Methodenartikel

Quantifizierung der zirkulierenden schweinespezifischen DNA im Blut eines Xenotransplantationsmodells

DOI:

10.3791/61579

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22. September 2020

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1Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Institute of Translational Medicine, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Xianning Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Liver-biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd., 4Department of Radiology, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 5Department of Life Sciences, University of Toronto, 6Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, Nanjing Medical University, 7Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt. Anhand artspezifischer Primer wurde cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen quantifiziert.

Zusammenfassung

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Xenotransplantation ist eine praktikable Methode zur Behandlung von Organversagen. Jedoch, wie die Immunabstoßung von Xenotransplantation effektiv zu überwachen ist ein Problem für Ärzte und Forscher. Dieses Manuskript beschreibt eine einfache und effektive Methode zur Überwachung der Immunabstoßung in Schweine-zu-Maus-Zelltransplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen. Zirkulierende DNA ist ein potenziell nicht-invasiver Biomarker für Organschäden. In dieser Studie wurde zirkulierende schweinespezifische DNA (cpsDNA) während der Xenograft-Abstoßung durch quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) überwacht. In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt. Artspezifische Primer wurden dann verwendet, um cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen zu quantifizieren. Der Wert dieser Methode legt nahe, dass es als eine einfache, bequeme, kostengünstige und weniger invasive Methode verwendet werden kann, um die Immunabstoßung von Xenotransplantation zu überwachen.

Einleitung

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Organversagen ist eine der Haupttodesursachen1. Transplantation von Zellen, Geweben und Organen ist ein effektiver Weg, um Organversagen zu behandeln2. Dennoch schränkt der Mangel an Spenderorganen die klinische Anwendung dieser Methodeein 3,4. Studien haben gezeigt, dass Schweine als potenzielle Quelle menschlicher Organe für die klinische Transplantation verwendet werden können5,6. Die artenübergreifende Organtransplantation ist jedoch mit einer gefährlichen Immunabstoßung konfrontiert. Daher ist es wic....

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Protokoll

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Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften des Institutional Review Board des Shenzhen Second People es Hospital, First Affiliated Hospital der Shenzhen University durchgeführt.

1. Entwerfen Sie porcine spezifische Primer

  1. Führen Sie eine Vollgenom-BLAST-Analyse durch, um porenspezifische Gene zu identifizieren, die sich von denen von Menschen, Affen oder Mäusen unterschieden, mit der Software NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
  2. Designprimer nach 19 schweinespezifischen Genen (Tabelle 1) mit der Software von Primer 5.

2. Isolierun....

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Ergebnisse

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In diesem Protokoll wurden schweinespezifische Primer entwickelt, Plasmiden enthaltende Porenspezifische DNA-Fragmente konstruiert und Standardkurven für die Quantifizierung festgelegt (Abbildung 4). Die Spezifitäten der 19 Primer wurden von PCR bestätigt. Artspezifische Primer (Primer #4 und Primer #11) wurden dann verwendet, um cpsDNA durch qPCR in Schweine-zu-Maus-Zell-Transplantationsmodellen und Schweine-zu-Affen-Arterien-Patch-Transplantationsmodellen zu quantifizieren.

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Diskussion

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Die Quantifizierung der zirkulierenden Poren-DNA stellt einen praktikablen Ansatz zur Überwachung der Immunabstoßung von Xenotransplantationen dar. Gadi et al.24 fanden heraus, dass der von Spendern abgeleitete zirkulierende DNA-Gehalt (ddcfDNA) im Blut von Patienten mit akuter Abstoßung signifikant höher war als der von Patienten ohne Abstoßung. Diese Studien deuten darauf hin, dass ddcfDNA ein häufiger Biomarker für die Überwachung von Organtransplantatschäden sein kann. In den letzten Jahren wu.......

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Offenlegungen

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Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Key R&D Program of China (2017YFC1103704), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCYJ20170817172116272), Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong unterstützt. Provinz (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medical Discipline Construction of Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseBiowest, Barcelona, Spanien111860
BamHI-HFNew England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USAR3136S
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenAxygen  Biosciences, Union City, CA, USAMCT-150-C
0,2 mL PCR-RöhrchenAxygen  Biowissenschaften, Union City, CA, USAPCR-02-C
C57BL / 6Mäuse Medical Animal Center der Provinz Guangdong,   China8 ~ 10 Wochen
ZentrifugeThermo  Fischer  Scientific, Waltham, MA, USAMicro 21R 2-Log
DNA LadderNew England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USAN3200S0.1– 10.0 kb
Markierung I Tiangen, Peking, ChinaMD101-020.1– 0,6 kb
DNA-Mini-Säule (HiBind DNA-Mini-Säulen)Omega Bio-tek, Norcross, GA, USADNACOL-01
DNA-LadepufferSolarbio, Peking, ChinaD1010
E.Z.N.A.Plasmid DNA Mini Kit I und E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IIOmega Bio-tek, Norcross, GA, USAD6942
D6943
EcoR ITakara  Biografie, Shiga, Japan  1040S Weibliche
Bama MinischweineBGI Ark Biotechnology, Shenzhen, China2 ~ 4 Monate
Genomisches DNA-Extraktionskit?Tiangen, Peking, ChinaDP304-02
SYBR Green Realtime PCR Master MixToyobo, Osaka, JapanQPK-201
Gel Doc XRBio-Rad, Hercules, USA
Männliche Cynomolgus-AffenGuangdong Landau Biotechnologie, Guangzhou, China8 Jahre
Nukleinsäure-Farbstoff (Gelred)Biotium, Fremont, USA42003
Polymerase (Premix Taq)Takara  Bio, Shiga, JapanRR901A
pMD19-T PlasmidTakara   Bio, Shiga, JapanD102A
qPCR-MaschineApplied Biosystems QSDx, Waltham, USA
Serum/zirkulierendes DNA-ExtraktionskitTiangen, Peking, ChinaDP339
TAEsangon Biotech, Shanghai, ChinaB548101

Referenzen

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  1. Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
  2. Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2....

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Schlagwörter

Zirkulierende DNAqPCR QuantifizierungBlutprobenverarbeitungAgarose GelelektrophoreseErstellung einer Standardkurvespeziesspezifische Primerberwachung der immunologischen Absto ungDNA Extraktionskit

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