Methodenartikel

Isolierung und Kultivierung von MandibularKnochenmark Mesenchymal Stammzellen bei Ratten

DOI:

10.3791/61532

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25. August 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Craniofacial Orthodontics, Department of Oral and Cranio-maxillofacial Science, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology, 2The 2nd Dental Center, Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Stomatology & Shanghai Research Institute of Stomatology, National Clinical Research center of Stomatology

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel stellt eine Methode vor, die die vollständige Knochenmarkhaftung und die Durchflusszytometrie-Sortierung für die Isolierung, Kultivierung, Sortierung und Identifizierung von mesenchymalen Knochenmarkstammzellen aus Rattenunterkiefern kombiniert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier präsentieren wir eine effiziente Methode zur Isolierung und Kultivierung von mandibulären Knochenmarkmesenchymalstammzellen (mBMSCs) in vitro, um schnell zahlreiche hochwertige Zellen für experimentelle Anforderungen zu erhalten. mBMSCs könnten in Zukunft aufgrund der hervorragenden Selbsterneuerungsfähigkeit und des Differenzierungspotenzials mit mehreren Linien in therapeutischen Anwendungen als gewebetechnische Zellen bei craniofacial-Erkrankungen und der cranio-maxillofacial Regeneration weit verbreitet sein. Daher ist es wichtig, mBMSCs in großer Zahl zu erhalten.

In dieser Studie wurde das Knochenmark aus dem Unterkiefer gespült und primäre mBMSCs wurden durch den Anbau an ganze Knochenmark-Anhänger isoliert. Darüber hinaus wurden CD29+CD90+CD45mBMSCs durch fluoreszierende Zellsortierung gereinigt. Die zweite Generation von gereinigten mBMSCs wurde für weitere Studien verwendet und zeigte Potenzial in der Unterscheidung in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten. Mit diesem In-vitro-Modell kann man eine hohe Anzahl von proliferativen mBMSCs erhalten, was die Untersuchung der biologischen Eigenschaften, der nachfolgenden Reaktion auf die Mikroumgebung und anderer Anwendungen von mBMSCs erleichtern kann.

Einleitung

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Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) sind nicht-hämatopoetische Stammzellen aus Knochenmark abgeleitet, die starke Proliferationsfähigkeit und Multi-Lineage Differenzierungspotenzialmanifestieren 1,2,3,4. Tatsächlich gelten BMSCs seit ihrer Entdeckung als idealer Kandidat für Knochengewebetechnik und -regeneration. Seit Jahren sind der Iliaskamm oder lange Knochen wie Tibia und Oberschenkelknochen die häufigste Quelle von BMSCs für die craniofacial Regeneration. Orofaziale BMSCs, wie z. B. Unterkiefer-BMSCs (mBMSCs), weisen jedoch einige Unterschiede zu langknochenförmigen BMSCs auf, z. B. unterschiedlicheembryonale Herkunft und Entwicklungsmuster. Unterkiefer entstehen aus neuralen Kammzellen der Neuroektoderm-Keimschicht und durchlaufen eine intramembranöse Verknöcherung, während axiale und anhängliche Skelette aus dem Mesoderm stammen und endochondraler Verknöcherung unterzogen werden. Darüber hinaus haben klinische Beobachtungen und experimentelle Tierstudien immer wieder gezeigt, dass es funktionelle Unterschiede zwischen orofazialen und iliac enkchenen BMSCs5,6,7,8gibt. Berichte haben gezeigt, dass BMSCs, die aus craniofacial Knochen wie Unterkiefer, Kieferknochen und Alveolarknochen abgeleitet wurden, eine überlegene Proliferations-, Lebensdauer- und Differenzierungsfähigkeit aufwiesen als solche von axialen und anhänglichen Knochen9. mBMSCs gelten daher als bevorzugte Ressourcen für zukünftige therapeutische Anwendungen von craniofacial Erkrankungen wie Kerubism, Kiefertumor, Osteoporose des Kieferknochens und Parodontalgewebedefekt10,11,12. Um das Behandlungspotenzial in präklinischen Experimenten zu verstehen, ist es wichtig, eine Methode zur schnellen Isolierung und Kultivierung von mBMSCs in vitro zu etablieren.

In dieser Studie bestand das Ziel darin, gereinigte mBMSCs durch vollständige Knochenmarkhaftung und Durchflusszytometriesortierung zu erhalten. Die anatomische Morphologie der Rattenunterkiefer, die durch Mikro-Computertomographie (Micro-CT) und histologische Abschnitte deutlich beobachtet wurde, zeigte, dass der trabekuläre Knochen des Unterkiefers zwischen dem Schneidemittel- und dem Alveolarknochen lag. Das Knochenmark aus trabekulären Knochen wurde gespült, um Unterkiefermarkzellen zu erhalten, aber die auf diese Weise kultivierten Zellen waren keine reinen mBMSCs und waren wahrscheinlich aus mehreren Arten von Zellen mit unsicheren Potenzen und verschiedenen Linien wie Zellen aus Knochen, Fett und Endothelzellen13,14bestehen. Der nächste Schritt der Zellreinigung war besonders wichtig. Durchflusszytometrie filtert Zellen durch Erkennung einer Kombination von Zell-Oberflächen-Proteinen und wurde weithin in der Anreicherung von mesenchymalen Stammzellen angenommen. Die Zellhomogenität ist der Hauptvorteil der Durchflusszytometrie, aber der Prozess bestimmt nicht die Zelllebensfähigkeit und kann zu einer begrenzten Zellausbeute führen. In dieser Studie wurden die P0-MBMSCs, die aus der gesamten Knochenmarkhaftung gewonnen wurden, nach Durchflusszytometrie sortiert, um mBMSCs mit hoher Reinheit und starker Proliferationsfähigkeit zu erhalten.

Diese Studie führt ein reproduzierbares und zuverlässiges Protokoll für Isolierung, Kultur und Differenzierung von munterdibulären BMSCs von Ratten ein, das eine Kombination aus ganzer Knochenmarkhaftung und Durchflusszytometriesortierte verwendet. Es ist eine zuverlässige und bequeme Methode für Forscher in verwandten Bereichen zu verwenden.

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Protokoll

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Alle tierischen Versuchsverfahren in diesem Papier wurden vom Animal Care Committee des Shanghai Ninth People es Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, genehmigt.

1. Vorbereitung

  1. Verwenden Sie zwei 5 Wochen alte männliche Sprague Dawley Ratten für das Experiment.
  2. Sterilisieren Sie alle Instrumente, einschließlich Nadelhalter, Pinzette und Schere bei hoher Temperatur oder eingetaucht in 75% Ethanol für 10 min.
    HINWEIS: Ethanol-Eintauchen sollte nicht zu lang sein, um Zellschäden zu vermeiden.
  3. Vorbereiten von Kulturmedien im Voraus, deren Zusammensetzung in Tabelle 1aufgeführt ist. Ergänzen Sie jedes Medium wie unten beschrieben.
    1. Zubereitung von α-MEM-Kulturmedium (mit 10% FBS): Ergänzung des minimalen essentiellen Mediums Alpha (α-MEM) mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin und Streptomycin.
    2. Zubereitung des osteogenen Differenzierungsmediums: Ergänzung osteogene Differenzierung Basalmedium mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 0,20% Ascorbinsäure, 1% β-Glycerophosphat und 0,01% Dexamethason.
    3. Zubereitung eines osteogenen Induktionsmediums: Mischen Sie 70% α-MEM-Kulturmedium (mit 10% FBS) und 30% osteogene Differenzierungsmedium.
    4. Zubereitung des adipogenen Differenzierungsmediums A: Ergänzung adipogenic Differenzierung Basalmedium mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 0,20% Insulin, 0,10% IBMX, 0,10% Rosiglitazon und 0,01% Dexamethason.
    5. Herstellung des adipogenen Differenzierungsmediums B: Ergänzung adipogenic Differenzierung Basalmedium mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin und 0,20% Insulin.
    6. Zubereitung des chondrogenen Differenzierungsmediums: Ergänzung chondrogener Differenzierung Basalmedium mit 0,01% Dexamethason, 0,30% Ascorbinsäure, 1% ITS, 0,10% Natriumpyruvat, 0,10% Proline und 1% TGF-3.
      HINWEIS: Das osteogene Differenzierungsmedium muss innerhalb eines Monats nach der Konfiguration aufgebraucht sein. Die effektive Periode des konfigurierten chondrogenen Differenzierungsmediums beträgt 12 h.

2. Isolierung und Kultivierung von Ratten-MBMSCs

HINWEIS: Alle experimentellen Operationen sollten so weit wie möglich auf Eis durchgeführt werden, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten.

  1. Ernte von Rattenunterkiefern
    1. Euthanisieren Sie zwei 5 Wochen alte männliche Sprague Dawley Ratten durch CO2 Erstickung. Stellen Sie sicher, dass die Atmung des Tieres gestoppt wird, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren.
    2. Spülen Sie diese Ratten in einem Becher, der 75% Ethanol für 3 min enthält.
    3. Legen Sie die Ratte in eine saubere Dunstabzugshaube, um Unterkiefer zu ernten.
      HINWEIS: Sterilisieren Sie die Dunstabzugshaube vor Gebrauch 30 min lang durch ultraviolette Lichtstrahlung.
    4. Legen Sie die Ratte in eine Supine-Position. Schneiden Sie die Häute und Buccinator-Muskeln von bilateralen Angulus oris in die hintere Region des Unterkiefers, die der einzige bewegliche Knochen mit niedrigerem Schneidemittel ist.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, einen 2 cm Schnitt auf jeder Seite des Angulus-Oris zu machen, um ein klares Operationsfeld zu erhalten.
    5. Öffnen Sie den Mund der Ratte, indem Sie die Kiefer- und Unterkieferschneideschneide schneideinn in die entgegengesetzte Richtung mit beiden Daumen drücken, um die Unterkieferzähne freizulegen, die an der Unterkiefer befestigt sind.
    6. Trennen Sie die bukkalen Muskeln und Sehnen, die an den Koracoiden befestigt sind, und die untere Grenze des Unterkiefers vollständig ab.
      HINWEIS: Eine erhöhte Beweglichkeit des Unterkiefers wird während dieses Schritts aufgrund des Mangels an Muskelspannung beobachtet.
    7. Drücken Sie die unterkieferförmigen hinteren Zähne und drehen Sie sich nach hinten und unten, bis die Kondylen auf beiden Seiten deutlich frei gelegt sind.
      HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um den Mund der Ratte so weit wie möglich künstlich zu öffnen, um den Condyle zu verrenzieren. Der Unterkiefer ist durch bilaterale Kondylen mit dem Schädel verbunden, so dass die Exposition der Kondylen zur Trennung zwischen Schädel und Unterkiefer führt.
    8. Trennen Sie den Unterkieferkörper vom Schädel.
    9. Reinigen Sie das anhaftende Weichgewebe auf der Knochenoberfläche mit einer nassen Gaze.
    10. Legen Sie den Knochen in eine 10 cm sterile Glasschale, gefüllt mit vorgekühlten minimal α en (α-MEM) oder Phosphatpuffer-Saline (PBS) auf Eis, um die Lebensfähigkeit zu erhalten.
  2. Isolierung und Kultivierung der mBMSCs
    1. Schneiden Sie den vorderen Knochen entlang der mesialen Kante des ersten Molaren vom Unterkieferkörper ab. Entfernen Sie den Unterkiefer-Ramus einschließlich Corakoid und Condyle entlang der distalen Kante des dritten Molaren, um die Markhöhle freizulegen.
    2. Füllen Sie eine 10 cm sterile Glasschale mit 10 ml α-MEM (mit 10% FBS).
    3. Verwenden Sie 1 ml Spritze, um α-MEM-Kulturmedium zu aspirieren. Mit der Spritzennadel, die in die Knochenmarkhöhle eingeführt wird, spülen Sie das Knochenmark wiederholt in die Schale. Spülen Sie die Knochenhöhle mindestens 3 Mal von beiden mesialen und distalen Seiten des Knochens, bis der Knochen weiß wurde.
      HINWEIS: Dies ist der kritischste Schritt, da die Knochenmarkhöhle einer Rattenunterkiefer nicht so offensichtlich ist wie bei langen Knochen und der richtige Punkt, um die Nadel einzusetzen, empirisch bestimmt werden muss. Alle oben genannten Versuchsproben sollten auf Eis gelagert werden, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten, so dass die Betriebszeit nicht länger als 2 h betragen darf.
    4. Übertragen Sie das Medium, das die gespülten Zellen enthält, in ein 15 ml Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 800 x g bei 4 °C für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
    5. Setzen Sie die Zellen mit 3 ml α-MEM (mit 10% FBS) wieder aus. Die Zellen in einer neuen 10 cm Kulturschale aufsieben und bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator brüten.
    6. Überprüfen Sie die morphologischen Veränderungen und das Wachstum dieser Zellen am 3. Tag der Kultur. Entfernen Sie das Kulturmedium mit nicht haftenden Zellen und Gewebefragmenten. Fügen Sie vorsichtig 10 ml frische α-MEM (mit 10% FBS) hinzu.
    7. Nach 7 Tagen Kultur erreichten P0-MBMSCs 70% bis 80% Zusammenfluss.
  3. Durchflusszellensortierung
    HINWEIS: P0-MBMSCs wurden phänotypisch identifiziert und in erster Linie durch Durchflusszellensortierung gereinigt.
    1. Das Kulturmedium ansaugen und entsorgen und dann das Gericht mit PBS waschen. Entsorgen Sie die PBS.
    2. 1 ml 0,25% Trypsin mit 0,02% EDTA in die Schale geben. Verdauen Sie die Zellen bei 37 °C für 5 min, dann fügen Sie 2 ml α-MEM (mit 10% FBS) hinzu, um die Reaktion zu stoppen.
    3. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 800 x g für 5 min.
    4. Setzen Sie die Zellen nach der Zentrifugation in 120 l PBS (mit 10% FBS) aus.
    5. Blockieren Sie diese Zellsuspensionen mit 1 l Antikörper gegen CD16/CD32 bei 4 °C für 15 min.
    6. 100 l der Zellsuspension in ein neues Mikrozentrifugenrohr übertragen, die Zellen mit Phycoerythrin (PE)-konjugiertem Antikörper gegen CD45, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierte Antikörper gegen CD90 und Allophycocyanin (APC)-Antikörper gegen CD29 bei 4 °C bei 1 h im Dunkelnfärben. Die Konzentration der in diesem Experiment verwendeten Antikörper ist in Tabelle 2dargestellt. Verwenden Sie die anderen 20 L zellsuspension als ungefärbte Negativkontrolle.
    7. Zentrifugieren Sie dann die Rohre bei 800 x g für 5 min, entsorgen Sie die Suspension und setzen Sie die Zellen in 0,5 ml PBS (mit 10% FBS) wieder auf.
    8. Fügen Sie vor der Analyse 10 l von 0,01 mg/ml DAPI für 10 min hinzu.
    9. Verwenden Sie 40 nm Filter, die auf Zentrifugenrohren platziert werden, um die Zellen zu filtern.
    10. Analysieren Sie die Zellen auf Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer. Stellen Sie die Bedienfelder wie folgt ein. Entfernen Sie zunächst abgestorbene Zellen aus der Gesamtzellenzahl, indem Sie DAPI- Zellen, dann Gate CD29+CD90+CD45- in den ausgewählten Zellen als Ziel-MBMSCs veranlassen.
    11. Sammeln Sie die sortierten CD29+CD90+CD45- Zellen in ein 15 ml Zentrifugenrohr mit 3 ml α-MEM (mit 10% FBS) vorgefertigt.
    12. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 800 x g für 5 min. Entfernen Sie den Sammlungspuffer, und fügen Sie 1 ml frisches α-MEM (mit 10 % FBS) hinzu, um die Zellen erneut auszusetzen. Dann teller sie in einem 6 cm Kulturgericht.

3. Fähigkeit zur Koloniebildung

HINWEIS: Dieser Schritt wurde ausgeführt, um die Divisionsfähigkeit von mBMSCs zu überprüfen. 15

  1. Wählen Sie die zweite Passage mBMSCs (P2) für dieses Experiment. Wenn der Zellzusammenfluss 80% bis 90% erreichte, sät die Zellen in einem seriellen Gradienten in einer 6-Well-Platte neu, um ihre klonale Proliferationsfähigkeit zu bewerten.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, den Gradienten von 1 x 102 bis 1 x 103 Zellen pro Bohrkörper einzustellen, aber die endgültigen Verdünnungen verschiedener Zelllinien menschlichen oder tierischen Ursprungs wurden empirisch bestimmt.
  2. Kultur die Zellen in α-MEM (mit 10% FBS) für etwa zwei Wochen, bis eine gute Anzahl der koloniebildenden Einheiten unter Lichtmikroskop gesehen werden konnte. Erfrischen Sie das Kulturmedium alle 3 Tage.
  3. Aspirieren und entsorgen Sie das Kulturmedium, waschen Sie die Brunnen mit PBS zweimal für 5 min am Mal. Als nächstes 4% Paraformaldehyd-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen und für mindestens 10 min fixieren.
  4. Entfernen Sie das Paraformaldehyd und spülen Sie die Brunnen zweimal mit PBS.
  5. Die Zellen mit kristallvioletter Färbelösung färben und in 37 °C ca. 10 min inkubieren.
    HINWEIS: Die Färbezeit wird entsprechend eingestellt, bis der gewünschte Farbton erreicht ist.
  6. Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie die Proben mit destilliertem Wasser, um die Reaktion zu stoppen.
  7. Bild unter einem Stereomikroskop und zählen verstreute Zellkolonien, die aus mindestens 50 Zellen bestanden.

4. Multilineage-Differenzierung von mBMSCs

HINWEIS: Die P2-MBMSCs wurden für nachfolgende Experimente verwendet, sofern nicht anders beschrieben.

  1. Osteogene Induktion von mBMSCs
    1. Digest die mBMSCs wie oben beschrieben. Samenzellen mit einer Dichte von 2,5 x 105/cm2 in einer 12-Well-Platte, ergänzt durch 1 ml α-MEM (mit 10% FBS).
    2. Wenn der Zellzusammenfluss 60-70% erreichte, ändern Sie das Medium in 30% osteogene Induktionsmedien. Kultur die Zellen mit α-MEM (mit 10% FBS) als negative Kontrolle und ändern Sie das Medium alle 2 Tage.
      HINWEIS: Nachdem während der Osteogenese eine große Anzahl von Kalziumknötchen auftreten, wird empfohlen, das mittlere Austauschmuster alle 2 Tage auf einen mittleren Volumenaustausch umzutauschen, um zu verhindern, dass Osteoblasten schwimmen.
    3. Nach der Kultivierung für sieben Tage, bewerten Sie die Verkalkung dieser Zellen durch alkalische Phosphatase Färbung16,17.
    4. Entfernen Sie das Kulturmedium und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Spülen Sie die Zellen mit 1 ml PBS pro Brunnen für 3 min zweimal.
    5. Dann färben Sie die Zellen mit alkalischer Phosphatase-Färbungslösung und inkubieren bei 37 °C für 10-30 min.
      HINWEIS: Die Inkubation kann über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt werden, um die gewünschte Farbe zu erhalten.
    6. Waschen Sie die Brunnen mit destilliertem Wasser, um die Reaktion zu stoppen. Fotografieren Sie unter Lichtmikroskop. Rot pigmentierte sulfierte Granulate stellen die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) dar.
    7. Nach der Kultivierung der verbleibenden Zellen für weitere 7 Tage, führen Sie Alizarin rote Färbung, um die Mineralisierungskapazität der Zellen zu bewerten.
    8. Färben Sie die Zellen mit 0,5% Alizarin rote Färbung Lösung nach Zellfixierung für 10 min16,18. Beenden Sie die chromogene Reaktion mit destilliertem Wasser nach 3-5 min.
      HINWEIS: Die Reaktionszeit kann je nach entwickelter Farbe verlängert werden.
    9. Schließlich legen Sie die Kulturplatte unter das Lichtmikroskop, um die Wirkung der osteogenen Färbung zu beobachten; rote Knötchen weisen auf Kalziumablagerungen dieser Zellen hin.
  2. Adipogene Induktion von mBMSCs
    1. Seed P2 mBMSCs in einer 12 WellPlatte, wie oben beschrieben.
    2. Nach dem Brunnen zu 90% konfluent werden, Kultur die Zellen mit adipogene Differenzierung Medium A. Verwenden Sie Zellen kultiviert in α-MEM Kulturmedium (mit 10% FBS) als negative Kontrolle.
    3. Nach 2 Tagen Induktion das Medium A aus dem Brunnen ansaugen und in jedem Brunnen 1 ml adipogene Differenzierungsmedium B hinzufügen.
    4. Nach einem Tag entfernen Sie Medium B und starten Sie den Zyklus wieder mit Medium A wieder in den Brunnen hinzugefügt. Kultur der Zellen abwechselnd mit Medium A und B.
    5. Tragen Sie das Differenzierungsmedium A und B abwechselnd für drei Zyklen auf und detektieren Sie die Adipogenese dieser Zellen durch ölrote O-Färbung16,18.
      HINWEIS: Viele runde und große Lipidtröpfchen können beobachtet werden, indem diese Zellen mit Differenzierungsmedium B für weitere 2 bis 3 Tage kultiviert werden.
    6. Entfernen Sie das Medium und fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 min. Waschen Sie die Zellen mit PBS aus.
    7. Die Zellen mit ölroter O-Färbungslösung beflecken und ca. 3 min bei 37 °C brüten.
    8. Entfernen Sie die Färbelösung und waschen Sie die Brunnen mit destilliertem Wasser.
    9. Beobachten Sie die Adipogenese unter Lichtmikroskop.
  3. Chondrogenese-Induktion von mBMSCs
    1. Seed P2 mBMSCs in 15 ml Zentrifugenrohr mit einer Dichte von 5 x 105/cm2.
    2. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand.
    3. Resuspend ieren die Zellen mit 0,5 ml chondrogene Differenzierung Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min.
    4. Lösen Sie die Kappe des Zentrifugenrohrs und inkubieren Sie es bei 37 °C in einem 5% CO2-Inkubator. Erneuern Sie das Medium alle 2 Tage.
      HINWEIS: Zellen beginnen nach 24 h mit dem Pelletieren. Es wird empfohlen, das Zentrifugenrohr nicht für 48 h zu bewegen. Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu aspirieren, wenn Sie das Medium wechseln.
    5. Fixieren Sie die Zellpellets nach 21 Tagen Induktion mit 4% Paraformaldehyd, gefolgt von Dehydrierung, Paraffineinbettung und Schnitt.
    6. Nach Derparaffinierung und Hydratation die Dias in alcian blauer Lösung für mindestens 15 min18,19,20,21färben und dann mit destilliertem Wasser waschen, um die Reaktion zu stoppen. Erfassen Sie die Fotos unter Lichtmikroskop.
    7. Führen Sie für die immunfluoreszierende Färbung von Kollagen Typ II die folgenden Schritte aus.
      1. Die Dias nach dem Deparaffinierungs- und Hydratationsschritt mit 5 g/ml Proteinase K für 15 min bei 37 °C inkubieren.
      2. Inkubieren Sie die Dias im Sperrpuffer für 1 h bei 37 °C.
      3. 1 L KollagenTyp II Antikörper in 200 l Sperrpuffer auf die Dias auftragen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
      4. Am nächsten Tag die Dias zweimal mit PBS waschen und bei 37 °C für 1 h mit Sekundärantikörpern bebrüten.
      5. Inkubieren Sie die Scheiben mit 40,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) für 10 min.
    8. Fotografieren Sie jedes Diaunter unter Fluoreszenzmikroskopie.

5. Echtzeit-PCR

  1. Extrahieren Sie die gesamte RNA aus mBMSCs mit einem Guanidium isothiocyanat, das auf kommerziell erhältlichem Reagenz basiert.
  2. Führen Sie die umgekehrte Transkription von RNA in komplementäre DNA mit einem handelsüblichen Kit durch. Die Reaktionsbedingungen der Umgekehrten Transkription waren wie folgt: 65 °C für 5 min, 37 °C für 15 min, 85 °C für 15 s.
  3. Führen Sie Echtzeit-PCR durch, um Osteogenese und Adipogenese-spezifische Gene mithilfe von Primern zu erkennen, die in Tabelle 3 aufgeführt sind. Das PCR-Verstärkungsverfahren war wie folgt: 95 °C für 5 min. 95 °C für 5 s, 60 °C für 30 s für 40 Zyklen.

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Ergebnisse

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Mit diesem Protokoll haftete ein großer Teil der Zellen am dritten Tag nach der Anfangskultur an der Platte. In der Regel erreichte der Zellzusammenfluss nach zusätzlichen 3-4 Tagen Kultur 70 bis 80 %(Abbildung 1B). Mit fluoreszierender Zellsortierung wurden DAPI-CD29+CD90+CD45- mBMSCs18,22, die etwa 81,1% in den P0-Zellen ausmachten (Abbildung 1C) gereinigt.

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Diskussion

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Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um BMSCs von Rattenunterkiefern in vitro zu isolieren, indem ganze Knochenmarkhaftung und fluoreszierende Zellsortierung kombiniert werden, was eine einfache und zuverlässige Möglichkeit ist, proliferative mBMSCs mit starker Differenzierungsfähigkeit zu erhalten. Diese Methode könnte mBMSCs vorläufig durch Durchflusszellensortierung reinigen, aber wenn höhere Anforderungen an die Zellhomogenität bestehen, können präzisere Reinigungsmethoden erforderlich sein.

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Offenlegungen

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Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

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Wir danken für die Unterstützung von Laboratory for Digitized Stomatology and Research Center for Craniofacial Anomalies of Shanghai Ninth People es Hospital. Die Arbeit dieses Manuskripts wird durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949] unterstützt, Shanghai Summit & Plateau Disciplines, der SHIPM-mu Fonds des Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People es Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], das Incentive Project of High-Level Innovation Team for Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Und L.J. ist Ein Gelehrter des Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program und des Projekts "Chen Xing" der Shanghai Jiaotong University.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin-EDTA(1X)Gibco25200072
10 cm KulturschaleCorning
acutenaculum
Adipogenes DifferenzierungsmediumCyagen biosciences inc.MUBMX-90031
Alcian BlueBeyotime Biotechnologie
Alizarin rotSigma-AldrichA5533
Alkaline Phosphatase Color Development KitBeyotime BiotechnologyC3206
alpha-Minimum essentielles MediumGE Healthcare HyClone ZellkulturSH30265.01B
Anti-CollagenII Kaninchen pAbAbcamab34712
Antikörper gegen CD16/CD32
Antifade Eindeckmedium mit DAPIBeyotime BiotechnologyP0131
APC Anti-Maus/Ratte CD29 Antikörperbiolegend inc102215
BiosicherheitswerkbankEscoAC2-4S8-CN
CD45 Monoklonaler Antikörper (OX1), PE, eBioscienceInvitrogen12-0461-82
CD90.1 (Thy-1.1) Monoklonaler Antikörper (HIS51), FITC, eBioscienceInvitrogen11-0900-85
ZentrifugecenceL500
Chondrogenese DifferenzierungsmediumCyagen Biosciences Inc.
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopZeissLSM880
Countess II FL Automatisierter ZellzählerInvitrogenAMQAF1000
Kristallviolett-FärbelösungBeyotime BiotechnologyC0121
Fötales RinderserumGE Healthcare HyClone ZellkulturSH30084.03
Ziege Anti-Kaninchen IgG H& L (Alexa Fluor 488)abcamab150077
InkubatorEscoCCL-170B-8
Inverses MikroskopolympusCKX53
Magzol-Reagenz (Trizol-Reagenz)
Eppendorf
Oil Red O
Osteogenes DifferenzierungsmediumCyagen Biosciences Inc.MUBMX-90021
Penicillin-StreptomycinGibco15070063
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1X)Gibco20012027
PrimeScript RT Master KitTakaRa Bio IncRR036A
Proteinase KSigma-AldrichP6556
QuickBlock Blocking-PufferBeyotime BiotechnologyP0260
Schere
SYBR1 PremixTakaRa Bio Inc
ToluidinblauBeyotime Biotechnologie
Trypanblau Lösung, 0,4%Gibco15250061
Magen-Mikropipette

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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