Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz

Zusammenfassung

Präsentiert wird hier ein Protokoll zur Untersuchung der koronaren Mikrozirkulation im lebenden murinen Herzgewebe durch ex vivo-Überwachung des arteriellen Perfusionsdrucks und -flusses, der den Druck aufrechterhält, sowie gefäßvaskulärer Baumbestandteile, einschließlich der Kapillarbetten und Pericyten, da die Septalarterie kanüliert und unter Druck steht.

Zusammenfassung

Der koronare arterielle Ton sowie das Öffnen oder Schließen der Kapillaren bestimmen weitgehend den Blutfluss zu Kardiomyozyten bei konstantem Perfusionsdruck. Es ist jedoch schwierig, die dynamischen Veränderungen der koronaren Arteriolen und der Kapillaren im ganzen Herzen zu überwachen, vor allem aufgrund seiner Bewegung und non-stop schlagen. Hier beschreiben wir eine Methode, die die Überwachung der arteriellen Perfusionsrate, des Drucks und der Durchmesseränderungen der Arteriolen und Kapillaren in den rechten ventrikulären Papillarmuskeln der Maus ermöglicht. Die Mausseptalarterie wird kanüliert und bei einem konstanten Durchfluss oder Druck mit der anderen dynamisch gemessenen durchtränz. Nach Perfusion mit einem fluoreszierend gekennzeichneten Lektin (z.B. Alexa Fluor-488 oder -633 mit Weizen-Germ Agglutinin, WGA) konnten die Arteriolen und Kapillaren (und andere Gefäße) in rechten Ventrikelpapillarmuskel und Septum leicht abgebildet werden. Die Gefäßdurchmesseränderungen könnten dann in Gegenwart oder Abwesenheit von Herzkontraktionen gemessen werden. Wenn genetisch kodierte fluoreszierende Proteine exprimiert wurden, konnten bestimmte Merkmale überwacht werden. Zum Beispiel wurden Pericyte in Mausherzen visualisiert, die NG2-DsRed ausdrückten. Diese Methode hat eine nützliche Plattform zur Untersuchung der physiologischen Funktionen von kapillaren Pericyten im Herzen zur Verfügung gestellt. Es eignet sich auch zur Untersuchung der Wirkung von Reagenzien auf den Blutfluss im Herzen durch gleichzeitige Messung des Vaskulären/Kapillardurchmessers und des arteriellen Luminaldrucks. Dieses Präparat, kombiniert mit einem hochmodernen optischen Bildgebungssystem, ermöglicht es, den Blutfluss und seine Kontrolle auf zellulärer und molekularer Ebene im Herzen unter nahezu physiologischen Bedingungen zu untersuchen.

Einleitung

Eine angemessene koronare Druck-Durchfluss-Regulierung gewährleistet eine ausreichende Blutversorgung des Herzens, um seine metabolischen Anforderungen zu erfüllen¹. Allerdings ist erst vor kurzem deutlich geworden, wie der koronare Druckfluss im Herzen dynamisch reguliert wird, trotz umfangreicher Studien, die in den letzten Jahrzehnten in vivo und in vitro durchgeführt wurden. Einer der Gründe ist die Schwierigkeit, ein physiologisches Arbeitsmodell für solche Studien aufgrund des ständigen Schlagens des Herzens zu etablieren. Unabhängig davon wurden eine Vielzahl von Methoden zur Beobachtung der koronaren Mikrogefäße in lebenden Geweben oder....

Protokoll

Die gesamte Tierpflege entsprach den Richtlinien der University of Maryland Baltimore und des Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte Protokolle.

1. Vorbereitung der Lösungen

HINWEIS: Bereiten Sie Lösungen im Voraus vor. In den Experimenten werden zwei Arten von Basislösungen eingesetzt: (1) physiologische Salzlösungen (PSS) für Badsuperfusate und (2) Tyrodes Lösungen für Lumenperfusate. Kontinuierliches Blasen mit CO₂ ist erforderlich, um den pH-Wert von PSS aufrechtzuerhalten. HePES-gepufferte Tyrodes Lösung wird im Lumen anstelle von PSS verwendet, um zu vermeiden, dass Blasen in die Ge....

Ergebnisse

Wenn ein Fluoreszenzgefäßmarker in Gefäßlumen durchdrungen ist (hier WGA konjugiert mit Alexa Fluor-488), ist es möglich, ganze Gefäßbäume zu visualisieren, wie in Abbildung 5 (linkes Panel) mit dem Konfokalmikroskop mit hoher Geschwindigkeit dargestellt. Eine weitere Vergrößerung ermöglicht die Abbildung der Kapillare im Detail(Abbildung 5, Rechtes Panel). Da das Drucksystem eine konstante Überwachung des Luminaldrucks unterstützt, kann dieses Präparat zur Asso.......

Diskussion

In der vorliegenden Arbeit haben wir eine bemerkenswert einfache, aber sehr praktische Ex-vivo-Methode eingeführt, um die koronare Mikrozirkulation im Herzen unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Diese Methode wurde aus mechanischen Untersuchungen mit Ratten²modifiziert. Die herausforderungsgemäße Ergänzung war die Bildgebungstechnologie mit hoher Geschwindigkeit und hoher optischer Auflösung. So konnten wir die fortschrittlichen optischen Bildgebungssysteme nutzen, die jetzt im Handel.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 M CaCl2-Lösung	MilliporeSigma, USA	21115
1 M MgCl2-Lösung	MilliporeSigma, USA	M1028
AxoScope-Software	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Kühler/Wasserinkubator	FisherScientific, USA	Isotemp 3016S
Konfokal	Nikon Instruments, USA	A1R
Kundenspezifische Glasröhren	Drummond Scientific Company	9-000-3301
Digidata 1322A	Molecular Devices, San Jose, CA, USA
Präpariermikroskop	Olympus, Japan	SZX12
Endothelin-1	MilliporeSigma, USA	E7764
Pinzette	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	11295-51
Heparin-Natrium Salt	Sigma-Aldrich, USA	H3393
Inline-Lösungsheizung	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	SH-27B
Isofluran	VETone, Idaho, USA	502017
Mikropipettenabzieher	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97
Mikropipetten-/Kanülenhalter	Warner Istruments, Hamden, CT, USA	64-0981
NG2DsRedBAC transgene Maus	The Jackson Laboratory	#008241
Nylonfaden zum Binden von Blutgefäßen	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	THR-G
PDMS (Polydimethylsiloxan)	SYLGARD, Germantown, WI, USA	184 SIL ELAST KIT
Schlauchpumpe	Gilson, Middleton, WI, USA	minipuls 3
Druck Servo Controller	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-S
Schere	Feine wissenschaftliche Werkzeuge, Foster City, CA, USA	15000-10
Servopumpe	Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA	PS-200-P
Temperaturregler	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	TC-324B
Weizenkeim-Agglutinin, Alexa Fluor 488 Konjugat	ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA	W11261