Ein In-Vitro-Hämodynamik-Loop-Modell zur Untersuchung der Hämozytokompatibilität und Der hostcell-Aktivierung von Gefäßmedizingeräten

Hämokompatibilitätstests von Medizinprodukten sind ein entscheidender Schritt bei der Entwicklung neuer Geräte wie Gefäßstents oder Perfusionsröhren für die extrakorporale Membransauerstoffversorgung. Bis heute gelten Tiermodelle als Standardwerkzeuge, um das Verfahren zur Prüfung der Medizinprodukte vor ihrer Umsetzung beim Menschen abzuschließen. Von nun an ist es notwendig, alternative In-vitro-Modelle zu finden, die bei der Minimierung von Tieruntersuchungen weiter helfen. In dieser Studie haben wir daher ein Miniatur-In-vitro-Hämodynamik-Schleifenmodell untersucht. Ziel dieser vorgestellten Methode ist es, die In-vitro-Blutverträglichkeit von Medizinprodukten nach der Norm ISO 10993-4 zu testen.

Der ISO 10993-4-Standard beschreibt standardisierte Sätze klinischer Parameter, die an Blutprobe¹untersucht werden sollen. Kurz gesagt, dies sind Thrombose (Thromboletaggregation und -anzahl), Gerinnung (Fibrinopeptid A, FPA), hämatologische Analyse (Vollblutzellzahl), Hämolyseindex (freies Plasmahämoglobin) und das Komplementsystem (Terminalkomplementkomplex, sC5b9). Zusätzliche Marker, wie z.B. neutrophile polymorphonukleare Elastase (PMN), Interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor - alpha (TNF), die den Aktivierungsstatus von Leukozyten widerspiegeln, können auch für Messungen berücksichtigt werden. Zur Bestimmung und Quantifizierung der zirkulierenden zellfreien Proteine, die im Blutplasma vorhanden sind, stellt der sandwich-enzymatische Immunsorbent Assay (ELISA) eine konventionelle und zuverlässigste Methode^2,3dar. Ebenso können der Phänotyp und der Aktivierungsstatus der Wirtszellen (z. B. Leukozyten) quantifiziert werden, indem die Zelloberflächenexpression von Molekülen durch Durchflusszytometrie (FACS) erkannt wird, die auf einzelzelliver Suspensions-basierten Auslesungen basiert, bei denen fluoreszierende markierte spezifische Antikörper an die Zielzelloberflächenmoleküle^{4 binden.} Die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wird auch empfohlen, um die Thrombusbildung auf dem getesteten Material nach iso 10993-4 Standard¹zu bestimmen. Diese Methode kann durch röntgenmikrotomographie (CT) ergänzt werden, um strukturelle Analysen des Thrombus z.B. seiner Dicke, Größe und Lokalisation in einem 3D-gerenderten Bild⁵durchzuführen.

Der Grund für die Verwendung dieses in vitro hämodynamischen Modells ist es, die leistungsfähigsten und kompatiblen Medizinprodukte zu überprüfen, indem man die grundlegende physiologische Dynamik von Blutbestandteilen wie Blutplättchen, die an der primären Hämostase oder Leukozyten und deren Wechselwirkung mit verschiedenen Arten von Gefäßgeräten beteiligt sind, versteht. Solche In-vitro-Systeme sind sehr gefragt, da sie den Bedarf an Tierstudien reduzieren.

Das hier vorgestellte Loop-Modell erfüllt diese Anforderungen. Dieses Modell wurde erstmals 1958 von A.B. Chandler für die Herstellung von Blutthrombi beschrieben und wird daher auch Chandler Loop Modell⁶genannt. Bis jetzt wurde dieses Modell in einer Reihe von Experimenten und Modifikationen verwendet, um die Blutbiokompatibilität von Medizinprodukten^7,8,^{9,10,11,12,13,14}zu untersuchen. Es besteht aus Polymerröhren, die teilweise mit Blut gefüllt und zu reverschließbaren Schlaufen geformt werden. Diese Schleifen drehen sich in einem temperaturgeregelten Wasserbad, um vaskuläre Strömungsbedingungen mit ihren hämorheologischen Wirkungen zu simulieren. Alternative Methoden wie pumpengetriebene Modelle oder Modelle, die mechanische Kugelhähne innerhalb der Schlaufen verwenden, um einen Blutfluss in den Polymerröhren zu induzieren, wurden bereits beschrieben^15,16. Der Gesamtvorteil der hier vorgestellten Methode besteht jedoch darin, dass die mechanische Kraft, die auf die Blutzellen und Proteine ausgeübt wird, gering ist, wodurch Hämolyse vermieden wird und es keinen Kontakt zwischen Blut und Anschlüssen gibt, der möglicherweise zu Strömungsturbulenzen und der Aktivierung von Blutbestandteilen führen könnte. Die wichtigsten aktivierenden Faktoren innerhalb der Schleife sind das Testmaterial selbst und die Luft, die im Inneren eingeschlossen ist. Dies trägt dazu bei, Messfehlerquellen zu minimieren und eine hohe Reproduzierbarkeit zu liefern, auch wenn die Blut-Luft-Schnittstelle zu einer Proteindenaturierung führen kann¹⁷. Es ist auch möglich, Sorten von Rohrmaterialien und Stentdurchmesser ohne Längen- oder Größenbeschränkungen zu untersuchen, wodurch die Verwendung von Rohren unterschiedlicher Länge und Innendurchmesser ermöglicht wird. Darüber hinaus können auch Hämokompatibilitäten von Wirtshämokompatibilitäten bei ungenauem Schleifenverschluss und Exposition gegenüber der unbeschichteten Rohroberfläche untersucht werden. Andere ähnliche medizinische Anwendungen dieses in vitro hämodynamischen Schleifenmodells ist, dass es auch verwendet werden könnte, um die Wechselwirkungen zwischen Immuntherapeutika (Medikamente) und Blutbestandteilen während der präklinischen Entwicklung oder des individuellen Arzneimittelsicherheitsscreenings vor der klinischen Erstphase I oder für die Erzeugung von Thrombusmaterial zu untersuchen, das in weiteren Experimenten^18,19,20verwendet werden kann.

Diese Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll zum Testen der Hämokompatibilitäten von Perfusionsröhren und/oder Stents. Hier der Vergleich zwischen unbeschichteten und beschichteten PVC-Rohren (hepPVC: Heparin-Beschichtung, PolyPVC: Beschichtung mit einem bioaktiven Polymer). Für beide beschichteten Rohre wurde eine niedrigere Aktivierung der Thrombozyten, aber eine höhere Aktivierung des Gerinnungssystems (FPA) im Vergleich zu den unbeschichteten Rohren gefunden. Die hier verwendeten HepPVC-Rohre werden mit kovalent gebundenem Heparin modifiziert, um sie thromboresistent²¹ zu machen und wurden bereits in einem Schleifenmodell eingesetzt, um verschiedene Parameter zu optimieren und zu charakterisieren²². Die in dieser Studie verwendeten PolyPVC-Röhren sind handelsübliche Röhrchen, die in klinischen Umgebungen der extrakorporalen Blutperfusion verwendet werden und mit einem Heparinpolymer beschichtet sind, um ihre Thrombogenität zu reduzieren²³. Manchmal werden in klinischen Anwendungen sogar unbeschichtete PVC-Rohre verwendet. Daher haben wir Latexröhren als positive Kontrollgruppe aufgenommen, die eine übermäßige Aktivierung von Thrombozyten, Gerinnungssystem und lösliche Faktoren wie IL-6, TNF und PMN-Elastase zeigte. Thrombusbildung wurde bemerkt, als ein ungenauer Schleifenverschluss simuliert wurde. Dies führte zur Aktivierung des Gerinnungs- und Komplementsystems sowie von Leukozyten und Thrombozyten im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen. Darüber hinaus führte der Blutkontakt mit dem hier verwendeten Stentmaterial (blankes Nitinolstent, bedeckt mit kohlenstoffimprägniertem expandiertem Polytetrafluorethylen) zu einer höheren Thrombozyten- und Leukozytenaktivierung in Form von PMN-Elastase. Insgesamt induzierte das vorgestellte Modell keine Hämolyse in einem der getesteten Gefäßgeräte, da sie mit den Ausgangs- oder statischen Bedingungen vergleichbar waren, mit Ausnahme der Latexröhren, bei denen die Hämolyse roter Blutkörperchen (RBC) offensichtlich war. Darüber hinaus können diese Perfusionsröhren entweder bildgebend oder durch Histologie untersucht werden. Obwohl histologische Auswertungen machbar sein könnten, konzentrierten wir uns hauptsächlich auf ELISA und Durchflusszytometrie, um diese Experimente durchzuführen und damit die Machbarkeit von Experimenten auf der Grundlage des hier vorgestellten Modells für viele Laboratorien zu ermöglichen. Somit stellt diese Methode eine praktikable Methode dar, um die Blutbiokompatibilität von gefäßmedizinischen Geräten gemäß den Empfehlungen der ISO 10993-4-Norm zu testen. Darüber hinaus kann diese Methode immer dann eingesetzt werden, wenn eine Wechselwirkung zwischen Blut und Materialien unter Strömungsbedingungen getestet werden sollte, die die In-vivo-Bedingungen imitiert.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission der medizinischen Fakultät des Universitätsklinikums Magdeburg (Antragsnummer 88/18) genehmigt und die Probanden vor dem Blutentnahmeverfahren schriftlich in Kenntnis der Einwilligung einwilligt.

1. Heparin-Stoffzubereitung und Blutentnahme

1. Berechnen Sie die Menge an Blut, die für die gesamten Experimente benötigt wird.
   HINWEIS: Fast 5 ml heparinisiertes Blut werden für jedes Gefäßgerät in Duplikaten (Schleifen) benötigt. Ebenso werden 5 ml Blut für jede Ausgangs- und statische Bedingung benötigt, die bei Raumtemperatur beiseite gehalten wird.
2. Bereiten Sie eine Heparin-Stammlösung in der Konzentration von 100 I.E./ml vor, indem Sie das unfraktionierte Heparin (z.B. Rotexmedia) in entionisiertem Wasser verdünnen. Verwenden Sie 150 l dieser Lösung für die Heparinisierung von 10 ml frischem Blut.
3. Berechnen Sie die Menge an Blut sowie Plasma, die für die Blutkörperchenzahl, ELISA und FACS-Assays benötigt werden.
   HINWEIS: Die in dieser Studie dargestellten Messungen stammen aus zwei parallel verlaufenden Schleifen (eine als Duplikat) mit einem Gesamtblutvolumen von 10 ml.
4. Auf der Grundlage der erforderlichen Blutmenge 10 ml Spritzen mit 150 l Heparin-Stammlösung füllen, um die Blutgerinnung mit einer endgültigen Heparinkonzentration von 1,5 I.E./ml Blut zu verhindern.
5. Zeichnen Sie Blut mit einem Schmetterling (Größe: 21 G). Füllen Sie die Spritzen sehr sanft, um Hämolyse oder Zellaktivierung durch übermäßiges Vakuum zu vermeiden.
   HINWEIS: Die Genehmigung der lokalen Ethikkommission sollte vor Beginn der Experimente eingeholt werden. Einholen Sie die informierte Zustimmung von jedem menschlichen Blutspender. Stellen Sie sicher, dass der Blutspender gesund ist und keine Medikamente, insbesondere keine Thrombozytenschutzmittel oder nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente für mindestens 10 Tage vor den Experimenten. Bemerkenswert ist, dass derselbe Spender bevorzugt wird, wenn verschiedene Arten von Gefäßgeräten zum ersten Mal verglichen werden, wie in diesem Manuskript dargestellt. Um die interindividuellen Unterschiede weiter zu bewerten, kann das Protokoll mit verschiedenen Spendern wiederholt werden.
6. Sammeln Sie Blut in einem Glasbecher, vermeiden übermäßige Unruhe.

2. In-vitro-hämodynamische Schleifenbaugruppe

1. Füllen Sie das Wasserbad, bis der Wasserstand bis zur Mitte der Rotationseinheit reicht. Wassertemperatur auf 37 °C einstellen.
2. Schleifenmontage zur Prüfung verschiedener Rohrmaterialien (PolyPVC, HepPVC, PVC und Latex)
   1. Schneiden Sie mit dem Rohrschneider zwei 50 cm lange Teile jedes Rohrmaterials (Innendurchmesser 5 mm). Achten Sie darauf, dass die Schnittfläche flach ist, da dies besonders wichtig ist für den perfekten Verschluss für die Schlaufen mit kleinen Durchmessern, so dass Blut ohne Verzerrung auf der Passendenkante fließt.
      HINWEIS: Dieses gesamte Protokoll nutzt die Rohre mit einem Innendurchmesser von 5 mm.
   2. Um die Handhabung zu vereinfachen und Eine Verzögerung der Nachprobe-Verarbeitung nach der Drehung zu vermeiden, führen Sie nur vier Schleifen (2 Materialien in Duplikaten) parallel aus.
   3. Um eine Schleifenform zu erzeugen, stecken Sie die offenen Endungen der Rohre in ein kurzes Stück Siliziumrohr, das den Außendurchmesser des Untersuchungsrohres anpasst.
   4. Verwenden Sie die Polycarbonat-Spannungsbänder, um das ordnungsgemäße Schließen der Schleifen zu gewährleisten. Wenn Sie zum ersten Mal verwendet werden, passen Sie die Länge der Bänder an den Außendurchmesser der Schlaufe an, indem Sie das Spannband mit einer Schere in erforderlichen Längen schneiden und mit einem Drehmomentschlüssel von 3 mm sichern.
   5. Ziehen Sie die Verriegelungsschraube des Spannbandverbinders bei der Inspektion der Rohrenden vorsichtig fest. Stellen Sie die Schließkraft so ein, dass kein Abstand zwischen den Rohrenden verbleibt. Wenn die Verriegelungsschraube vollständig angezogen ist und die Spannung des Polycarbonatbandes zu niedrig erscheint, um den Spalt zwischen den Rohrenden zu schließen, öffnen Sie die Verriegelung des Systems und schneiden Sie einige mm des Spannbandes. Wiederholen Sie dies, bis ein genauer Schleifenverschluss erreicht ist (Abbildung 1A).
   6. Wenn das Schlauchmaterial sehr weich ist und dazu neigt, in die Spannbänder zu rutschen, fixieren Sie die Schleife mit elektrischem Klebeband am Spannband (Abbildung 1B,C).
   7. Bereiten Sie eine zusätzliche PVC-Schleife für die Temperaturregelung mit den gleichen Abmessungen wie die Testschleifen vor.
   8. Sichern Sie die Schleifen in der Schleifenwiege der Rotationseinheit außerhalb des Wasserbades. Danach befestigen Sie die Schlaufenwiege an der Rotationseinheit im Wasserbad (Abbildung 1E).
   9. Demontieren Sie das Spannband teilweise aus den Schleifen und ziehen Sie ein Ende jedes Rohres ab, um die Schleife zu öffnen.
   10. Jede Schleife vorsichtig mit 5 ml Blut mit einer 5 ml serologischen Pipette füllen. Mischen Sie Blut sanft zweimal in der Glasbecher durch langsampipettieren auf und ab vor dem Laden in die Schlaufen.
   11. Nehmen Sie das Einweg-Thermometer und legen Sie es in die Temperaturregelschleife. Wenn das Thermometer zu groß ist, schneiden Sie es mit einer Schere, um kleinere Rohre zu passen. Füllen Sie die Schleife mit 5 ml entionisiertem Wasser bei Raumtemperatur.
   12. Schließen Sie die Schlaufen und stellen Sie sicher, ob die Schlaufen, die Spannbänder und das Rack richtig montiert sind.
   13. Stellen Sie die Drehzahl auf 30 Runden pro Minute (Rpm) ein und drehen Sie sie um 3 h.
3. Schleifenbaugruppe zum Testen der Auswirkungen unsachgemäßer Schleifenverschlüsse (Lücke)
   1. Bereiten Sie vier Schleifen (PolyPVC) vor, wie in 2.2 beschrieben.
   2. Schließen Sie zwei der Schleifen ordnungsgemäß mit den Spannbändern und vermeiden Sie einen Abstand zwischen den Rohrenden.
   3. Für die anderen beiden Schleifen stecken die offenen Enden in das größere Rohr, wie in 2.2.3 beschrieben, aber lassen Sie einen Abstand von 1-2 mm zwischen den Schleifenenden. Verwenden Sie die Spannbänder nicht für diese Schleifen (Abbildung 1D).
   4. Bereiten Sie eine Temperaturregelschleife vor, wie in 2.2.7 und 2.2.11 beschrieben.
   5. Füllen Sie alle Schleifen mit Blut, wie in 2.2.10 beschrieben.
   6. Stellen Sie die Drehzahl auf 30 Umdrehungen und drehen Sie sie um 3 h.
4. Schleifenbaugruppe für Stenttests
   1. Bereiten Sie vier Schleifen vor, wie in 2.2 und im Folgenden beschrieben.
      HINWEIS: Um die Blutbiokompatibilität von Stents zu bewerten, sollte das Schlauchmaterial selbst als biokompatibel getestet werden, um eine Maskierung der Zellaktivierung zu verhindern. Liegen keine Daten vor, kann das Rohrmaterial selbst wie unter 2.2 beschrieben geprüft werden. Darüber hinaus kann der Durchmesserbereich innerhalb des Stents aufgebracht werden (siehe Herstelleranleitung) und sollte dem Innendurchmesser des Rohrmaterials entsprechen.
   2. Öffnen Sie zwei der Schleifen und nehmen Sie die Röhre aus dem Zugbandsystem.
   3. Legen Sie den Stent gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Mitte des Rohres ein.
   4. Verwenden Sie die anderen beiden Schleifen ohne Stent als Steuerelement. Füllen Sie alle Schleifen mit Blut, wie in 2.2.10 beschrieben.
   5. Drehen Sie die Drehzahl auf 30 Umdrehungen und drehen Sie sie um 3 h.
5. Temperaturregelung
   1. Zu jeder Zeit während der Dauer und wenn die Rotation gestoppt wird, wird die Temperatur des Blutes in den Schleifen durch das Thermometer innerhalb der Temperaturregelschleife angezeigt. Um die Temperatur abzulesen, stoppen Sie die Drehung und lesen Sie sofort die vom Thermometer angegebene Temperatur ab.

3. Blutprobenverarbeitung

1. Nach der Drehung lassen Sie die Schleifen 2 min in einer aufwärts gerichteten Position im Rack stehen, um das Blut an der Unterseite der Schleifen ansammeln zu lassen, um ein Verschütten beim Öffnen der Schleifen zu vermeiden.
2. Untersuchen Sie das zurückgelassene Blut auf statische Zustände: Wenn dieses Blut koaguliert wird, wird letztlich eine unsachgemäße Heparinisierung vermutet. Wiederholen Sie in diesem Fall das Experiment vorzugsweise auch mit einem anderen Blutspender.
3. Nehmen Sie vorsichtig die Schlaufen aus dem Rack. Öffnen Sie die Anschlüsse und lassen Sie das Blut in einen 10 ml Glasbecher fließen.
4. Bündeln Sie das Blut aus den Röhren, die in Duplikaten ausgeführt werden.
5. Zeichnen Sie frisches Blut für die Basisanalyse von demselben Spender wie in 1.5 und 1.6 beschrieben.
6. Entnahme von Natriumcitratblut
   1. Für die Entnahme von Natriumcitratblut vier 1,5 ml-Röhrchen mit jeweils 111 L Natriumcitratlösung aus Natriumcitratröhren füllen, um eine Endkonzentration von 3,2 % Natriumcitrat zu erzeugen.
   2. Füllen Sie jede Röhre mit 1 ml Blut aus den Glasbechern, wie in 1.6 und 3.3 beschrieben.
   3. Halten Sie das Blut bei Raumtemperatur und verwenden Sie dieses Blut für FACS-Analysen, wie in 12 beschrieben.
      ANMERKUNG: Um die Länge der Schleifen für verschiedene Versuchseinstellungen zu ändern, planen Sie Aliquots ordnungsgemäß basierend auf der Menge der durchzuführenden Messungen. Es kann notwendig sein, alle erforderlichen Messungen mit frischem Blut vor den realen Experimenten zu erstellen, um sicherzustellen, dass das Blutvolumen in den Schleifen für alle Messungen ausreicht.
7. Entnahme von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Blut- und Plasmaproben.
   1. Aus jedem Glasbecher mit Blut (siehe 1.6 und 3.3) 4,5 ml Blut in eine 5 ml EDTA-Röhre geben. Füllen Sie zwei EDTA-Röhrchen aus jedem 10 ml Glasbecher mit Blut.
   2. Mischen Sie das Blut vorsichtig und halten Sie es auf Eis.
   3. Übertragen Sie 2 ml Blut in ein 2 ml Sperrzentrifugationsröhrchen und verwenden Sie dieses Blut für die Blutzellzahl und freie Hämoglobinmessung, wie in 5 beschrieben. Und 6.
   4. Zentrifugieren Sie das restliche Blut bei 3.500 x g für 20 min.
   5. Das Plasma im Überstand vorsichtig in 500 L Aliquots sammeln und sofort bei -80 °C einfrieren.

4. Rasterelektronenmikroskopie und CT-Bilder

1. Nach der Blutprobenverarbeitung die geleerten Schlaufen, wie in 2.3 beschrieben, mit jeweils 10 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) ausspülen.
2. Schneiden Sie vorsichtig eine 1 cm lange Probe von jedem Ende jedes Rohres mit einem Skalpell ab.
3. Inkubationsprobe über Nacht bei 4 °C in einer 2%igen Glutaraldehydlösung inkubieren.
   VORSICHT: Das Einatmen von Aldehyddämpfen kann Nasensymptome wie eine laufende Nasenerz-Anhaltende Verstopfung und Atemwegsreizungen verursachen, und der Kontakt mit der Haut verursacht Dermatitis. Aldehyde sollten in einer Dunstabzugshaube behandelt werden, während sie Handschuhe, ein Schutzkleid und eine Schutzbrille tragen.
4. Spülen Sie die Probe (3 mal) mit PBS.
5. Bereiten Sie eine 1%ige Lösung von Osmiumtetroxid (OsO₄) in entionisiertem Wasser vor und inkubieren Sie die Probe 15 min bei Raumtemperatur.
   VORSICHT: OsO₄ ist ein starkes Oxidationsmittel, es kann durch Lichteinwirkung reduziert werden. Um die Reduktion während der Zubereitung zu vermeiden, lagern Sie OsO₄ in einer braunen Glasflasche. OsO₄ ist extrem flüchtig, seine Dämpfe sind giftig für Augen, Nase und Rachen. Arbeiten Sie immer unter einer Dunstabzugshaube und verwenden Sie Handschuhe und schützen Sie Kleidung, um sicherzustellen, dass kein Teil des Körpers OsO₄ausgesetzt ist. Wenden Sie sich an die Richtlinien Ihrer Institution für den Umgang mit abfallentsorgung und -lagerung. Im Allgemeinen ist OsO₄ für mehrere Monate lagerfähig, aber es braucht spezielle Glasflaschen mit Teflon-Liner und einem Trockenhaus, da OsO₄ innenliegende Oberflächen und Denkinhalt des Kühlschranks in Gegenwart von undichten Dämpfen verfärben kann.
6. Proben herausnehmen, in neue 15 ml Zentrifugenrohre übertragen und Proben 3 Mal mit PBS ausspülen.
7. Bereiten Sie eine Reihe von Ethanol mit unterschiedlichen Konzentrationen (25%, 50%, 75%, 95%, 100%)
8. Proben in Ethanol dehydrieren: in 25%, 50%, 75% und 90 min und 30 min in 100% inkubieren.
9. Nehmen Sie Proben aus 100% Ethanol und lassen Sie es über Nacht bei Raumtemperatur trocknen.
10. Untersuchen Sie Proben im Rasterelektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 5 kV und mit dem Röntgen-CT-Scanner.

5. Blutzellzahl

1. Nehmen Sie 2 ml des EDTA-Blutes gemäß 3.7.3
2. Setzen Sie das Rohr in den automatisierten Hämatologieanalysator ein und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.

6. Messung des freien Hämoglobins (fHb) im Plasma

1. Eine Plasmaprobe aus jeder unter 3.7.5 beschriebenen Bedingung auftauen. Nach dem Auftauen auf Eis aufbewahren.
   HINWEIS: Tauen Sie gefrorene Plasmaproben in einem Wasserbad immer bei 37 °C und übertragen Sie sofort auf Eis, das etwas Wasser enthält, um die Temperatur zu senken. Dies ist wichtig, um die Aktivierung der Blutbestandteile beim Auftauen zu vermeiden.
2. Verwenden Sie das fHb-Reagenz und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Kontamination nach dem Öffnen vermeiden und das Reagenz vor direktem Licht (Sonne, UV-Licht) schützen.
3. Verwenden Sie ein Pipettierschema (siehe Herstelleranleitung) mit 1:5 Verdünnung.
4. 1000 l des Hämoglobinreagenzes in eine 1,6 ml Halbmikroküvette geben. Verwenden Sie diese Küvette, um den leeren Wert zu bestimmen.
5. Fügen Sie 1000 l des Hämoglobin-Reagenzes und 250 l der Plasmaprobe in eine andere Semi-Mikro-Küvette ein.
6. Mischen Sie den Inhalt in beiden Küvetten, indem Sie die Pipette gründlich spülen, indem Sie sie wiederholt mit Reaktionsgemisch füllen, und mindestens 3 min bei Raumtemperatur inkubieren.
7. Bestimmen Sie das Aussterben (E) der Probe gegen fHb-Reagenz als leeres Reagenz. Berechnen Sie die fHb-Konzentration (mmol/l) der Probe: E₅₄₀-E₆₈₀ x 0.452.

7. Messung des FPA

1. Eine Plasmaprobe aus jeder unter 3.7.5 beschriebenen Bedingung auftauen und nach dem Auftauen auf Eis lagern.
2. Verwenden Sie das FPA Elisa Kit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.

8. Messung von sC5b9

1. Eine Plasmaprobe aus jeder unter 3.7.5 beschriebenen Bedingung auftauen und nach dem Auftauen auf Eis lagern.
2. Verwenden Sie das sC5b-9 ELISA-Kit und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.

9. Messung von PMN

1. Eine Plasmaprobe aus jeder unter 3.7.5 beschriebenen Bedingung auftauen und nach dem Auftauen auf Eis lagern.
2. Verwenden Sie das PMN-Elastase ELISA Kit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.

10. Messung von TNF

1. Mikroplatten müssen einen Tag vor dem Ausführen des ELISA beschichtet werden. Zur Beschichtung alle Bohrungen mit einer Capture-Antikörperlösung von 100 l aufnehmen, versiegeln und über Nacht bei 2 °C-8 °C inkubieren.
2. Eine Plasmaprobe aus jeder unter 3.7.5 beschriebenen Bedingung auftauen. Nach dem Auftauen auf Eis aufbewahren.
3. Verwenden Sie das TNF ELISA-Kit und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.

11. Messung von IL-6

1. Mikroplatten müssen einen Tag vor dem Experiment mit Aufnahmeantikörpern beschichtet werden. Zur Beschichtung 100 l Aufnahme-Antikörperlösung in alle Mitbohrungen der Mikroplatte geben, die mit dem Set, der Dichtungsplatte versehen und über Nacht bei 4 °C inkubiert werden.
2. Tauen Sie eine Plasmaprobe aus jeder Bedingung erhalten, wie in 3.7.5 beschrieben. und nach dem Auftauen auf Eis aufbewahren.
3. Verwenden Sie das IL-6 ELISA-Kit und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.

12. FACS-Analysen

1. Bereiten Sie 500 ml FACS-Puffer vor, indem Sie 10 ml fetales Kalbsserum und 2 ml EDTA-Lösung (0,5 M) zu 488 ml 1x PBS hinzufügen. Der FACS-Puffer kann 4 Wochen bei 4°C gelagert werden.
2. Verwenden Sie für jedes Färbungsverfahren 100 l des Natriumcitratbluts (siehe 3.6.3) (Monozytenthromboletaggregate (MPA), Thrombozytenaktivierung (PA), Leukozytenintegrine (LI)).
3. Pipette 100 l Blut aus jeder Probe in ein 5 ml FACS-Rohr. Aus jeder Probe 3 Tuben für die Antikörperfärbung und Etikettierung mit MPA (Monozytenthrombolet-Aggregate) Panel, PA (Thrombozytenaggregate) Panel und LI (Leukozyten-Integrin) Panel vorbereiten.
4. Mischen Sie den Rest der 4 Proben in einem 5 ml FACS-Rohr. Verwenden Sie diese Mischung für ungefärbte und Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen.
5. Bereiten Sie 6 FACS-Röhrchen vor, indem Sie 100 l des gemischten Probenbluts in jede Röhre einleiten. Etikettieren Sie 3 Röhren als ungefärbt und 3 Röhren wie FMO-CD41, FMO-CD62P und FMO-CD162.
6. Fügen Sie 100 l 4% Paraformaldehydlösung hinzu und brüten sie 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
   VORSICHT: Paraformaldehyd ist giftig für Haut und Augen. Es kann schwere Lungenreizungen beim Einatmen verursachen und kann nach längerer Exposition zu Lungenschäden führen. Darüber hinaus wird es als krebserregend und als Fortpflanzungsgift eingestuft. Tragen Sie immer Handschuhe und Schutzbrille nen und arbeiten Sie unter der Dunstabzugshaube.
7. Fügen Sie 1 ml Waschpuffer in jedes Rohr und Zentrifuge bei 287 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschschritt zweimal.
8. Bei roter Blutkörperchen (RBC)-Lyse 1 ml 1x Puffer RBC-Lysepuffer (verdünnt 10x RBC-Lysepuffer in entionisiertem Wasser), durch langsames Pipetieren nach oben und unten mischen und 5 min bei RT im Dunkeln brüten.
9. Bereiten Sie Kompensationsperlen für einzelne Flecken vor. Zu 1 ml FACS Puffer fügen Sie 4 Tropfen von jeder positiven und negativen Perlen. Vortex gründlich und fügen Sie 100 L Perlen Lösung zu einem 5 ml FACS Rohr.
10. Bereiten Sie 4 Tuben mit Perlen und Etikett als CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC und CD62P-PE vor. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer in jedes Rohr und zentrifugieren bei 287 x g für 5 min. Überstand entsorgen und auf Eis halten.
11. Nach rBC Lyse 1 ml FACS-Puffer zu jedem Rohr hinzufügen und waschen, wie in 12.7 beschrieben. Entsorgen Sie Überstand.
12. Antikörpercocktails zubereiten:
    1. MPA-Panel: Fügen Sie 4 L CD45-APC, 4 l CD14-FITC und 4 l CD41-BV421 bis 388 L FACS-Puffer hinzu.
    2. PA-Panel: Fügen Sie 1,6 l CD41-BV421 und 12 l CD62P-PE zu 386,4 l FACS-Puffer hinzu.
    3. LI-Panel: Fügen Sie 4 L CD45-APC und 8 l CD162-BV421 bis 388 L FACS-Puffer hinzu. Auf Eis bleiben.
13. Vorbereiten einzelner Flecken: Fügen Sie für CD14-FITC, CD41-BV421 und CD45-APC jeweils 0,5 l bis 499,5 L FACS-Puffer hinzu. Für CD62P-PE fügen Sie 0,3 l zu 499,7 L FACS-Puffer hinzu. Auf Eis bleiben.
14. FMO-Steuerungen vorbereiten: (i) MPA-Panel (FMO-CD41): Fügen Sie dem 98-L-FACS-Puffer einen CD14-FITC-Antikörper und 1 L CD45-APC-Antikörper hinzu. ii) PA-Panel (FMO-CD62P): Fügen Sie 0,4 l CD41-BV421 bis 99,6 L DES FACS-Puffers hinzu. iii) LI-Panel (FMO-CD162): Fügen Sie 1 L CD45-APC zu 99 L FACS-Puffer hinzu. Halten Sie die FMO-Kontrollen auf Eis.
15. Vortex-Antikörper-Cocktails und fügen Sie 100 l jedes Antikörpercocktails, wie in 12.12 zubereitet, zu jeder der jeweiligen beschrifteten Röhren (MPA-, PA- und LI-Panel) wie in 12.3 beschrieben und mischen Sie sanft durch Pipettieren nach oben und unten. Halten Sie auf RT im Dunkeln.
16. Vortex Einzelfleck-Antikörperverdünnungen und fügen Sie 100 l der einzelnen Flecken-Antikörper-Verdünnungen, wie in 12.13 vorbereitet. zu jedem der jeweiligen beschrifteten Rohre mit Perlen wie in 12.7 beschrieben und sanft durch Pipettieren nach oben und unten mischen. Halten Sie auf RT im Dunkeln.
17. Vortex FMO Antikörper-Cocktails und fügen Sie 100 l von jedem FMO-1-Antikörper-Cocktail, wie in 12.14 zubereitet. für die jeweiligen beschrifteten Rohre (FMO-Kontrollen) wie in 12.5 beschrieben. und mischen Sie sanft durch Pipettieren nach oben und unten. Halten Sie bei RT im Dunkeln.
18. Inkubieren Sie alle Tuben mit Antikörperfärbung für 30 min bei RT im Dunkeln.
19. Nehmen Sie die drei Rohre zur unbefleckten Kontrolle (siehe 12.4) und setzen Sie pellet in 250 l FACS-Puffer wieder auf. Auf Eis bleiben.
20. Waschen Sie nach der Inkubationszeit alle Rohre außer ungefärbten Steuerungen einmalig mit FACS-Puffer, wie in 12.7 beschrieben. Resuspend Pellet in 250 L FACS Puffer und erfassen Daten über das Durchflusszytometer.
21. Verwenden Sie ungefärbte Zellen für negative Einstellungen und Kompensationsmausperlen für positive Einstellungen in der FACS-Software. Verwenden Sie außerdem FMO, um die Gating-Strategie zu steuern, wobei FMO-CD41 im MPA-Panel verwendet wird, FMO-CD62P im PA-Panel und FMO-CD162 im LI-Panel verwendet wird.
22. Erwerben Sie fast 0,5 x 10⁶ - 0,25 x 10⁶ Ereignisse pro Tube für FACS. Speichern Sie Daten und analysieren Sie mit einer Analysesoftware (Version 9.9.6).

Alle dargestellten Daten, mit Ausnahme von FACS-Plots, wurden mit einer Statistiksoftware analysiert. Die FACS-Plots wurden mit der Durchflusszytometrie-Software analysiert.

Die Analyse der Blutkörperchenzahl zeigte keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf Erythrozyten zwischen allen getesteten Bedingungen (Abbildung 2). Aber, Thrombozyten und Leukozyten wurden drastisch in der Latex-Gruppe reduziert, was auf eine sehr schlechte Biokompatibilität von Latex. Dies wird durch erhöhte Konzentrationen von freiem Hämoglobin in der Latexgruppe noch verstärkt, was darauf hindeutet, dass außer der Latexgruppe keines der anderen Gefäßgeräte oder -bedingungen zu einer umfangreichen Hämolyse führte (Abbildung 2). Darüber hinaus führten die beschichteten PVC-Rohre, PolyPVC und HepPVC sowie der getestete Stent nicht zu Thrombose mittels Thrombozyten- und Leukozytenverlust, während Latex den höchsten Thrombozyten- und Leukozytenverlust aufwies, gefolgt von unbeschichteten PVC-Rohren, die einen abgenommenen Trend aufwiesen.

Während alle getesteten Gefäßgeräte zu einer erhöhten Aktivierung des Gerinnungssystems (FPA) und der Komplementkomponente (sC5b-9) führten, zeigten die HepPVC-Schleifen einen Trend zu einem Rückgang der FPA- und sC5b-9-Werte im Vergleich speziell zu PolyPVC-Schleifen (Abbildung 3). Interessanterweise zeigten unbeschichtete PVC- und Gap-Schleifen niedrigere FPA-Werte im Vergleich zu PolyPVC, erreichten jedoch nicht das Niveau der statistischen Signifikanz. Dennoch wiesen Latexschleifen im Vergleich zu Ausgangs- und statischen Bedingungen deutlich erhöhte FPA-Werte auf.

In Übereinstimmung mit den Blutkörperchen der Vollblutzellen wiesen Latexschleifen die höchsten Konzentrationen von TNF, IL-6 und PMN-Elastase auf (Abbildung 4), und erreichten im Vergleich zu den übrigen Gruppen im Vergleich zu TNF und IL-6 (Abbildung 4A,B) die höchsten Werte, während die statischen und basisgemäßen Bedingungen in Bezug auf DIE PMN-Elastase (Abbildung 4C) erreichten. Diese Ergebnisse deuten auf die starke Aktivierung von Leukozyten durch Latex hin. Die Ausgangswerte der Aktivierungsmarker waren immer mit statischen Bedingungen vergleichbar, was auf eine richtige Heparinisierung des Blutes hindeutet.

Interessanterweise wurde gezeigt, dass die Thrombozyten- und Leukozytenzahl für lückeninduzierte Schleifen bei mäßiger Aktivierung des Koagulatoriumssystems (FPA) und der Leukozyten (PMN-Elastase) nur geringfügig reduziert wurde, obwohl unsachgemäßer Schleifenverschluss mit resultierenden Strömungsturbulenzen und Blutkontakt zur unbeschichteten, rauen Schnittfläche zu makroskopisch sichtbaren Gerinnungen am Spleiß führte (Abbildung 1F). Die Gerinnsel und ihre Verteilung über die gesamte Spleißfläche waren mit den Bildern von 'CT' und SEM offensichtlich, während kein Gerinnsel gefunden wurde, wenn die Schleifen geschlossen wurden, wobei die externe Schließvorrichtung keine Lücke zwischen den Schleifenenden hinterließ(Abbildung 5).

Die zytometrische Analyse von Wirtsblutzellen, die mit Thrombozyten-spezifischen Markern, CD41 und Thrombozytenaktivierungsmarker CD62P gefärbt wurden, sind in Abbildung 6A,Bdargestellt. Hier zeigten die Latexröhren eine extrem hohe mediane Fluoreszenzintensität (MFI) für CD62P auf Blutplättchen, gefolgt von Stent, während Heparin-beschichtete PolyPVC-Röhren eine minimale Aktivierung von Thrombozyten zeigten, die die antithrombogene Eigenschaft von PolyPVC-Röhren darstellten. Darüber hinaus wurden Leukozyten auf der Grundlage der CD45- und SSC-basierten Granularität (Side Scatter) in (i) Granulozyten eingeteilt; ii) Monozyten und iii) Lymphozyten (Abbildung 7), und die Expression von CD162+ Integrin wurde bei jeder Subpopulation von Leukozyten nachgewiesen, von denen bekannt ist, dass sie mit dem CD62P auf den Thrombozyten interagieren24. Es wurde festgestellt, dass die Integrin-Ausdrücke auf Granulozyten und Lymphozyten in Latexschleifen drastisch reduziert wurden. Dieses Ergebnis entsprach den abgesenkten Gesamtfrequenzen von Leukozyten in den Latexschleifen (Abbildung 2). Im Allgemeinen waren die Integrinspiegel bei Monozyten höher als bei Granulozyten und Lymphozyten, was auf die Wahrscheinlichkeit der Monozyten-Wechselwirkung mit aktivierten Thrombozyten hindeutet. In diesem Zusammenhang wurden Monozytenplättchenaggregate auch durch Färbung der Blutzellen mit CD14 (als Monozytenmarker) und CD41 (als Thrombozytenmarker) bewertet und letztlich doppelpositive Zellen identifiziert, d.h. CD14+CD41+MPA (Abbildung 8). Hier stellten wir fest, dass die Stentgruppe die höchsten Konzentrationen von CD41-Expression auf dem MPA aufwies, gefolgt von der Latexgruppe, was auf eine erhöhte Tendenz zur Bildung von MPA hindeutet, trotz der reduzierten Häufigkeit von Monozyten (<1 %) in den Latexschleifen.

Abbildung 1: Übersicht über das in vitro hämodynamische Schleifenmodell und seine Änderungen. (A) Schleife für das Lückenexperiment mit externem Schleifenschließsystem, sodass keine Lücke am Spleiß eingplatzt. (B) Schleife aus polyPVC beschichtetem PVC-Rohr und Stent innen (Pfeil). (C) Schleife aus Latexrohr. (D) Schleife für das Lückenexperiment ohne das externe Schleifenschließsystem, das eine Lücke zwischen den Rohrenden (Pfeil) hinterlässt. (E) Schleifen in der Schlaufe Wiege im Wasserbad platziert und mit Blut gefüllt. (F) Thrombus, der nach der Drehung zu einem Spalt am Spleiß (Pfeil) führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Ergebnisse für blutzellige Anzahl und Plasmahämoglobin. (A) Erythrozyten zählen. (B) Thrombozyten zählen. (F) Leukozyten zählen. (D) Freies Plasmahämoglobin. Die Ergebnisse deuten auf die schlechte Biokompatibilität von Latex hin, was zu einer übermäßigen Hämolyse führt. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt. Fehlerbalken zeigen SEM. n=1 an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Ergebnisse für die Aktivierung des Gerinnungs- und Ergänzungssystems. (A) Aktivierung des Koagulationssystems, gemessen anhand von Fibrinopeptid A (FPA) (B) Komplementsystemaktivierung, gemessen anhand von SC5b-9-Werten. Während Latexröhren signifikante erhöhte Konzentrationen des FPA hervorriefen, war die Komplementaktivierung für alle getesteten Materialien stark. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt, Fehlerbalken geben SEM an. *p<0.05, n=1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Leukozyten-Aktivierungsmarker. (A) Tumornekrosefaktor alpha (TNF). (B) Interleukin 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. Die Ergebnisse deuten auf eine erhöhte Aktivierung von Leukozyten aufgrund erhöhter Konzentrationen der analysierten Marker hin, gefolgt von Stentschleifen, die nur zu erhöhten Konzentrationen für PMN-Elastase führten, aber nicht tNF oder IL-6. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt, Fehlerbalken geben SEM an. *p<0.5; **p<0.01, n=1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Abbildung des Spleißes der Schleifen. (A) μ-Computer-Tomographie (CT) von Schleifen mit unsachgemäßem Schließen (Lücke). Die roten Bereiche weisen auf Thrombusmaterial hin. (B) Rendering der Luminalseite des Rohres. Die rechteckige Auswahl gibt den Bereich für die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) an (C). (D) CT von Schleifen mit externer Schleifenverschlussvorrichtung und ohne Spalt am Spleiß, und (E) Rendering und Ansicht der Luminaloberfläche. Es wurde kein Thrombusmaterial gefunden. (F) SEM-Bild der rechteckigen Auswahl in (E). Auf der Schnittfläche wurde kein Thrombusmaterial gefunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: FACS-Plot zur Thrombozytenaktivierung (CD62P). (A) Repräsentatives FACS-Diagramm (Grundzustand) mit der Blut-CD41+ Blutplättchen. (B) Grafik, die den Thrombozytenaktivierungsstatus zeigt, der durch die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der verschiedenen Arten von Gefäßgeräten im Vergleich zu den statischen RT- und Ausgangsbedingungen reflektiert wird. Die Datenbalken stellen Daten aus einzelnen Messungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: FACS-Plot für Leukozytenintegrin (CD162). (A) Repräsentatives FACS-Diagramm (Grundbedingung) zeigt die Blut-CD45+ Leukozyten und Untergruppen (B) Schaubild zeigt die Leukozyten-CD162+ Integrin-Mittelfluoreszenzintensität (MFI) der verschiedenen Arten von Gefäßgeräten im Vergleich zu den statischen und Basisbedingungen. Die Datenbalken stellen Daten aus einzelnen Messungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: FACS-Plot für Thrombozytenmonozytenaggregate (CD41/CD14). (A) Repräsentatives FACS-Diagramm (Grundbedingung) zeigt die Gating für Blutmonozyten (CD45+/CD14+), Thrombozyten (CD41+) und Monozytenplättchenaggregate (CD41+/CD14+) (B) Schaubild, das die CD41+ mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) auf Monozytenthromboletaggregaten für die verschiedenen Gefäßgeräte im Vergleich zu den statischen und Ausgangsbedingungen zeigt. Die Datenbalken stellen Daten aus einzelnen Messungen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Der Geldgeber [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Deutschland] unterstützte den Autor dieses Manuskripts [Max Wacker] finanziell in Form von Verbrauchsmaterialien und Publikationsgebühren. Die Geldgeber spielten keine zusätzliche Rolle bei der Erstellung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.