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Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse

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DOI:

10.3791/61559

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27. Juni 2020

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, School of Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Dermatology, Hunan Key Laboratory of Medical Epigenomics, The Second Xiangya Hospital, Central South University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Nach einer Virusinfektion beherbergt die Niere eine relativ große Anzahl von CD8+ T-Zellen und bietet die Möglichkeit, nicht-mukosaleT-RM-Zellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von Mausnierenlymphozyten für die Analyse der Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Gewebe-Resident Memory T-Zelle (TRM) ist ein schnell wachsendes Feld der immunologischen Forschung. Die Isolierung von T-Zellen aus verschiedenen nicht-lymphoiden Geweben ist einer der wichtigsten Schritte zur Untersuchung von TRMs. Es gibt leichte Unterschiede in den Lymphozyten-Isolationsprotokollen für verschiedene Organe. Die Niere ist ein essentielles nicht-lymphoides Organ mit zahlreichen Immunzellinfiltrationen, insbesondere nach Pathogen-Exposition oder Autoimmunaktivierung. In den letzten Jahren haben mehrere Labore, darunter unsere eigenen, begonnen, nierenansässige CD8+ T-Zellen in verschiedenen physiologischen und pathologischen Umgebungen sowohl in der Maus als auch im Menschen zu charakterisieren. Aufgrund der Fülle von T-Lymphozyten stellt die Niere ein attraktives Modellorgan dar, um TRMs in nicht-mukosen- oder nicht-barrierefreien Geweben zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das häufig in TRM-orientiertenLabors verwendet wird, um CD8+ T-Zellen von Mausnieren nach einer systemischen Virusinfektion zu isolieren. Kurz gesagt, mit einem akuten lymphatischen Choriomeningitis-Virus (LCMV) Infektionsmodell in C57BL/6 Mäusen, zeigen wir intravaskuläre CD8+ T-Zell-Etikettierung, enzymatische Verdauung, und Dichte Gradient Zentrifugation zu isolieren und anreichern Lymphozyten aus Mausnieren, um Proben bereit für die nachfolgende Durchflusszytometrie-Analyse zu machen.

Einleitung

Gewebe-Resident-Gedächtnis (TRM) T-Zellen stellen eine der am häufigsten vorkommenden T-Zellpopulationen bei erwachsenen menschlichen und infizierten Mäusen dar. TRM-Zellen bieten die erste Linie der Immunabwehr und sind kritisch in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt1,2,3,4,5. Im Vergleich zu zirkulierenden T-Zellen tragenT-RM-Zellen unterschiedliche Oberflächenmarker mit einzigartigen Transkriptionsprogrammen6,7,8. Die Erweiterung unseres Wissens über tRM-Biologie ist der Schlüssel zum Verständnis von T-Zell-Antworten, die für die zukünftige Entwicklung von T-Zell-basierten Impfstoffen und Immuntherapien unerlässlich sind.

Zusätzlich zu den gemeinsam genutzten molekularen Markern von TRMs über alle nicht-lymphoiden Gewebe deuten ansammelnde Beweise darauf hin, dass gewebespezifische Merkmale ein zentraler Bestandteil der TRM-Biologie sind 9. Niere beherbergt viele Immunzellen einschließlich TRM Zellen nach der Infektion und bietet eine große Chance, TRM Zellbiologie in einem nicht-mukosalen Gewebe zu studieren. Akute LCMV (lymphocytic choriomeningitis virus) Infektion über intraperitonealen Weg ist ein gut etabliertes systemisches Infektionsmodell, um antigenspezifische T-Zell-Reaktionen bei Mäusen zu untersuchen. Die Infektion wird in der Regel in 7-10 Tagen in Wildtyp Mäuse gelöst und hinterlässt eine große Anzahl von LCMV-spezifischen Speicher T-Zellen in einer Vielzahl von Geweben, einschließlich der Niere10. P14 TCR (T-Zellrezeptor) transgene Mäuse tragen CD8+ T-Zellen erkennen eines der immun-dominanten Epitope von LCMV präsentiert von MHC-I (Klasse I Haupt Histokompatibilitätskomplex) Molekül H2-Db in C57BL/6 Mäusen. Die Kombination kongenös markierter P14 T-Zell-Adoptivübertragung und LCMV-Infektion bei Mäusen, CD8+ Effektor- und Memory-T-Zellen werden verfolgt, einschließlich TRM-Differenzierung und Homöostase.

In einigen Barrieregeweben, wie intestinalen intraepitheliaalen Lymphozyten (IEL) und Speicheldrüsen, führt etablierte Lymphozytenisolationsverfahren zu einem hohen Prozentsatz von TRM-Zellen mit minimaler blutübertragener T-Zellkontamination im Maus-LCMV-Modell11. Jedoch, in Nicht-Barriere-Gewebe, wie die Niere, dichte skuläre Netzwerk enthält eine große Anzahl von zirkulierenden CD8+ T-Zellen. Es ist gut dokumentiert, dass selbst eine erfolgreiche Perfusion nicht alle zirkulierenden CD8+ T-Zellen effizient entfernen kann. Um diese technische Hürde zu überwinden, wurde die intravaskuläre Antikörperfärbung als eine der am häufigsten verwendeten Techniken in TRM Laboren12etabliert. Kurz gesagt, 3-5 Minuten vor der Euthanasie, wird 3 g/Maus-Anti-CD8-Antikörper (zur Kennzeichnung von CD8+ T-Zellen) intravenös abgegeben. Intakte Blutgefäßwand verhindert eine schnelle Diffusion des Antikörpers innerhalb dieses kurzen Zeitraums (d. h. 3-5 Minuten) und nur intravaskuläre Zellen werden gekennzeichnet. Nach dem Standard-Lymphozyten-Isolationsprotokoll können intravaskuläre versus extravaskuläre Zellen leicht mit Derflusszytometrie unterschieden werden.

Hier beschreiben wir ein Standardprotokoll, das häufig in TRM-Labors verwendet wird, um intravaskuläre Etikettierung, Lymphozytenisolation und Durchflusszytometrieanalyse von Nieren-CD8+ T-Zellen mit einer C57BL/6-Maus durchzuführen, die CD45.1+ P14 T-Zellen und LCMV-Infektion 30 Tage vor13erhalten hat. Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um sowohl Effektor- als auch Memory-T-Zellen in der Niere zu untersuchen.

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Protokoll

Alle Tierversuche, die nach diesem Protokoll durchgeführt werden, müssen vom jeweiligen institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung (IACUC) genehmigt werden. Alle hier beschriebenen Verfahren wurden von IACUC UT Health San Antonio genehmigt.

1. Adoptivtransfer von P14-T-Zellen in C57BL/6-Empfänger und LCMV-Infektion

  1. Verwenden Sie P14-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen. Stellen Sie sicher, dass das Geschlecht der spenderischen P14 TCR transgene Maus mit dem Geschlecht von C57BL/6-Empfängermäusen übereinstimmen sollte. Andernfalls führen Zellen wie männliche T-Zellen, die in weibliche Mäuse übertragen werden, in etwa 12 Tagen14zu einer immunvermittelten Abstoßung zirkulierender Spender-T-Zellen.
  2. Reinigen Sie naive CD8+ T-Zellen aus den Milz- und Lymphknoten einer transgenen P14 TCR-Maus mit Maus-CD8+ T-Zellreinigungskit nach dem Herstellerprotokoll.
    1. Kurz, sezieren Milz und Lymphknoten, maischen Sie die Proben, um einzellige Suspension zu erzeugen.
    2. Um sich für naive T-Zellen anzureichern, fügen Sie Biotin-Anti-CD44-Antikörper während des ersten Antikörper-Inkubationsschritts13hinzu.
      HINWEIS: Negative Auswahl kommerzielle Kit in diesem Schritt verwendet enthält zwei Hauptkomponenten für zwei Schritte der Inkubation (d. h. Biotin-Antikörper-Gemisch-Inkubation und Streptavidin-magnetische Perle Inkubation).
  3. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen und 1.000 bis 10.000 gereinigte P14-T-Zellen in 200 L PBS in jedes Geschlecht zu injizieren, der c57BL/6-Empfänger über die Schwanzvene übereinstimmte.
    HINWEIS: Das detaillierte Injektionsprotokoll für die Schwanzvene wird in Schritt 2 beschrieben.
  4. Am nächsten Tag erhalten alle C57BL/6-Empfänger 2 x 105 pfu LCMV Armstrong, die in 200 l PBS über eine intraperitoneale Route verdünnt werden.

2. Intravaskuläre Kennzeichnung von CD8+ T-Zellen

HINWEIS: Je nach Forschungsinteresse können nach einer Infektion unterschiedliche Zeitpunkte gewählt werden. Ein Beispiel für Tag 30 nach der Infektion (Tag 30 nach Schritt 1.4) wird gezeigt, was oft als früher Speicherzeitpunkt für die Reaktion der CD8-T-Zellen betrachtet wird.

  1. Verdünnung des Biotin-Anti-CD8-Antikörpers auf 15 g/ml in PBS. Stellen Sie sicher, dass jede Maus 200 L PBS mit 3 g Antikörpern erhält.
    HINWEIS: Biotin Anti-CD8 Antikörper wird hier verwendet, so dass es flexibler sein wird, um die endgültige FACS Färbung Panel zu entwerfen. Fluoreszierender farbstoffmarkierter Antikörper kann direkt verwendet werden. Es ist jedoch wichtig, verschiedene Klone monoklonaler Antikörper zur intravenösen Etikettierung im Vergleich zur FACS-Färbung zu verwenden.
  2. Erhitzen Sie die Schwanzvene von Mäusen mit einer Wärmelampe über dem Kopf 5-10 min, um die Venen zu verdünnen.
    HINWEIS: Es muss besonders darauf geachtet werden, dass die Tiere nicht überhitzt werden. Reduzieren Sie die Hitze oder entfernen Sie die Wärmelampe, wenn die Mäuse aufhörten, sich zu bewegen.
  3. Ziehen Sie 200 L vorverdünnten Anti-CD8-Antikörper-Mix in eine 100-U-Insulinspritze (28G) und entfernen Sie luftblasen, indem Sie den Kolben nach oben und unten bewegen. Biegen Sie die Nadel, um einen 150° Winkel zwischen der Nadel und Spritze zu schaffen, abschrägen, so dass die Nadel parallel zur Vene sein wird.
  4. Halten Sie die Maus mit einem Nagetier-Retrainer von entsprechender Größe zurück und sprühen Sie den Schwanz mit 70% Ethanol, um die Vene deutlich sichtbar zu machen.
    HINWEIS: Die Dauer der Rückhalteeinrichtung sollte auf ein Minimum beschränkt werden.
  5. Halten Sie den Schwanz am distalen Ende mit Daumen und Mittelfingern der nicht-dominanten Hand. Platzieren Sie den Zeigefinger unter der Stelle, an der die Nadel eingesetzt wird.
  6. Halten Sie die Spritze mit der dominanten Hand und legen Sie die Nadel parallel in Richtung Herz in die Vene ein.
    HINWEIS: Bei richtiger Platzierung sollte sich die Nadel sanft in die Vene bewegen.
  7. Injizieren Sie langsam 200 L Anti-CD8-Antikörper über die Schwanzvene.
    HINWEIS: Wenn ein Widerstand vorhanden ist oder ein weißer Bereich über der Nadel am Schwanz zu sehen ist, befindet sich die Nadel nicht in der Vene. Beginnen Sie die erste Injektion in der Nähe der Schwanzspitze. Bei Bedarf vorwärts in Richtung der Unterseite des Schwanzes für nachfolgende Injektionen bewegen.
  8. Entfernen Sie die Nadel und wenden Sie die Kompression vorsichtig an, bis die Blutung aufhört.
  9. Kehren Sie die Maus in den Käfig zurück und einschläfern Sie die Maus nach 3-5 min.
    HINWEIS: Die Mäuse sollten über isoflurane Kammer gefolgt von zervikalen Dislokation enthanisiert werden. Andere Methoden, wie die CO2-Inhalation, dauern bis zu 5 min und können unnötige Variationen der intravenösen Antikörper-Etikettierungszeit mit sich bringen.
  10. Sezieren Sie die Niere mit einer Schere, übertragen Sie die gesamte Niere auf 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre und lassen Sie die Proben bis zur Weiterverarbeitung auf Eis.
    HINWEIS: Intakte ganze Niere kann sicher auf Eis für ein paar Stunden vor der nachfolgenden Verarbeitung und Verdauung gelagert werden.

3. Enzymatische Verdauung der Niere

  1. Bereiten Sie 6 Brunnenplatten mit 3ml der Verdauungslösung (RPMI/2% FCS/1 mg/ml Collagenase B) für jede Maus vor, auf Eis lagern.
    HINWEIS: Die Lagerkollagenase B-Lösung mit höherer Konzentration (z.B. 20x) kann bei oder unter -20°C hergestellt und gelagert werden. Die Arbeitslösung sollte frisch vorbereitet werden. In Tabelle 1 finden Sie die Rezepte für alle Lösungen/Puffer, die im aktuellen Protokoll verwendet werden.
  2. Fügen Sie 300 l Verdauungslösung in die 1,5 ml Mikrozentrifugenprobenröhrchen ein und zerkleinern Sie die Nierenproben mit einer geraden Federschere.
    HINWEIS: Das Nierengewebe sollte in gerade Stücke mit Größen von nicht größer als 1,5 mm Durchmesser zerkleinert werden. Es ist kein Entkapselungsschritt erforderlich.
  3. Übertragen Sie die gehackten Nierenproben auf 6 Brunnenplatten, die die Verdauungslösung enthalten
    HINWEIS: 6 Brunnenplatten werden nur dann für die Bequemlichkeit verwendet, wenn mehrere Proben verarbeitet werden müssen.
  4. Die Proben bei 37 °C mit sanftem Schaukeln (ca. 60 Rpm) für 45 min inkubieren.
  5. Nach der Verdauung das Gewebe mit dem Kolbenflansch einer 3 ml Spritze direkt in der Schale zerkleinern und in 15 ml konische Schläuche übertragen.
    HINWEIS: Normalerweise ist eine Filtration durch ein Zellsieb in diesem Schritt nicht erforderlich, da neben der Reinigung lebender Lymphozyten eine Zentrifuge durchgeführt wird.
  6. Drehen Sie die Proben bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
  7. Setzen Sie das Pellet in 3 ml RPMI/10% FCS wieder aus.

4. Dichtegradientzentrifugation zur Anreicherung von Lymphozyten aus der verdauten Niere

  1. Drehen Sie die Probe bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
  2. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit 5 ml 44% Percoll/RPMI-Mix (44% Percoll + 56% RPMI ohne FBS) wieder auf.
  3. Legen Sie die Spitze einer 3 ml Pipette mit 3 ml 67% Percoll/PBS (67% Percoll + 33% PBS) direkt an den Boden jedes Rohres, und lösen Sie die Lösung langsam los, so dass die schwere Lösung (67% Percoll/PBS) eine eigene Schicht am Boden bildet und die leichte Lösung (44% Percoll/RPMI) angehoben wird. Gemeinsam bilden sich Cocktailschichten.
    HINWEIS: Für neu angekommene Dichte Gradientenmedium vom Hersteller, fügen Sie 1/10 Volumen sterile 10x PBS auf die Flasche, mischen Sie gut und betrachten Sie die PBS-ausgewogene Dichte Gradient medium als 100% Lösung.
  4. Drehen Sie die Proben bei 900 x g für 20 min bei Raumtemperatur mit reduzierter Beschleuniger- und Bremseinstellung.
    HINWEIS: Verwenden Sie für Zentrifugen mit Gasbeschleuniger- und Bremseinstellungen (auf einer Skala von 1-9 (1 bedeutet Minimum und 9 bedeutet maximal)) 6 für Gaspedal und 4 für die Bremse.
  5. Entfernen Sie die Rohre vorsichtig aus der Zentrifuge, ohne die Schichten zu stören;
    HINWEIS: Zwischen rosa Farben-RPMI-Schicht und farbloser PBS-Schicht wird eine klare Lymphozytenschicht identifiziert.
  6. Entfernen Sie die obere Schicht mit einer Transferpipette, ohne die Lymphozytenschicht zu berühren.
  7. Übertragen Sie die Lymphozytenschicht in ein neues 15 ml-Rohr, füllen Sie das Rohr mit PBS/5% FCS und mischen Sie das Rohr 4-6x langsam, um eine ausreichende Mischung zu gewährleisten.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, um alle verbleibenden Percoll sausen.
  8. Drehen Sie die Proben bei 500 x g für 5 min bei 4 °C.
  9. Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet mit 500 L komplettem RPMI-Medium wieder auf. Die Zellen sind bereit für die Durchflusszytometriefärbung.

5. Durchflusszytometrie Färbung und Analyse

HINWEIS: Bitte befolgen Sie das Standard-Flow-Zytometrie-Färbeprotokoll für T-Lymphozyten.

  1. Nehmen Sie etwa 1 x 106 Zellen für jede FACS Färbung.
    HINWEIS: Verwenden Sie eine U-boden 96 WellPlatte für FACS Färbung. Wenn jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Proben beteiligt ist, können auch 5 ml FACS-Rohre verwendet werden.
  2. Drehen Sie die Zellen bei 500 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
  3. Setzen Sie jede Probe in 50 l FACS-Puffer mit 10 g/ml 2.4G2-FcR-Blocker (ein monoklonaler Anti-CD16/32-Antikörper zur Blockierung der Wechselwirkung zwischen zugesetztem FACS-Antikörper mit FcR) wieder auf. 15 min auf Eis bebrüten.
  4. Ohne weitere Zentrifugation fügen Sie für jede Probe 50 l Oberflächenfärbeantikörpermischung hinzu, so dass das endgültige Färbevolumen 100 l/jede Probe beträgt. Inkubieren Auf Eis für 30 min im Dunkeln.
    ANMERKUNG: Fügen Sie fluoreszierend beschriftetes Streptavidin (2 g/ml) in das Antikörpergemisch ein, um CD8+ intravaskuläre CD8+ T-Zellen zu kennzeichnen, und verwenden Sie fluoreszierenden anti-CD8-Antikörper, um alle CD8-T-Zellen zu kennzeichnen. Die Antikörpermischung wird durch Zugabe der gewünschten Mengen interessierter Antikörper in den FACS-Puffer hergestellt.
  5. Waschen Sie die Proben zweimal mit PBS. Für jede Wäsche die Brunnen der 96-Wellplatte mit kaltem PBS füllen, bei 500 x g 5 min bei 4 °C drehen und den Überstand entsorgen.
  6. Setzen Sie die Zellen in 100 L/Well des verdünnten Lebenden/Todesfarbstoffs aus. Inkubieren Auf Eis für 30 min im Dunkeln.
    HINWEIS: Selbst bei Dichtegradienten mittlerer Spin induziert der enzymatische Verdauungsschritt oft einen signifikanten Zelltod in geweberesidenten T-Zellen aufgrund der ARTC2.2/P2RX7-Signalisierung15. Live/Death Farbstoff Färbung ist sehr zu empfehlen, bevor Fixierung. Anti-ARTC2-Nanokörper können vor der Euthanasie in die Mäuse eingegliedert werden, um den zellisolationsinduzierten Zelltod zu verhindern.
  7. Waschen Sie die Proben zweimal mit FACS-Puffer. Für jede Wäsche die Brunnen der 96-Well-Platte mit kaltem FACS-Puffer füllen, bei 500 x g 5 min bei 4 °C drehen und den Überstand entsorgen.
  8. Setzen Sie die Zellen in einem Puffer mit 100 L/Well-Fixierung aus. Bei 37 °C für 10 min inkubieren.
    HINWEIS: Der Fixierpuffer wird frisch durch Verdünnen von Formaldehyd mit PBS auf eine Endkonzentration von 2% Formaldehyd hergestellt.
  9. Waschen Sie die Proben zweimal mit FACS-Puffer. Für jede Wäsche die Brunnen der 96-Wellplatte mit kaltem FACS-Puffer füllen, bei 500 x g 5 min bei 4 °C drehen und den Überstand entsorgen.
  10. Setzen Sie die Zellen in einem FACS-Puffer von 250 L/Well aus. Versiegeln Sie die Platte, lagern Sie bei 4 °C und schützen Sie vor Licht bis zur FACS-Analyse.
    HINWEIS: Filtern Sie die Proben vor der FACS-Analyse durch ein 70 M-M-Nylongewebe, um mögliche Zellcluster zu entfernen, die die FACS-Maschine verstopfen können.

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Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll ist in einem Flussdiagramm zusammengefasst (Abbildung 1A). An Tag 30 nach der LCMV-Infektion führten wir eine intravaskuläre Kennzeichnung von CD8+ T-Zellen durch. 5 Minuten später wurden beide Nieren des Tieres seziert, gehackt und der Kollagennaseverdauung unterzogen. Lymphozyten wurden durch Percoll-Zentrifugation aus den verdauten Proben weiter gereinigt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Wie in Abbildung 1B

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Diskussion

Da die gewebespezifische Immunität ein schnell wachsendes Forschungsgebiet ist, deuten anhäufende Beweise darauf hin, dass Immunzellen, insbesondere Lymphozytenpopulation, in fast allen Organen von erwachsenen menschlichen oder infizierten oder immunisierten Mäusen identifiziert werden können. LCMV-Mausinfektionsmodell ist ein etabliertes Modell zur Untersuchung der antigenspezifischen T-Zell-Reaktion, Despezifikum und Speicher-T-Zelldifferenzierung einschließlichT RM-Biologie über mehrere Gewebe hinweg. Hier ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine relevanten finanziellen Angaben.

Danksagungen

Diese Arbeit wird unterstützt durch NIH-Stipendien AI125701 und AI139721, Cancer Research Institute CLIP-Programm und American Cancer Society Grant RSG-18-222-01-LIB an N.Z. Wir danken Karla Gorena und Sebastian Montagnino von Flow Cytometry Facility. Die in der Flow Cytometry Shared Resource Facility generierten Daten wurden vom University of Texas Health Science Center in San Antonio (UTHSCSA), dem NIH/NCI-Stipendium P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] at UTHSCSA) und UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 ml MikrozentrifugenröhrchenFisherbrand05-408-130
15 ml konische RöhrchenCorning431470
3 ml SpritzeBD309657
37C InkubatorVWR
Biotin a-CD8a Antikörper (Klon 53-6.7)Tonbo Biosciences30-0081-U025
KälberserumGE Gesundheitswesen Leben SciencesSH30073.03
Collegenase BMillipore Sigma11088807001
Einweg-MesspipettenFisherbrand13-711-9AM
InsulinspritzeBD329424
MikropräparierfederschereRoboz SurgicalRS 5692
Mojosort Maus CD8 Naï ve T Cells Isolation KitBiolegend480043
DeckenleuchteAmazonB00333PZZG
PBS
PercollGE Healthcare Life Sciences17089101
WippeVWR
RPMIGE Healthcare Life SciencesSH30096.01
Maus aus massivem Messing SuspensionBraintree Scientific, IncSAI-MBR
Swing Bucket Zentrifuge mit KühlschrankThermofisher
Tissue Culture 6-Well-PlatteCorning3516

Referenzen

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Schlagwörter

Intravaskul re Markierung von CD8 T Zellenenzymatischer VerdauDichtegradientenzentrifugationLymphozytenisolationNierengewebe der Mausgeweberesidente Memory T ZellenLCMV InfektionsmodellProtokoll zur Zellanreicherung

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