulazione o altri componenti di interesse devono essere aggiunti durante questa fase facendo attenzione a mantenere sempre un volume finale di 360 L nella coppa TEG. - Far scorrere il supporto caricato tazza verso l'alto, spostare la leva nella posizione di lettura e fare clic su Avvia nel software per avviare la lettura TEG.
- Una volta completato IL TEG (dopo circa un'ora), recuperare i parametri TEG e ottenere una curva di ricalco TEG tracciando l'ampiezza nel tempo in un software di plottaggio.
- Raccogliere MA come TEGMax (l'ampiezza massima è indicativa della forza del coagulo) e TMA come tempoTEG (tempo alla massima ampiezza) dal software.
NOTA: MA è calcolato dal software come l'ampiezza massima al momento in cui l'ampiezza ha meno di una deviazione del 5% in un periodo di tempo di 3 minuti. La TMA viene determinata come il tempo dalla velocità massima di generazione del trombo (vicino al punto di divisione) all'oggetto MA. Altri parametri potrebbero anche essere utili per valutare quando si esegue l'analisi del coagulo. Alcuni esempi di questi parametri includono: R-time (il tempo dall'inizio del test a quando l'ampiezza raggiunge 2 mm), K (il tempo dalla fine di R a quando l'ampiezza raggiunge i 20 mm), alfa (pendenza della linea tra R e K) e CLT (tempo di lisi del coagulo).
5. Caratterizzazione della fibrina in diverse condizioni di coagulazione
NOTA: Eseguire esperimenti di caratterizzazione della fibrina modulando una variabile specifica nelle soluzioni di coagulazione come: concentrazioni di fibrinogeno e trombano, forza ionica, pH e concentrazioni totali di proteine. I preparativi sperimentali con queste variabili di esempio sono descritti in questa sezione; tuttavia, possono essere sostituiti anche altri fattori di coagulazione e condizioni di interesse. Selezionare con attenzione un sistema di buffer adatto tenendo conto di ogni requisiti di analisi unici. Per i test di torbidità e TEG, includere un controllo solo buffer per garantire una sottrazione accurata dello sfondo durante l'analisi dell'effetto di queste variabili.
- Concentrazione variabile di fibrinogeno (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL)
- Regolare il punto 2.1.4 per preparare lo stock di fibrinogeno a concentrazioni diverse (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL per i saggi di torbidità e 1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/mL per TEG).
- Regolare il passo 3.6 per "aggiungere 50 fibrinogeno 50 L (4, 8, 12, 16, 20 mg/mL) in più pozzetti del pozzo 96" per i saggi di torbidità.
- Regolare il passo 4.5 per "aggiungere 340 fibrinogeno L (1.1, 2.1, 3.2, 4.2, 5.3 mg/mL) in coppe TEG chiare" per TEG.
- Concentrazione di tromba variabile (0.1, 0.3, 0.6, 0.8, 1, 2.5, 5, 10 U/mL)
- Regolare il punto 2.2.3 per preparare lo stock di tromba a concentrazioni diverse (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL per saggi di torbidità e 1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL per TEG).
- Regolare il passo 3.5 per "aggiungere 10 trombo di L (2, 6, 12, 16, 20, 50, 100, 200 U/mL) in più pozzi del 96 well-plate" per i saggi di torbidità.
- Regolare il passo 4.5 in "pipette 20 N. 20 N. L (1.8, 5.4, 10.8, 14.4, 18, 45, 90, 180 U/mL) in coppe TEG chiare" per TEG.
- Potenza ionica variabile (0,05, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,17 e 0,3 M)
- Sciogliere il cloruro di sodio (21, 101, 111, 121, 131, 141 e 271 mM) insieme a 1,8 mM di monobasic di fosfato di potassio, 10 mM dibasic di sodio e cloruro di potassio 2,7 mM in acqua DI per realizzare soluzioni PBS da 0,01 M con diverse forze ioniche.
- Regolare il passo 1.3 per utilizzare PBS realizzato a diversi punti di forza ionici per preparare soluzioni di fibrinogeno e coagulazione sia per i saggi di torbidità che per teG.
- PH variabile (5.8, 6.6, 7.3, 7.4, 7.5 e 8.0)
- Sciogliere il fosfato di sodio (0.7, 3.2, 7.7, 8.1, 8.4, 9.5 mM) e il monobasico di fosfato di potassio (8.2, 6.0, 2.0, 1,7, 1,4, 0,5 mM) insieme a 2,7 mM di cloruro di potassio e cloruro di sodio (153, 147, 138, 137, 136, 134 mM) per realizzare soluzioni PBS da 0,01 M con pH variabile e una forza ionica finale a 0,165 M.
- Verificare il valore del pH del buffer tramite la sonda pH e regolare il pH, se necessario.
- Regolare il passo 1.3 per utilizzare PBS realizzato a diversi pH per preparare la soluzione di fibrinogeno e coagulazione sia per i saggi di torbidità che per teG.
- Concentrazione di albumina variabile (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL)
- Sciogliere 2 g di albumina lolia in 500 L di PBS a RT per 20 min il giorno dell'esperimento.
- Determinare la concentrazione di albumina utilizzando la stessa procedura di cui ai punti 2.1.3 e 2.1.4 con un coefficiente di estinzione mol di 43.800 Lmol 1 cm1 (a 280 nm) per l'albumina.
- Preparare lo stock di albumin a diverse concentrazioni.
- Regolare il passo 3.5 su "Pipette 40 PBS in un pozzo selezionato per la lettura e aggiungere 10 tromba L (20 U/mL)". Regolare il passaggio 3.6 su "Avviare immediatamente la coagulazione aggiungendo 50 fibrinogeno l(12 mg/mL) con 100 albumina L (0, 40, 80, 100, 120, 160, 200 mg/mL) in pozzi multipli ad una concentrazione finale di 3 mg/mL di fibrinogeno, 1 trombina U/mL e 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL albumin nei pozzi."
- Regolare il passaggio 4.5 su "Avviare immediatamente la coagulazione aggiungendo una miscela di albumina da 200 72, 90, 108, 144, 180 mg/mL) e 140 L 7,7 mg/mL fibrinogen nelle tazze TEG per ottenere una soluzione di coagulazione a 360 L con una concentrazione finale di 3 mg/mL di fibrinogeno, 1 tromba U/mL e 0, 20, 40, 50, 60, 80, 100 mg/mL albumina nelle tazze TEG."
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gli esperimenti mostrati nella Figura 1 sono curve rappresentative di torbidità che tracciano le curve dei coaguli di fibrina umana e bovina a diversi livelli di fibrinogeno. Nella Figura 2 sono illustrate le curve di tracciamento TEG rappresentative per la formazione di coaguli di fibrina a diversi livelli di fibrinogeno. Entrambe le curve di tracciamento dimostrano che dopo un periodo di ritardo dopo l'iniziazione del coagulo, la torbidità del coagulo o l'ampiezza del coagulo aumenta nel tempo e si distoglie alla fine della formazione di coaguli. Un valore finale della formazione massima di coaguli e il tempo per la formazione massima di coaguli da ogni saggio vengono utilizzati per valutare le caratteristiche di un coagulo completamente formato e il processo di coagulazione generale. La torbidità massima (TurbMax) e il tempo massimo di torbidità (TurbTime)sono i due parametri derivati dalla torbidità, mentre l'ampiezza massima (TEGMax)e il tempo di ampiezza massima (TEGTime)derivano da TEG.
Inoltre, TurbMax è una misura ottica della struttura del coagulo che è indicativa dello spessore della fibra di fibrina e della densità della rete di fibrina. TEGMax è una misura meccanica che riflette la forza assoluta del coagulo. Essi rappresentano diversi aspetti di un coagulo che può cambiare indipendentemente l'uno dall'altro in base ai nostri precedentirisultati 14. Nel loro insieme, i due valori forniscono informazioni complementari sulle microstrutture dei coaguli, come ad esempio la densità delle fibre nella rete di fibrin. Per vedere in modo esplicito come la modulazione di una variabile di coagulazione influisce sui risultati, i dati sono stati ulteriormente organizzati e presentati utilizzando grafici di tendenza. Esempi rappresentativi di tendenze dei dati torbidità e TEG sono illustrati nella Figura 3. A un livello più elevato di fibrinogeno nella soluzione di coagulazione, tutti e quattro i valori (TurbMax, TEGMax, TurbTime e TEGTime) aumentano. Da questi risultati, si può interpretare che un livello di substrato di fibrinogeno più alto si traduce in una rete fibrosa più densa che limita la trasmissione della luce attraverso il coagulo (più grande TurbMax). Questa rete serrata migliora anche la resistenza del coagulo (più grande TEGMax). L'allungamento sia del tempoTurb che del tempoTEG indica che la polimerizzazione della fibrina è ostacolata a livelli di fibrinogeno aumentati. Le tendenze di TurbMax e TEGMax per le variabili testate dal nostro gruppo e le loro interpretazioni sono mostrate nella Tabella 1.
Figura 1: Esempi rappresentativi di curva di tracciamento della torbidità dei coaguli (da 0 a 30 min). La turbidità traccia della formazione di fibrina bovina (A) e umana (B) nel tempo a diverse concentrazioni di fibrinogeno (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL) con 1 specie U/mL abbinate a trombano. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempi rappresentativi di curva di ricalco TEG (da 0 a 30 min). La formazione di fibrinità TEG di bovini (A) e umani (B) nel tempo a diverse concentrazioni di fibrinogeni (1, 2, 3, 4, 5 mg/mL) con 1 specie U/mL abbinate a tromba. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Esempi rappresentativi di torbidità e tendenze dei dati TEG. Tendenze dei dati di TurbMax e TurbTime (A) e tendenze di TEGMax e TEGTime (B) per diverse concentrazioni di fibrinogeno bovino o umano (1, 2, 3, 4, 5 mg/ml) con specie 1U/mL corrispondenti al trombino. Tutti i punti dati e le barre di errore sono medie e deviazioni standard di triplicati (Turbidity) e duplicati (TEG). Questa cifra è stata riutilizzata da [Eng, 2020]14. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Variabili | Risultati tendenza | Interpretazioni |
| Aumento del livello di fibrinogeno | Aumento di TurbMax e TEGMax | Formazione di fibre di fibrina più strette e una rete fibrosa più densa |
| Aumento del livello di trombano, pH e forza ionica | Diminuzione DelMassimoTurb , AUMENTO del TEGMax | Formazione di fibre di fibrina più sottili e strette |
| Aumento del livello di albumina | Aumento del valoremassimo Turb, Diminuzione TEGMax | Formazione di fibre di fibrina più spesse e più sciolte |
Tabella 1: Risultati e interpretazioni di TurbMax e TEGMax.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo dimostra l'utilizzo di due distinti strumenti di caratterizzazione del coagulo che testano un modello semplificato di coagulo fibrinogen/trombo utilizzando componenti disponibili in modo commerciale. Sia TEG e turbidity saggi sono facili da condurre. Non solo forniscono esami del coagulo del punto finale come la formazione di coaguli max (TurbMax e TEGMax) e i tempi di formazione dei coaguli (Tempo diTurb e TempoTEG),ma valutano anche il processo di formazione dinamica del coagulo. Questo rende TEG e torbidità strumenti preziosi per la caratterizzazione del coagulo da aggiungere a metodi alternativi come: SEM, PT, aPTT, o la reologia del coagulo, che possono avere complicate procedure sperimentali o concentrarsi solo sulla sperimentazione di un singolo aspetto coagulo. I risultati di Turbidity e TEG insieme offrono anche un profilo più completo di come una variabile di coagulazione influisce sulle caratteristiche dei coaguli.
Oltre alle variabili di coagulazione descritte in questo protocollo, ci sono molte altre variabili che possono essere studiate sfruttando queste tecniche. Questo protocollo può essere modificato regolando: temperatura, livelli di calcio, livelli di fattore di coagulazione, l'aggiunta di attivatori di coaguli o inibitori, o l'aggiunta di agenti farmaceutici, per nominare alcuni. Queste variabili possono potenzialmente essere studiate utilizzando sia il sistema di modello fibrinogeno/trombonico semplificato che l'utilizzo di plasma. Lo studio dei fattori di coagulazione richiede un'attenta considerazione e configurazione essendo sicuri di fornire una corretta attivazione del coagulo a monte che avvia il percorso di coagulazione. Turbidità e TEG sono anche strumenti efficaci utilizzati per monitorare la digestione dei coaguli. Il protocollo può essere modificato per caratterizzare la formazione di coaguli di fibrina e la lisi in presenza di anticoagulanti o agenti trombolitici. È importante notare che l'agente terapeutico deve essere aggiunto prima dell'inizio del coagulo quando si utilizza TEG poiché il sistema di coagulazione è funzionalmente chiuso quando lo strumento è in funzione con il perno seduto nella coppa di analisi TEG. Detto questo, TEG non è in grado di essere utilizzato per testare il profilo terapeutico di un agente trombolitico in un coagulo esistente.
In questo protocollo, entrambi i saggi sono stati condotti sotto le loro condizioni sperimentali comunemente utilizzate. TeG è comunemente eseguito a 37 gradi centigradi e i test di torbidità vengono eseguiti a temperatura ambiente (RT). L'enfasi di questo metodo di caratterizzazione è quello di determinare e interpretare i risultati di tendenza che una variabile specifica ha sulla coagulazione. È importante sottolineare che il controllo della temperatura utilizzando TEG è semplice, in quanto i reagenti vengono pipetted direttamente in una tazza TEG a temperatura controllata. Il controllo della temperatura in un saggio di torbidità è meno semplice in quanto i reagenti di coagulazione vengono mescolati e avviati in una piastra di pozzo prima di essere collocati all'interno di uno spettrometro riscaldato. La velocità con cui la piastra e la soluzione di coagulazione si riscaldano all'interno della camera è lenta rispetto alla velocità di formazione del coagulo e mantenere tutti i reagenti e la piastra a temperatura elevata prima di essere collocati nella camera riscaldata può essere difficile e spesso si traduce in scarsa riproducibilità del saggio. Mantenere una temperatura costante diversa dalla temperatura ambiente per i saggi di torbidità è ulteriormente complicato quando multiplexing in molti pozzi. Un altro passo critico per garantire un risultato di torbidità affidabile e riproducibile è mescolare il pozzo per iniziare la coagulazione. Poiché la scissione tromba-fibrinogena diretta è rapida, mescolando il pozzo prima dell'iniziazione del coagulo può eludere la formazione di fibrina non uniforme.
Questo protocollo può anche essere facilmente modificato per caratterizzare un coagulo formato da campioni clinici come plasma ricco di piastrine o plasma povero di piastrine. Le estrazioni di sangue citrato sono raccomandate in quanto sono state convalidate in precedenza da protocolli TEG standard. Il plasma ricco di piastrine e povero di piastrine può essere separato dal sangue intero citrato tramite centrifugazione rispettivamente a 200 e oltre 2.000 x g per 15 min a RT. Nei test di torbidità o TEG, i coaguli possono essere avviati con l'aggiunta di cloruro di calcio in eccesso (11 mM). Tuttavia, poiché il fosfato può legarsi al calcio con conseguente precipitazione, PBS dovrebbe essere evitato quando il calcio viene utilizzato come iniziatore del coagulo. Quando si studia la formazione di coaguli di plasma ricchi di piastrine, è importante considerare l'assestamento delle piastrine come un confonditore significativo quando si eseguono test di formazione di coaguli in condizioni in cui la formazione di coaguli è lenta. I problemi relativi all'assestamento delle piastrine sono meno impattanti quando la formazione del coagulo è rapida. Ciò è particolarmente importante per i saggi di torbidità in cui la precisione e la riproducibilità del saggio si basano in gran parte sull'omogeneità dei reagenti nel pozzo. Se la progettazione sperimentale lo consente, il caolin (spesso utilizzato come iniziatore di coaguli per TEG) o altri attivatori di particelle caricati negativamente possono essere utilizzati per accelerare l'avvio del coagulo di plasma fornendo ulteriore superficie per un'attivazione più rapida del percorso di contatto della cascata di coagulazione. È importante sottolineare che le sospensioni dell'attivatore devono essere mescolate accuratamente con soluzioni di coagulazione per evitare l'insediamento. Quando si utilizza una superficie o un attivatore di coaguli a base di particelle cariche, assicurarsi che i controlli di fondo necessari siano presi in considerazione in quanto i reagenti stessi possono contribuire all'absorptivity nei saggi di torbidità. Inoltre, la liquidazione può essere un problema con additivi più grandi a base di particelle come il kaolin.
I campioni di sangue intero devono essere elaborati con attenzione quando si considera l'uso di saggi di torbidità poiché i globuli rossi contribuiscono in modo significativo all'assorbimento alle lunghezze d'onda di torbidità standard. Per questo motivo, la misurazione del sangue intero tramite torbidità spesso supera il limite di rilevamento della maggior parte degli spettrometri e in genere non è fattibile. Metodi alternativi per caratterizzare il sangue intero possono essere necessari o diluizione prima di eseguire saggi di torbidità su campioni di sangue che contengono globuli rossi è anche possibile. TEG e torbidità, se usati insieme, forniscono una formazione completa di coaguli e caratterizzazione della digestione combinando misurazioni distinte per la forza del coagulo e la morfologia della fibra/rete di fibrina sia per i saggi minimi di coagulazione delle proteine altamente controllati che per i campioni clinici di plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Nessuno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate | Corning | 3635 | Non-treated acrylic copolymer, non-sterile |
| Albumin from human serum | Millipore Sigma | A1653 | ≥96%, lyophilized powder |
| Arium Mini Plus Ultrapure Water System | Sartorius | NA | DI water source |
| Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A2153 | ≥96%, lyophilized powder |
| Disposable Cups and Pins for TEG 5000 (Clear) | Haemonetics | REF 6211 | |
| Fibrinogen, Bovine Plasma | Millipore Sigma | 341573 | contains more than 95% clottable protein |
| Fibrinogen, Plasmingogen-Depleted, Human Plasma | Millipore Sigma | 341578 | Contains ≥ 95% clottable proteins. |
| Phosphate buffered saline | Millipore Sigma | P3813 | Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | 60130 | ≥99.5% purity |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P9791 | ≥98% purity |
| SevenEasy pH Meter | Mettler Toledo | S20 | |
| Sodium chloride | Millipore Sigma | 71378 | ≥99.5% purity |
| Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | 71636 | ≥99.5% purity |
| SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system | Molecular Devices | M5 | |
| TEG 5000 Thrombelastograph Hemostasis analyzer system | Haemonetics | 07-022 | |
| Thrombin, Bovine | Millipore Sigma | 605157 | |
| Thrombin, Human Plasma, High Activity | Millipore Sigma | 605195 |
References
- Beckman, M. G., Hooper, W. C., Critchley, S. E., Ortel, T. L. Venous Thromboembolism. A Public Health Concern. American Journal of Preventive Medicine. 38, 4 Suppl 495-501 (2010).
- Goldhaber, S. Z., Bounameaux, H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. The Lancet. 379 (9828), 1835-1846 (2012).
- Weisel, J. W., Litvinov, R. I. Mechanisms of fibrin polymerization and clinical implications. Blood. 121 (10), 1712-1719 (2013).
- Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50 (6), 1079-1093 (1986).
- Tripathi, M. M., et al. Clinical evaluation of whole blood prothrombin time (PT) and international normalized ratio (INR) using a Laser Speckle Rheology sensor. Scientific Reports. 7 (1), 1-8 (2017).
- Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L.
- Carr, M. E., Hermans, J. Size and Density of Fibrin Fibers from Turbidity. Macromolecules. 11 (1), 46-50 (1978).
- Carr, M. E., Shen, L. L., Hermans, J. A. N., Chapel, H. Mass-Length Ratio of Fibrin Fibers from Gel Permeation and Light Scattering. 16, 1-15 (1977).
- Gabriel, D. A., Muga, K., Boothroyd, E. M. The Effect of Fibrin Structure on Fibrinolysis. , 24259-24263 (1992).
- Wolberg, A. S., Gabriel, D. A., Hoffman, M. Analyzing fibrin clot structure using a microplate reader. Blood Coagulation and Fibrinolysis. 13 (6), 533-539 (2002).
- da Luz, L. T., Nascimento, B., Rizoli, S. Thrombelastography (TEG): practical considerations on its clinical use in trauma resuscitation. Scandinavian Journal of Trauma, Resuscitation and Emergency Medicine. 21 (1), 29 (2013).
- Whitten, C. W., Greilich, P. E. Thromboelastography: past, present, and future . Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 92 (5), 1223-1225 (2000).
- Ranucci, M., Laddomada, T., Ranucci, M., Baryshnikova, E. Blood viscosity during coagulation at different shear rates. Physiological Reports. 2 (7), 1-7 (2014).
- Zeng, Z., Fagnon, M., Nallan Chakravarthula, T., Alves, N. J. Fibrin clot formation under diverse clotting conditions: Comparing turbidimetry and thromboelastography. Thrombosis Research. 187, 48-55 (2020).
