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Methodenartikel

Natriumtaurocolat induzierte schwere akute Pankreatitis bei C57BL/6 Mäusen

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DOI:

10.3791/61547

⸱

28. Juni 2021

 ,  ,  ,  , 
1Discipline of Clinical Emergencies, Department of Clinical Medicine, HCFMUSP / LIM 51, University of São Paulo Medical School

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Tiermodelle für schwere akute Pankreatitis ermöglichen die Untersuchung pathophysiologischer Veränderungen im Anfangsstadium und erleichtern die Beobachtung der Evolution von Entzündungsereignissen. Hier stellen wir ein Protokoll für die Induktion einer schweren akuten biliären Pankreatitis durch retrograde Infusion von Natriumtaurocholat in den Pankreasgang von anästhesierten C57BL/6-Mäusen zur Verfügung.

Zusammenfassung

Die Induktion einer biliären akuten Pankreatitis durch Natriumtautolett-Infusion wurde von der wissenschaftlichen Gemeinschaft aufgrund der Darstellung des klinischen Zustands des Menschen und der Reproduktion entzündlicher Ereignisse, die dem Beginn der klinischen biliären Pankreatitis entsprechen, weit verbreitet verwendet. Die Schwere der Pankreasschädigung kann durch Messung der Konzentration, Geschwindigkeit und des Volumens der infundierten Gallensäure beurteilt werden. Diese Studie bietet eine aktualisierte Checkliste der Materialien und Methoden, die bei der Protokollreproduktion verwendet werden, und zeigt die wichtigsten Ergebnisse dieses akuten Pankreatitis (AP) -Modells. Die meisten früheren Veröffentlichungen haben sich darauf beschränkt, dieses Modell bei Ratten zu reproduzieren. Wir haben diese Methode bei Mäusen angewendet, die zusätzliche Vorteile bietet (d.h. die Verfügbarkeit eines Arsenals von Reagenzien und Antikörpern für diese Tiere zusammen mit der Möglichkeit, mit genetisch veränderten Mäusstämmen zu arbeiten), die für die Studie relevant sein könnten. Für die Induktion einer akuten Pankreatitis bei Mäusen präsentieren wir ein systematisches Protokoll mit einer definierten Dosis von 2,5% Natriumtarocholat bei einer Infusionsgeschwindigkeit von 10 μL/min für 3 min bei C57BL/6-Mäusen, die ihren maximalen Schweregrad innerhalb von 12 h nach der Induktion erreichen, und heben Ergebnisse mit Ergebnissen hervor, die die Methode validieren. Mit Übung und Technik beträgt die geschätzte Gesamtzeit von der Einleitung der Anästhesie bis zum Abschluss der Infusion 25 Minuten pro Tier.

Einleitung

Beim Menschen ist das Vorhandensein von Gallensteinen die häufigste Ursache für eine Pankreatitis aufgrund der Obstruktion des terminalen Teils des Choledochals, die den Fluss der Pankreassekrete unterbricht und einen intensiven Entzündungsprozess in der Bauchspeicheldrüse verursacht, mit einer Erhöhung der Konzentration von Verdauungsenzymen im Serum und Entzündungsmediatoren1,2.

Zwei verschiedene Theorien wurden vorgeschlagen, um die Entwicklung einer akuten Pankreatitis (AP) zu erklären. Die Theorie des "gemeinsamen Kanals" legt nahe, dass die in der Gallenblase vorhandenen Steine das distale gemeinsame Gallengangssystem behindern, so dass die Gallensekretion retrograd in den Pankreasgang fließen kann. Die zweite Theorie (die Theorie der "Gangobstruktion") legt nahe, dass die Obstruktion des Pankreasgangs durch überschüssige Gallensteine eine Blockade im Fluss der Pankreassekretion zum Zwölffingerdarm verursacht, was zu einer duktalen Hypertonie führt3. Obwohl die Mechanismen, die zu einer akuten biliären Pankreatitis führen, nicht vollständig verstanden sind, ist das Ergebnis ein intensiver Entzündungsprozess. Der Ausbruch des Verdauungsenzyms und die Selbstverdauung der Bauchspeicheldrüse führen zu histopathologischen Veränderungen, einem Anstieg der entzündlichen Zytokine (IL-1β, IL-6, TNF-α) in der Aszitflüssigkeit und im Serum sowie zu einem Anstieg der Proteine in der akuten Phase4,5,6.

Schwere akute Pankreatitis ist eine Erkrankung, die aufgrund der Beteiligung mehrerer Organe und eines hohen Mortalitätsrisikos klinische Aufmerksamkeit verdient. Tiermodelle für die Reproduktion der akuten Pankreatitis (AP) sind wichtig, da sie die pathophysiologischen Mechanismen der Krankheit erklären und bei der Überwachung der Entwicklung von Entzündungsereignissen ab den Anfangsstadien der Krankheit helfen. Dies ist in den Kliniken in der Regel nicht möglich2,7. Darüber hinaus ist der Zugang zu Pankreasgewebe in präklinischen Studien einfach, was die Aufklärung von Veränderungen im Zusammenhang mit klinischen Bedingungen8 sowie die Möglichkeit der Arbeit mit isogenen Spezies, die Beseitigung unerwünschter Variablen und die Spiegelung der klinischen Ähnlichkeit mit den im menschlichen Zustand beobachteten Ergebnissen begünstigt9.

Biliäre und nicht-biliäre Modelle für die Induktion einer akuten Pankreatitis bei Ratten und Mäusen wurden in der wissenschaftlichen Literatur häufig untersucht. Nicht-biliäre Induktionsmethoden umfassen die Verabreichung von supramaximalen stimulierenden Dosen des Cholecystokinin-Sekretagogue oder seines analogen Cerulein10; Verabreichung von fast tödlichen Dosen von L-Arginin; oder Verabreichung einer cholinarmen Diät, die mit Ethionin11 ergänzt wird. Obwohl diese Methoden leicht zu reproduzieren sind und zu einer Bauchspeicheldrüsenentzündung führen, replizieren sie nicht die Mechanismen, die theoretisch AP auslösen (dh den Rückfluss von Gallensekretion in den Pankreasgang). Die Technik, die das Gallenmodell anspricht, basiert auf der retrograden Infusion von Gallensäuren in den Pankreasgang und erfordert gut ausgebildete Forscher, um dieses Protokoll durchzuführen. Mehrere Studien wurden mit dieser Methode an Ratten veröffentlicht (offenbar aus technischen Gründen, da diese Experimente chirurgische Eingriffe beinhalten)12,13. Der Ansatz bei Mäusen könnte jedoch interessantere Ergebnisse in der Studie über Entzündungen liefern3,14,15. In dieser Studie zeigen wir eine Checkliste der Schritte, die für die Reproduktion einer schweren akuten Pankreatitis durch Infusion von Natriumtaurocholat in C57BL/6 anästhesierten Mäusen zu befolgen sind.

Für Arbeiten, die Experimente mit Antikörpern und die Analyse der Gen- und Proteinexpression erfordern, ist die Verwendung von Mäusen vorzuziehen, da das Materialarsenal für diese Tiere größer ist und die Möglichkeit besteht, unter anderem mit isogenen und Knockout-Spezies zu arbeiten, die für Studien relevant sind16. Mäuse C57BL/6 ist ein Inzuchtstamm von Mäusen, der ursprünglich für das Studium der Antitumoraktivität und Immunologie entwickelt wurde. Dieser Stamm wird von den Forschern zunehmend bevorzugt, da er isogen ist, was eine größere Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ermöglicht, was die Verwendung einer kleineren Anzahl von Tieren in einem Versuch und eine geringere Variabilität der Ergebnisse zwischen derselben Gruppe bedeuten kann17,18.

Perides et al. (2010)14 veröffentlichten ein Protokoll für die AP-Induktion bei Mäusen durch Natriumtaurocholat-Infusion. Hier aktualisieren wir dieses Modell unter Verwendung einer höheren Natriumtaurocilatkonzentration (2,5%) in C57BL/6-Mäusen mit einem definierten Volumen und einer definierten Infusionsgeschwindigkeit (Abbildung 1). Der maximale Schweregrad wird bei Mäusen innerhalb von 12 h nach der Induktion erreicht. Die Erhöhung der Konzentration von IL-6 sowohl im Serum als auch in der Peritonealhöhle korreliert mit dem Fortschreiten der AP. In der Praxis beträgt die geschätzte Gesamtzeit von der Einleitung der Anästhesie bis zum Abschluss der Infusion 25 Minuten pro Tier. Es ist wichtig, dass ein ausgebildeter Forscher dieses Experiment durchführt. Um sicherzustellen, dass die Lösung ordnungsgemäß in den gemeinsamen Gallengang injiziert wird, führen Sie mehrere Pilottrainingseinheiten mit Methylenblau anstelle von Natriumtaurocholat durch.

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Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren der USP Medicine School, Nr. Projekt: 1343/2019-CEUA: FMUSP genehmigt. Für dieses Protokoll wurden C57BL/6-Mäuse im Alter von 6 Wochen mit einem Gewicht von 20 ± 2 g verwendet (n = 9/Gruppe).

1. Laparotomie

  1. Tiere mit Xylazin (10 mg/kg) und Ketaminlösung (80 mg/kg) subkutan (0,1 ml/10 g Körpergewicht) mit einer 1 ml Spritze und einer 13x0,45 mm Nadel 26G 1/2 betäuben. Überprüfen Sie auf ausreichende Anästhesietiefe, indem Sie den Zeh einklemmen. Kontrollieren Sie die Körpertemperatur mit beheizten Pads. Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Materialien steril sind.
  2. Reinigen Sie den Bauchbereich mit 5% Povidon-Jod-Lösung und entfernen Sie mit einem Trimmer die Haare zwischen Brust und Unterbauch (ca. 2 cm2). Reinigen Sie den Operationsbereich mit 70% Alkohol.
  3. Immobilisieren Sie das Tier auf dem OPERATIONSBRETT mit chirurgischem Klebeband. Verwenden Sie eine Schere, um 5 mm der Haut horizontal auf dem oberen Teil des Abdomens und 1 cm unter dem Xiphoid-Prozess zu schneiden. Wiederholen Sie den Schnitt am Peritoneum. Dies führt zu einer Laparotomie mit minimaler Exposition der Höhle.

2. Lokalisieren und Freilegen der Bauchspeicheldrüse

  1. Ziehen Sie mit Hilfe eines Retraktors die Leber in Richtung des Kopfes der Maus, ~ 1 cm vom Darm entfernt.
  2. Lokalisieren Sie die Region der Bauchspeicheldrüse, die mit Natriumtaurocholat (Pankreaskopf) injiziert wird. Lokalisieren Sie den Zwölffingerdarm in Bezug auf die Leber - unterhalb der Leber, auf der rechten Seite (auf der linken Seite, wenn die Maus betrachtet wird). Der Zwölffingerdarm ist der erste Teil des Dünndarms und ist mit dem letzten Teil des Magens verbunden.
  3. Heben Sie mit Hilfe einer Pinzette die Leber in Richtung Tierkopf an und ziehen Sie vorsichtig den Dünndarmteil. Fixieren Sie die beiden seitlichen Enden des Dünndarms mit einer 6-0 Polypropylennaht, um den distalen Teil des gemeinsamen Gallengangs besser zu sehen.

3. Induktion einer schweren akuten Pankreatitis

  1. Verschließen Sie vorübergehend den proximalen gemeinsamen Gallengang mit einem Mikrogefäßclip, um zu verhindern, dass eine retrograde Infusion in die Leber austritt. Der gemeinsame Gallengang ist auf der Leberseite des Zwölffingerdarms zu sehen und seine Verbindung mit dem Zwölffingerdarm erscheint weiß. Legen Sie das Organ aus der Bauchhöhle frei.
  2. Punktion der periampullären Region (weißlicher Teil der Dünndarmwand), um mit einer 0,4 mm Nadel, die mit einem 0,54 mm Polyethylenrohr verbunden ist, Zugang zum gemeinsamen Gallengang zu erhalten.
  3. Machen Sie einen vorübergehenden Verschluss des distalen gemeinsamen Gallengangs mit 8-0 Naht, um zu verhindern, dass die Natriumtarocolatlösung in den Zwölffingerdarm austritt.
  4. Starten Sie die Infusionspumpe und programmieren Sie eine 2,5% ige Natriumtautocholatlösung (verdünnt in 0,9% Kochsalzlösung) infusion mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 μL/10 g Körpergewicht für 3 min.
  5. Entfernen Sie nach der Infusion den Mikrogefäßclip, den temporären 8-0 Naht und die Injektionsnadel aus dem Gallengang der Bauchspeicheldrüse, um den physiologischen Fluss der Galle wiederherzustellen.
  6. Am Ende nähen Sie den Bauch mit 6-0 nichtabsorbierenden Monofilament-Polypropylennaht. Die Zeit zwischen der Laparotomie und der Endnaht sollte maximal 30 min betragen (siehe Abbildung 1).
  7. Nach der Operation bringen Sie die Tiere in Polyethylenboxen unter, die mit Holzspänen und Wasser und Futter ad libitum ausgekleidet sind.
  8. Behandeln Sie Kontrollmäuse auf die gleiche Weise wie die experimentellen Mäuse, stellen Sie jedoch sicher, dass das Infusat nur aus Kochsalzlösung besteht. Führen Sie den chirurgischen Eingriff und die Infusion von Kochsalzlösung (10 ml / min, für 3 min) in einer Kontrollgruppe (SHAM) durch, um die durch Operation und Kanülierung verursachte entzündliche Verzerrung zu beseitigen.
  9. Verwenden Sie Tramadol 12,5 mg/kg subkutan alle 8 Stunden, beginnend nach der postoperativen Genesung.

4. Analysemethoden

  1. Nach 12 h nach AP-Induktion werden die Tiere mit Xylazin (10 mg/kg) und Ketamin (80 mg/kg) betäubt, um etwa 250 μL Blut über den Plexus orbitalis zu sammeln.
    1. Halten Sie die Haut sanft auf dem Rücken, fördern Sie einen leichten Vorsprung des Augapfels und positionieren Sie ihn mit dem Auge nach oben.
    2. Geben Sie dem Tier einen Tropfen Augensalbe mit Lokalanästhetikum ein.
    3. Positionieren Sie das Ende des Kapillarrohrs im medialen Augenwinkel und führen Sie es vorsichtig mit einem Winkel von ~ 30 ° -45 ° unter den Augapfel ein. Drehen Sie das Kapillarrohr, bis der Blutfluss beginnt. Denken Sie daran, dass es nicht notwendig ist, Gewalt für das Verfahren anzuwenden.
    4. Sobald die Sammlung vorbei ist, stellen Sie die Homöostase sicher, indem Sie die Augenlider durch leichte Kompression mit der Gaze geschlossen halten. Entsorgen Sie das Kapillarrohr im Behälter für scharfe Gegenstände19.
    5. Zentrifugieren Sie das Serum (700 x g, 15 min) und lagern Sie den Überstand für die Amylase- und IL-6-Dosierung (Schritt 4.7 und 4.8).
  2. Einschläfern Sie Mäuse durch CO2-Ersticken .
  3. Verwenden Sie eine 27 G Nadel, um 4 ml eiskaltes 1x PBS in die Peritonealhöhle zu injizieren. Tened die Bauchhaut und stellen Sie sicher, dass die Nadel langsam in das Peritoneum gedrückt wird, um keine Organe zu punktieren. Nach der Injektion das Peritoneum 10 s lang sanft einmassieren, um die am Peritoneum haftenden Zellen zu entfernen.
  4. Machen Sie mit einer Schere und einer Pinzette einen kleinen Schnitt (0,5 cm) auf der Innenhaut und der Muskulatur, um die Bauchhöhle freizulegen. Führen Sie eine Zwiebelpipette in das Peritoneum ein und sammeln Sie die Flüssigkeit. Achten Sie darauf, kein Fettgewebe oder andere Organe anzusaugen.
  5. Sammeln Sie so viel Flüssigkeit wie möglich und deponieren Sie die gesammelte Zellsuspension in Röhren, die auf Eis aufbewahrt werden. Entsorgen Sie die Zwiebelpipette im Behälter für scharfe Gegenstände20. Zentrifugieren Sie die Peritonealflüssigkeit (250 x g, 5 min) und lagern Sie den Überstand für die IL-6-Dosierung (Schritt 4.9).
  6. Sammeln Sie die Bauchspeicheldrüsenregion neben dem Zwölffingerdarm (<5mm).
  7. Verarbeiten Sie die Bauchspeicheldrüse, indem Sie 10% Formalin fixieren und in Paraffin einarbeiten.
    1. Färben Sie die Objektträger mit Hämatoxylin und Eosin für histopathologische Analysen unter Lichtmikroskopie. Verwenden Sie das Schmidt-Protokoll21 (Pankreasödem, Azinuszelle, Verletzung/Nekrose, Bauchspeicheldrüsenentzündung), um das Ausmaß der AP zu beurteilen.
  8. Messen Sie Amylase (U / dL) mit handelsüblichen Kits gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
  9. Messen Sie IL-6 by Luminex Assays mit kommerziellen Kits gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
  10. Der in den Schritten 4.1 und 4.4 erhaltene Serum- und Peritonealflüssigkeitsüberstand wird erforderlichenfalls in einem Gefrierschrank bei -80 °C gelagert.

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Ergebnisse

Der Schweregrad der Pankreatitis wurde nach der Schmidt-Skala21 zwischen 0-3 bewertet, wobei Null der Abwesenheit, 1 einer leichten Präsenz (<25%), 2 einer moderaten Präsenz (zwischen 25 und 50%) und 3 einer intensiven Präsenz (> 50%) entspricht (Tabelle 1). Die durchgeführten Messungen waren Plasma-Amylase-Aktivität, Pankreasödem, Azinuszellen, Verletzungen/Nekrose, Pankreasentzündungen (durch histologische Analyse von H &E-gefärbten Abs...

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Diskussion

Die Methode zur Induktion einer akuten Pankreatitis durch retrograde Natriumtaurocholat-Infusion wurde bereits bei Ratten gezeigt22,23,24. Drei ähnliche Werke, die 2008, 2010 und 2015 veröffentlicht wurden, dienten als Referenz für das Protokoll3,14,15. In dieser Arbeit listen wir alle kritischen Schritte zur Reproduktion dieser Methode...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

Die Autoren danken dem Postgraduiertenprogramm in der Medizinischen Klinik der Universität von São Paulo; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) und University of São Paulo Medical School (FMUSP).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,4 mm NadelINTRAG MEDICAL TECH30G
  0,54 mm Polyethylen-SchlauchTygon730010-Styroporblock
---
Abdeckband zur Montage der MausMissner1236-Infusionspumpe
geplant auf 10µ L / min.Havard Aparatus-Schlauchpumpe SerieMA1 55-7766  Modell 66 Kleine peristaltische
Schere und Pinzette
Antiseptisches Providin JodPfizer12086ORAntisepsis
70% EthanolSIGMA459836Mix 700 mL 100% Ethanol mit 300 mL dH2O
RasierklingeLordbdk9a1ghk6Für Trichotomie
NatriumtaurocholatSigma-Aldrich86339- 1GCAS-NUMMER- 345909-26-4
Mikrogefäß-ClipMedicon Surgical56.87.35Approximator, Öffnung 4,0 mm, Schließdruck 30 -  40 g
6-0 ProlenBioline5162Nahtleitung
Ketamin NP (Cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mlCristá lia
Xilazin 2%Syntec
Sterile Kochsalzlösung (0,9% (wt/vol) Kochsalzlösung)Farmace105851
Methyl BlueSigma-Aldrich ChemicalsM5528
MILLIPLEX  KARTE  Maus-Zytokin/Chemokin-Magnetbead-Panel - Immunologie-Multiplex-AssayMERCKMCYTOMAG-70KGleichzeitige Analyse mehrerer Zytokin- und Chemokin-Biomarker mit Bead-basierten Multiplex-Assays unter Verwendung der Luminex-Technologie in Mausserum-, Plasma- und Zellkulturproben.
Amylase AssayLabtest11
Desmarres Retraktor 13 mm
Breite		ROBOZRS-6672
90183210

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