Summary
Ce protocole décrit l’utilisation de nanofils de silicium pour la biomodulation optique intracellulaire des cellules dans une méthode simple et facile à exécuter. La technique est très adaptable à divers types de cellules et peut être utilisée pour des applications in vitro ainsi que in vivo.
Abstract
Les myofibroblastes peuvent intérioriser spontanément les nanofils de silicium (SiNWs), ce qui en fait une cible attrayante pour les applications bioélectroniques. Ces hybrides cellule-silicium offrent des capacités de modulation optique sans plomb avec une perturbation minimale du comportement cellulaire normal. Les capacités optiques sont obtenues par les propriétés photothermales et photoélectriques des SiNWs. Ces hybrides peuvent être récoltés à l’aide de techniques standard de culture tissulaire, puis appliqués à différents scénarios biologiques. Nous démontrons ici comment ces hybrides peuvent être utilisés pour étudier le couplage électrique des cellules cardiaques et comparer la façon dont les myofibroblastes se couplent les uns aux autres ou aux cardiomyocytes. Ce processus peut être accompli sans équipement spécial au-delà d’un microscope fluorescent avec ligne laser couplée. L’utilisation d’une routine MATLAB sur mesure qui permet la quantification de la propagation du calcium à l’intérieur et entre les différentes cellules de la culture est également démontrée. Les myofibroblastes ont une réponse électrique plus lente que celle des cardiomyocytes. En outre, la propagation intercellulaire myofibroblaste montre des vitesses légèrement plus lentes, bien que comparables à leurs vitesses intracellulaires, suggérant la propagation passive par des jonctions d’écart ou des nanotubes. Cette technique est très adaptable et peut être facilement appliquée à d’autres arènes cellulaires, pour les investigations in vitro ainsi que in vivo ou ex vivo.
Introduction
Tous les organismes biologiques utilisent l’électricité, sous forme d’ions, pour réguler le comportement cellulaire. Les membranes cellulaires contiennent divers types de canaux iions spécifiques permettant le transport passif et actif des ions. Ces ions régissent les fonctions des cellules excitables, telles que l’activité neuronale et la contractilité des muscles squelettiques et cardiaques. Cependant, la bioélectricité joue également un rôle important dans les cellules non excitables, régissant de nombreuses fonctions cellulaires telles que la proliférationcellulaire 1,la neuroimmunité2,3,4, et la différenciation des cellules souches5.
Au cours des dernières décennies, le domaine de la bioélectricité a suscité un intérêt croissant, ce qui a contribué au développement de nombreuses technologies pour les interfaces bioélectroniques. Pipettes patch microélecrode sont l’étalon-or de l’enregistrement intracellulaire et la stimulation6. Dans cette méthodologie, une pipette en verre est tirée dans des conditions spécifiques pour former un bord tranchant avec une taille de pore de quelques microns. Cette pipette est remplie d’un tampon et la pipette permet le contact direct du tampon avec le volume intracellulaire. Il en résulte une interface bioélectrique qui donne des rapports signal/bruit extrêmement élevés, un contrôle précis de l’activité électrique cellulaire et une résolution temporelle extrêmement élevée. Bien que cette méthodologie soit un outil extrêmement puissant, qui a récemment été mis à l’échelle à une configuration nano-pipette7, il est associé à plusieurs limitations techniques importantes. L’effet de dilution cytosol8, ainsi que les vibrations mécaniques, limite son utilité aux interrogatoires à court terme, et il nécessite un équipement spécialisé coûteux et un haut niveau de compétence technique. En outre, son encombrante limite le nombre de cellules qui peuvent être enregistrées ou stimulées simultanément, et en raison de son invasivité, il ne peut pas être reconfiguré tout au long d’une expérience. Pour surmonter ces limitations, des réseaux de microélecrodes ont été développés, mais la taille des électrodes limite la résolution spatiale ainsi que l’accès intracellulaire. Les tableaux nanoélecrodes permettent l’enregistrement et la stimulation intracellulaires mais nécessitent une électroporation abrasive pour accéder au cytosol9,10. En outre, toutes ces méthodologies sont liées au substrat et sont donc limitées aux cultures cellulaires in vitro, ou aux cellules superficielles externes, sans accès aux cellules qui se trouvent à l’intérieur d’un tissu tridimensionnel (3D).
Optogenetics11 est largement utilisé pour répondre à ces limitations 3D et in vivo. Cependant, les méthodes optogénétiques sont basées sur les perturbations des canaux iion de membrane plasmatique activés par la lumière qui sont distribués à la membrane plasmatique, limitant la résolution spatiale 3D12 et les capacités intracellulaires.
Nous avons récemment montré que les nanofils de silicium (SiNWs) peuvent être utilisés pour effectuer un interrogatoire bioélectrique intracellulaire avec résolution spatiale submicron avec différentes cellules non excitables, à savoir les myofibroblastes cardiaques et les oligodendrocytes13. En outre, nous avons employé ces SiNWs pour exécuter l’interrogation spécifique de cellules ex vivo dans un tissu cardiaque 3D, pour étudier comment les cellules cardiaques couplent électriquement in vivo14. Un avantage majeur de cette méthodologie est sa simplicité; il ne nécessite aucune modification génétique ou instrumentation volumineux. De nombreuses cellules intériorisent spontanément les SiNWs photo-sensibles sans avoir besoin de sonication ou d’électroporation15. En outre, ils échapperont spontanément à l’encapsulation endosomale et formeront une intégration transparente avec le cytosol et les organites intracellulaires13,15. Ces composites cell-SiNWs, appelés hybrides cellule-silicium, possèdent la nature dynamique, douce et polyvalente de la cellule d’origine, ainsi que les capacités optoélectriques des SiNWs. Après hybridation, l’hybride cellule-SiNW peut être récolté à l’aide de techniques standard de culture tissulaire et utilisé pour diverses applications telles que la stimulation bioélectrique intracellulaire; étudier le couplage bioélectrique intercellulaire in vitro; et pour un interrogatoire spécifique à la cellule in vivo. Comme une stimulation efficace nécessite la co-localisation de densités de puissance optique élevée et sinws, on peut atteindre une haute résolution spatiale à la fois en 2D et 3D. Dans ce protocole, nous décrivons en détail la méthodologie, ainsi que la façon dont les résultats peuvent être analysés. L’accent est mis sur l’enquête intra- et intercellulaire in vitro, mais la mise en œuvre in vivo de cette méthodologie peut être directement utilisée pour de nombreux autres scénarios biologiques.
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Protocol
Afin d’assurer le respect des normes éthiques, toutes les procédures animales liées à l’isolement des cardiomyocytes provenant du cœur des rongeurs ont d’abord été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Chicago (IACUC). En outre, toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux conseils de l’IACUC de l’Université de Chicago.
1. Préparation d’hybrides cell-SiNWs
- Isoler les cardiomyocytes primaires (MC) à l’aide d’un kit commercial suivant les directives du fabricant.
- Préparer le DMEM complet pour l’isolement des cellules primaires complété par 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, 1 % de pénicilline-streptomycine et 1 % de L-glutamine.
- Pour isoler le myofibroblaste (MF) de la suspension MFs-CMs, pré plaquez les cellules isolées sur un plat de culture tissulaire (cellules isolées de 2 cœurs à partir de l’étape 1.1. par plat de 100 mm) pendant 1 h. Comme les MC ont besoin d’une surface traitée à la fibronectine ou au collagène pour adhérer, seules les MF s’attacheront à la surface de la culture tissulaire.
- Aspirez la suspension cellulaire enrichie des MC. Ces MC peuvent être utilisés pour des expériences hétérocellulaires de couplage décrites dans la section 3. Rincez les MF avec DMEM pour éliminer les MC restants du plat MFs.
- Ajouter du milieu de culture frais aux MF et leur permettre de proliférer jusqu’à ce qu’ils soient ~80% confluents (2-4 jours). Changez le médium tous les deux jours.
- Lorsque les cellules sont prêtes (80% de confluent), préparez les SiNW à l’étape d’hybridation ci-dessous (étape 1.7).
REMARQUE : De nombreux types de SiNWs peuvent être utilisés pour cela. Dans cette expérience, les SiNWs qui ont été cultivés par dépôt chimique de vapeur (CVD) avec une configuration de jonction p-i-n de coquille centrale ont été utilisés comme décritprécédemment 16. Pendant la croissance des MCV, les SiNWs sont cultivés sur un substrat de gaufrettes de silicium, et sont finalement conservés sous forme de copeaux de silicium recouverts de SiNWs. - Couper une puce de 3 mm x 3 mm à partir d’une gaufrette avec des SiNWs cultivés en MCV à l’aide d’un scribe de diamants. Utilisez des forceps tranchants pour manipuler la gaufrette et minimiser la surface touchée par les forceps, car cela peut briser les SiNWs.
- Stériliser la puce en la rinçant avec 70% d’éthanol et en permettant à l’éthanol de sécher pendant 30 min sous la lumière UV dans un capot d’écoulement laminaire de biosécurité.
- Transférer la puce dans un tube de microcentrifugeuse stérile et rincer l’excès d’éthanol à l’aide d’un média de culture complet.
- Ajouter 1 mL de médias culturels et sonifier la puce dans le bain de sonication pendant 1-10 min. Les médias devraient devenir nuageux à mesure que les SiNWs sont diffusés dans les médias.
REMARQUE : Le temps et la puissance de sonication doivent être optimisés pour différents sonicateurs ou cellules différentes, car des durées plus courtes et des puissances inférieures donneront plus de SiNWs. - Ajouter la suspension SiNWs dans 5 mL de culture et l’ensemencer sur le plat de culture tissulaire de 100 mm avec des MFs. Permettre aux SiNWs d’internaliser pendant 4 h et rincer l’excès de SiNWs de 5 x avec des supports. Permettre aux SiNWs partiellement intériorisés de compléter l’internalisation en leur permettant de s’asseoir encore 1 h avant l’utilisation.
REMARQUE : Différents types de cellules peuvent avoir besoin de différents temps de concentration et/ou d’internalisation des SiNWs. - Préparer la solution de revêtement de collagène en diluant la solution de stock de collagène (3 mg/mL) avec l’acide acétique stérile de 20 mM à un rapport de 1:50. Ajouter une solution de revêtement de 0,5 mL à un plat de fond en verre de 35 mm et laisser reposer pendant 1 h dans 37 °C. Retirer la solution et rincer le plat avec du PBS stérile.
- Récoltez les hybrides cell-SiNWs en traitant les cellules avec 3 mL de trypsine pendant 2 min à 37 °C. Ajouter 10 mL de culture et rincer vigoureusement les hybrides par pipetting. Centrifugez doucement les cellules à 200 x g pendant 5 min pour éviter d’endommager les cellules avec les SiNWs intériorisés. Retirer l’excès de nourriture, suspendre les cellules avec 1 mL de médias et les ensemencer sur le plat de fond en verre traité au collagène.
REMARQUE : Les hybrides peuvent être ensemencés seuls, pour étudier le couplage intracellulaire ou intercellulaire ou avec des MC pour étudier le couplage hétérocellulaire in vitro. - Effectuer une vérification finale de l’internalisation du SiNW en étiquetant le cytosol des cellules (calcéine-AM, 4 μM) et la membrane (marqueur membranaire, 2 μM) pendant 30 min à 37 °C, et en imagerie de la cellule à l’aide d’une microscopie confocale. Comme les SiNWs sont très réfléchissants, la lumière réfléchie peut être utilisée au lieu de la fluorescence pour les visualiser.
2. Préparation des cellules aux investigations intra- et intercellulaires
- Préparer la solution de revêtement de collagène comme dans 1.12
- Pour la stimulation électrique intracellulaire, les hybrides de culture avec de faibles densités d’ensemencement. Utilisez un hémocytomètre standard pour compter les cellules de la section 1.11. et ensemencer 50 000 cellules sur un plat de fond en verre de 35 mm dans des supports de culture. Pour les investigations intercellulaires, utiliser des densités cellulaires plus élevées (500 000 cellules par plat). Pour le couplage intercellulaire entre les MC et les MF, co-culture des hybrides avec des MC fraîchement isolés.
- Laissez les cellules se fixer pendant la nuit avant d’effectuer des expériences de stimulation optique. Pour les investigations intercellulaires, prévoyez 48 h à 37 °C pour que les cellules expriment des jonctions intercellulaires avant que l’expérience ne soit menée.
- Préparer la solution de bouillon de colorant sensible au calcium (peut être conservé en -20 °C) en ajoutant 50 μL de DMSO à 50 μg Fluo-4 AM. Préparer la solution de coloration en diluant 1 μL de colorant dans 1 mL de DMEM.
- Aspirer le milieu de culture à partir de cellules et ajouter 1 mL de solution de coloration. Laisser le colorant s’intérioriser en cellules pendant 20-30 min à 37 °C. Aspirer le colorant et rincer deux fois avec du PBS stérile.
- Enfin, ajoutez 1 mL de DMEM Media sans phénol préchauffé et laissez le Fluo-4 intracellulaire subir une désestérification de 30 min en 37 °C.
- Transférer les cellules au microscope pour l’imagerie et la stimulation.
3. Imagerie optique et stimulation
- Préchauffer un microincubateur humidifié à 37 °C et un mélange air-CO2 à bulles (95:5).
- Utilisez un microscope avec une ligne laser collimée couplée dans le chemin lumineux pour l’imagerie calcique et la stimulation optique.
REMARQUE : Un microscope confocal à balayage est l’option la plus simple en raison de ses capacités de stimulation de points. Toutefois, cette procédure peut être effectuée à l’aide de n’importe quel microscope à florescence standard en couplant un faisceau laser collimé dans l’espace infini de la trajectoire de la lumière à l’aide d’un séparant de faisceau. N’importe quel objectif de microscope est conçu de sorte qu’un laser collimated passé par lui sera concentré à une tache limitée de laser de diffraction au plan focal. La longueur d’onde laser doit être proche de la lumière d’excitation, de sorte qu’elle sera réfléchie par le miroir dichroïque et passée par le filtre d’excitation. - Visualisez les SiNWs et déterminez le site de stimulation à l’aide d’une microscopie à champ lumineux, d’une lumière transmise ou d’une lumière réfléchissante. Ensuite, reconfigurez le chemin lumineux vers le mode fluorescence, tout en maintenant le point de stimulation à l’emplacement prédéfini du SiNW.
- Valider la puissance de stimulation optimale et la longueur du pouls pour chaque taille et type de cellule SiNW, afin de minimiser les dommages photothermaux aux cellules stimulées. Pour un protocole de stimulation typique, effectuez un enregistrement de base de 2-10 s de l’activité intracellulaire de calcium. Ensuite, appliquez une impulsion laser unique de 1-10 mW de puissance et une durée de 1-10 ms (correspondant à 30-300 kW/mm2)pour stimuler le SiNW, et enregistrer l’onde de calcium résultante pour un autre 2-10 s.
REMARQUE : Il est essentiel d’optimiser la puissance optique et la longueur des impulsions pour chaque taille et cellule SiNW. Ceci est nécessaire pour minimiser les dommages photothermaux aux cellules stimulées. - Transférez les films enregistrés de la stimulation optique, si nécessaire, pour une analyse plus approfondie.
4. Traitement vidéo
- Visualisez les changements dans la fluorescence Fluo-4 à l’aide de la macro17 « dF over F » disponible pour ImageJ18, qui calcule le changement dans les comptes de fluorescence pour chaque pixel, et se normalise par la valeur moyenne de la base de repos. Convertir la sortie (format point flottant) en 8 bits pour un traitement ultérieur.
- Traiter davantage le film dF/F à l’aide du filtre médian sélectif «Supprimer lesvaleurs aberrantes » disponible dans ImageJ. Définissez des paramètres pour supprimer les pixels dont la valeur est supérieure de plus de 10 à la valeur médiane dans un rayon de 2 pixels et remplacez cette valeur pixel par la médiane.
- Calculez le flux optique dans chaque image via l’algorithme Lucas-Kanade, tel qu’implémenté dans la boîte à outils Matlab Computer Vision. La sortie de cette fonction était un champ vectoriel contenant les composants x et y du flux optique à chaque point de chaque image (le code est disponible dans le fichier supplémentaire 1).
REMARQUE: Le flux optique moyen au sein d’une cellule, <ι>, correspond au développement du flux calcique au sein d’une cellule. Le différentiel du flux optique, Δ<ι> fournit le moment où la signalisation de calcium a été activée, en identifiant où le signal a été maximisé. En outre, l’ampleur de Δ<ι> à son maximum est corrélée à la vitesse à laquelle le front d’onde de calcium progresse à travers la cellule. - Calculer la vitesse intercellulaire de la transmission du calcium selon l’équation suivante.
-Ca2+ = rij / ( tmax,j − tmax,i ),
où tmax, j et t max, je suis les temps d’activation pour les cellules j et i, respectivement, et rij est la distance entre les centroïdes des cellules.
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Representative Results
La capacité de cette méthodologie à permettre un accès direct au cytosol intracellulaire dépend de l’internalisation spontanée du SiNW dans les cellules. Bien que les SiNWs subiront l’internalisation spontanée dans beaucoup de typesde cellules 15,quelques cellules, telles que des cardiomyocytes et des neurones, auront besoin des SiNWs pour être traitées pour permettre leur internalisation19. Dans ce protocole, nous décrivons le processus d’internalisation des SiNWs p-i-n avec 200-300 nm de diamètre et ~1-3 μm de long dans les MF cardiaques. Figure 1A démontre comment les SiNWs sont apparus sous microscopie lumineuse transmise. Utilisant l’optique standard de contraste de phase, les cellules confluent étaient facilement apparentes. Cependant, les SiNWs étaient à peine visibles, rendant leurs emplacements impossibles à définir. Ainsi, nous avons utilisé la microscopie des champs sombres, où seuls les objets réfléchissants peuvent être vus et l’arrière-plan est sombre. Dans ce contraste, cependant, les cellules ne peuvent pas être vues, car elles ne sont pas réfléchissantes. Pour montrer l’emplacement du SiNW dans les cellules, nous avons superposé les images ensemble, de sorte que l’arrangement périnucléaire des SiNWs dans les cellules soit apparent. Bien que la colocalisation des SiNWs et des cellules soit évidente, il est toujours important de vérifier que les SiNWs sont effectivement intériorisés dans les cellules, et ne reposent pas sur la membrane plasmatique. À cette fin, nous avons utilisé la microscopie confocale(figure 1B),où le cytosol était taché de calcéine-AM (vert) et la membrane plasmatique avec un marqueur membranaire (rouge). L’emplacement intracellulaire des SiNWs était alors évident. Notez que cette étape est extrêmement importante afin de vérifier l’emplacement intracellulaire des SiNWs, en particulier lorsqu’un nouveau type de cellule (ou ligne) est utilisé. Cependant, après l’internalisation est établie pour les cellules tachées, d’autres échantillons devraient être utilisés pour la procédure de stimulation. Bien qu’il ne soit pas dans le cadre de cette démonstration, il est également important de mentionner que dans les cas où les SiNO ne sont pas internalisés, les processus bioélectriques peuvent encore être examinés d’une manière similaire et extracellulaire16. Une fois que les cellules sont hybridées avec les SiNWs, elles peuvent être utilisées pour effectuer des études bioélectriques.
Ici, nous démontrons l’utilisation de cette méthodologie pour comparer le couplage électrique homocellulaire MF-MF au couplage hétérocellulaire des MFs aux MC. Après que les cellules aient été hybridées avec les SiNWs, les hybrides ont été ensemencés avec des MC et cultivés. Il est important de limiter le temps de culture afin que les MF proliférants ne surpeuplent pas la culture. La figure 2 montre un exemple représentatif d’une telle expérience. Les cellules co-culture ont été chargées avec le colorant sensible au calcium (Fluo-4) et les cellules ont été imaged sous un microscope confocal de disque filature. Avant d’appliquer une impulsion laser, une image brillante a été obtenue pour identifier l’emplacement d’un SiNW qui sera stimulé. Ensuite, une courte vidéo de base a été enregistrée, de sorte que les MC spontanément battus et les MF au repos peuvent être identifiés (Vidéo supplémentaire 1 et Vidéo supplémentaire 2). Dans cette expérience, le SiNW identifié a été stimulé avec une impulsion laser à un seul point (640 nm, 1 ms, 4 mW). Les cellules ont été constamment imaged avant et après la stimulation pour visualiser la dynamique de calcium sur la stimulation optique. Comme les cellules en culture diffèrent considérablement dans leur luminosité (Vidéo supplémentaire 1), les vidéos en direct ont été traitées en vidéos dF / F avec pseudocolor bleu à rouge (Vidéo supplémentaire 2), de sorte que les signaux de calcium seront plus clairs. Dans cette méthode, chaque pixel est comparé à son propre état de repos de base, avant que la stimulation ait été appliquée. Les images représentatives de la figure 2C démontrent la propagation du calcium dans la co-culture des MFs-MC et peuvent être analysées plus avant pour étudier le couplage électrique intercellulaire entre les différentes cellules, ainsi que la dynamique intracellulaire du calcium.
La figure 3A montre un moyen de représenter le flux calcique de l’ensemble du champ de vision en une seule image. En analysant les vidéos dF/F, nous montrons l’heure à laquelle les différentes cellules ont été excitées, ce qui a été déterminé par le moment où le changement du flux optique moyen atteint son maximum. De cette façon, on peut voir comment le flux de calcium s’est propagé d’une cellule à l’autre. Un script MATLAB sur mesure(Fichier supplémentaire 1) a été écrit et utilisé pour calculer le flux optique et aider à identifier le temps d’activation dans chaque région cellulaire (Figure 3B). La vitesse de propagation intercellulaire peut alors être déterminée en mesurant la distance entre les centroïdes de chaque cellule et en se divisant par le décalage horaire dans leur activation. Une analyse similaire peut être effectuée qui remplace la distance par le nombre de passages à niveau; à nos fins, la mesure de distance présente plus fidèlement la vitesse de transmission car elle explique également le temps passé dans la propagation intracellulaire, qui n’est pas négligeable. La figure 3C montre comment les vitesses intracellulaires ont été déterminées : pour chaque cellule, une ligne a été tracée dans le sens de la propagation du calcium et un kymographe a été généré en traçant le profil de temps d’intensité le long de cette lignée. Nous avons une ligne à l’avant de l’onde d’activation dans le kymograph, de sorte que la pente de la ligne représentait l’inverse de la vitesse de propagation intracellulaire. La figure 3D résume les différentes vitesses (inter et intracellulaires) pour les différentes cellules de la coculture. Toutes les données représentées dans ce graphique ont été tirées de la vidéo unique d’un seul champ de vision représentatif qui a été présenté ici.
Figure 1 : SiNWs intériorisé en MFs. (A) Image de contraste de phase des MF traités avec sinws montrent des cellules confluent (gauche). L’image de Darkfield montre les SiNWs dispersés dans le champ de vision (au milieu), tandis que la superposation des deux images (à droite) montre l’arrangement périnucléaire des SiNWs dans les MF. Les barres d’échelle sont 20 μm. (B) Image confoccale représentative (à gauche, barre d’échelle est de 10 μm) et 3 différentes sections transversales n-z qui correspond aux 3 lignes pointillées (à droite, barres d’échelle sont de 5 μm) montrent la partie intérieure d’un MF et le SiNW qui sont clairement à l’intérieur du cytosol. Le cytosol est vert (Calcéine-AM), la membrane rouge (masque cellulaire) et le blanc SiNWs (reflet). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Propagation du calcium dans la co-culture MF-CM. (A) Illustration d’une expérience de stimulation typique. Les MF avec sinws intériorisés sont stimulés par une impulsion laser, tandis que le flux de calcium est surveillé par un colorant sensible au calcium. (B) Une image de champ lumineux des cellules montre le SiNW intériorisé à l’intérieur d’un des MFs (gauche) et une image représentative de fluorescence du colorant de calcium (droite). Le SiNW stimulé est mis en évidence par une pointe de flèche rose. (C) Une co-culture des MF et des MC a été chargée avec le colorant sensible au calcium et un SiNW a été stimulé avec une impulsion laser (640 nm, 1 ms, 4 mW). Le flux de calcium a été surveillé par l’intensité fluo-4 (images du haut) et une vidéo dF/F en a été dérivée (images du bas). L’algorithme dF/F rend la visualisation du flux calcique plus claire, car il compare l’intensité de chaque pixel à sa propre ligne de base, montrant ainsi le changement, et non l’intensité réelle. Les barres d’échelle sont de 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse pf les vidéos dF/F de la figure 2. ( A ) la propagation du calcium peut être visualisée via une image de cartographie optique, où les codes de couleur pour le temps le pixelaété excité (ce qui signifie l’augmentation de la concentration de calcium et fluo-4 intensité relative). La cartographie optique peut être effectuée pour différents délais, c’est-à-dire des durées courtes (1,1 s, image supérieure) ou plus longues (5,5 s, image inférieure). Les barres d’échelle sont des exemples représentatifs de 20 μm.(B)pour calculer la vitesse de transmission des cellules cellulaires. Les deux cellules sont des MF ici, mais le même calcul peut être effectué avec la transmission MF-CM. Les graphiques montrent les traces du flux optique moyen (milieu) et du différentiel (en bas) pour chaque cellule. La transmission cellule-cellule peut ensuite être calculée à l’aide du Tmax pour les deux cellules ainsi que leurs centroïdes, tel que décrit dans le texte. Les astérisques rouges désignent deux MC avec un couplage MF-CM limité et donc un manque de réponse à la stimulation optique. Les barres d’échelle sont de 20 μm. (C) la vitesse intracellulaire de flux de calcium des MFs a été dérivée de la pente d’un kymograph généré en coupant les lignes colorées. Les kymographes représentent l’intensité le long de la ligne (axe x) et le temps (axe y), de sorte que les pentes plus raides correspondent à des vitesses plus élevées. Les barres d’échelle sont de 20 μm. (D) Les vitesses intercellulaires MFs-MFs et MFs-CMs, ainsi que les vitesses intracellulaires des MF peuvent être dérivées respectivement de B et C et tracées à des fins de comparaison (p-value<0.0001). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Vidéo supplémentaire 1 : Effet de la stimulation optique hybride MF-SiNW par Fluo-4. Le taux de MC est illustré avant et après la stimulation pour comparaison. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit à télécharger.)
Vidéo supplémentaire 2: Effet de la stimulation optique hybride MF-SiNW par la vidéo dF/F, dérivée des vidéos Fluo-4. Le taux de MC est illustré avant et après la stimulation pour comparaison. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit à télécharger.)
Figure supplémentaire S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
Nous avons démontré ici un moyen simple d’effectuer la stimulation électrique intracellulaire des cellules. Dans cette démonstration, nous avons utilisé des MF qui ont été préhybridisés avec les SiNWs, puis co-cultivés avec des MC. En général, la plupart des cellules proliférantes ont tendance à intérioriser les SiNWs, ce qui permet l’utilisation de cette méthodologie avec de nombreux autres types de cellules. En outre, tandis que nous avons démontré la stimulation intracellulaire des cellules, les mêmes principes peuvent être utilisés pour effectuer la stimulation extracellulaire des cellules. Cela peut être fait en bloquant les cascades endosomales15 des cellules qui vont spontanément les internaliser, ou en utilisant des cellules qui n’intériorisent pas sinws. Par exemple, bien qu’on ait constaté que les MC intériorisent certaines nanostructures20,21, elles n’intériorisent pas spontanously SiNWs15. Les SiNWs utilisés ici ont été synthétisés à l’aide d’un appareil de dépôt de vapeur chimique (CVD). Se référer à des ressources supplémentaires concernant la procédure détaillée de synthèse sinws, qui peut être trouvé ailleurs16. Après l’obtention des SiNWs, leur manipulation et leur utilisation sont simples et ne nécessitent aucun équipement sophistiqué ou coûteux qui n’est pas facilement disponible dans un laboratoire biomédical standard. Les SiNWs peuvent être facilement vus à l’aide de la microscopie standard darkfield (Figure 1), ce qui rend facile pour l’utilisateur de suivre le processus d’internalisation et de déterminer la concentration appropriée SINW et la durée de traitement qui est nécessaire pour une internalisation réussie. Il est également fortement recommandé de déterminer l’emplacement final exact des SiNWs une fois l’étape d’internalisation terminée. Cela peut être fait par des dyes disponibles dans le commerce utilisées pour les analyses de morts-vivants (comme Calcein-AM, utilisé ici) et la microscopie confoccale (Figure 1B). Cette étape est importante lorsqu’une lignée différente de cellules est utilisée pour la première fois, et l’interaction cellule-SiNW n’est pas claire. Différentes cellules peuvent intérioriser sinw dans différentes conditions, c’est-à-dire le temps, la concentration et la distribution de la taille. Cependant, après que le processus d’internalisation soit caractérisé pour une cellule donnée, cette procédure de vérification peut être ignorée tout en effectuant des études bio-électriques mécanistes.
Une fois que les cellules sont hybridées avec les SiNWs, elles peuvent être récoltées par des techniques standard de culture tissulaire et utilisées pour des investigations bioélectriques. Dans ce protocole, nous avons utilisé des hybrides MFs-SiNWs pour étudier comment les MF s’acquent électriquement à d’autres MF, ou aux MC in vitro. Cependant, il est important de noter que cette procédure peut être utilisée pour effectuer des analyses in vivo ainsi. Par exemple, dans une étude précédente de notre laboratoire, nous avons utilisé cette méthodologie pour étudier comment les MF s’accoupler électriquement aux MC in vivo et comparer cela à leur couplage in vitro14. Comme ce processus nécessite des capacités plus techniques, il n’est pas décrit dans ce protocole, mais les détails peuvent être trouvés dans notre étude précédente. Ici, nous montrons comment les cellules hybrides peuvent être utilisées pour apprendre comment le calcium se propage intra- et intercellulairement au sein de la co-culture (Figure 2A). Pour commencer l’expérience, l’emplacement d’un SiNW est déterminé pour la stimulation de point. Bien que les SiNWs soient à peine visibles en utilisant le contraste de phase, il est important de mentionner que le champ lumineux standard (sans phase ni contraste de champ sombre) permettra également leur visualisation (Figure 2B), sans avoir besoin d’étiquetage fluorescent ou de techniques de microscopie spécialisées. Après avoir identifié un SiNW d’intérêt, on peut appliquer une impulsion optique pour stimuler électriquement la cellule. Avant l’application de la stimulation, l’enregistrement de base des cellules montre une activité électrique spontanée dans quatre groupes différents de MC, qui semblent ne pas être synchronisés dans leur activité électrique (Vidéo supplémentaire 1 Et Vidéo supplémentaire 2). En outre, 8 MFs différents sans activité électrique spontanée peuvent être vus. Les images représentatives de colorant calcique et de dF/F montrent la propagation du calcium dans toute la culture lors de la stimulation optique (Figure 2CEt Vidéo supplémentaire 1 Et Vidéo supplémentaire 2). Ces vidéos en direct peuvent être analysées plus en détail pour apprendre le couplage électrique des différentes cellules dans le champ de vision (Figure 3). Tout d’abord, la cartographie optique de la vidéo (Figure 3A) montre la séquence des cellules qui sont stimulées par l’impulsion optique. Les barres de temps sur la droite sont relatives au premier cadre après l’application de la stimulation optique. Comme la réponse des MC à la stimulation est beaucoup plus rapide que celle des MF, nous avons effectué la cartographie optique deux fois, avec des délais différents. Le premier a été effectué pour montrer la réponse rapide CMs, de sorte que la gamme de couleurs couvre 1,1 s après la stimulation. Cela montre l’ordre dans lequel les différents MC et les premiers MFs sont excités par la stimulation. Toutefois, comme il y a des MF qui sont plus en aval de la trajectoire de propagation, leur moment d’excitation n’apparaît pas dans cette cartographie. Ainsi, la même analyse a été effectuée pour une plus longue durée, ce qui donne moins de détails sur la réponse initiale, mais démontre clairement le temps de décalage et la réponse plus lente des MF qui sont en aval du site d’excitation. À l’aide de notre algorithme sur mesure, nous avons pu fournir une analyse quantitative reproductible du moment maximal du flux calcique, que nous avons utilisé comme référence, ainsi que la distance de la cellule par rapport à la stimulation, pour déterminer la vitesse de propagation intercellulaire à cette cellule. Cela a été effectué à la fois sur les MC et les MF, de sorte que la nette différence entre la propagation passive (MF-MF) et amplifiée (MF-CM) peut être mesurée. En outre, il peut être clairement démontré que l’activité électrique de deux MC (astérisques rouges Figure 3B) ne sont pas affectés par la stimulation optique. Cela peut être attribué au fait que toutes les cellules ne sont pas également couplées à une autre au sein de la culture. Cette technique permet à l’utilisateur d’identifier quelles cellules dans le champ de vision sont en effet couplées à la cellule stimulée, et qui ne le sont pas. En outre, nous avons pu déterminer la direction de propagation dans chaque cellule et définir une ligne parallèle qui a été utilisée pour dériver un kymograph décrivant la propagation à l’intérieur de cette cellule. Ceci a été employé pour déterminer la vitesse intracellulaire de flux de calcium, selon la pente du kymograph (Figure 3C). Lorsque toutes les vitesses intracellulaires et intercellulaires ont été compilées, il était clair que la réponse des MC était significativement plus rapide que celle de la réponse des MF à la stimulation optique. En même temps, les vitesses intracellulaires des MF se sont trouvées légèrement plus rapides, mais comparables aux vitesses intercellulaires de propagation de MF-MF. Cette observation suggère que, contrairement au couplage électrique amplifié entre les MF et les MC, le couplage électrique intercellulaire entre les MFs est passif, et basé sur la diffusion du calcium par le volume intracellulaire, puis les jonctions intercellulaires d’écart22,23 ou tunneling nanotubes24, agissant comme un goulot d’étranglement qui ralentit la vitesse de propagation. La capacité des SiNWs à transduire la stimulation optique à un interrogatoire bioélectrique peut être attribuée à la réaction photoanodique et photocathodique à la jonction p-n des SiNWs, ou à la réaction photothermale due à la faible capacité thermique des SiNWs13. Bien que d’autres particules nanométriques puissent transduire la stimulation optique25, ils sont généralement encapsulés dans une enveloppe endosomale26, limitant leur capacité à interagir directement avec les organites intracellulaires pour les interrogatoires locaux. Il est important de se rendre compte que la forte densité optique de la stimulation peut entraîner des dommages cellulaires dus à l’effet photothermal. Ainsi, il est important d’optimiser la puissance et la longueur des impulsions afin qu’un tel effet soit évité. Cependant, pour les cellules sensibles, il est possible d’étudier comment le calcium se propage entre les autres cellules de la culture, même si des dommages thermiques locaux sont appliqués à la cellule stimulée.
Un autre aspect clé de cette méthodologie d’analyse est que toutes les données présentées à la figure 3D ont été recueillies à partir d’une seule vidéo d’un seul champ de vision au sein de cette culture. Malgré l’utilisation d’un seul champ de vision, les données recueillies étaient encore suffisamment solides pour obtenir une signification statistique, ce qui démontre la force et l’efficacité de cette méthodologie. Pour analyser et étudier des effets plus délicats et subtils, un ensemble de données beaucoup plus vaste peut être facilement généré en stimulant d’autres cellules dans la même culture. Pour un plat de fond en verre avec un diamètre effectif de 10 mm, on peut trouver plus de 2000 champs de vision à analyser. Comme une stimulation laser point simple doit être réglée, chaque expérience de stimulation devrait prendre moins de 1 min pour effectuer. Cela permettra d’effectuer de nombreuses études mécanistes d’une manière inaccessible en utilisant des techniques traditionnelles telles que patch-clamp, ou tableau microélecrode avec des positions d’électrode prédéfinie. En outre, la taille à l’échelle nanométrique des SiNWs utilisés dans le herein, permet une stimulation avec une résolution spatiale extrêmement élevée. Quant à la résolution temporelle, elle sera déterminée par le microscope utilisé pour l’imagerie/simulation. Dans ce contexte, l’utilisation de l’imagerie se traduira par une faible résolution temporelle, ce qui peut être amélioré en utilisant des techniques d’électrophysiologie plus sensibles au temps, telles que des pinces à patch ou des micro-électrodes. Bien que les SiNWs soient considérés comme bioabsorbables à long terme, nous n’avons jamais remarqué de dégradation notable dans un délai maximum de 7 jours, ce qui permettra son utilisation pour la plupart des études in vitro.
Dans l’ensemble, nous avons utilisé une technique simple et simple pour effectuer une étude bio-électrique in vitro des cellules cardiaques. Nous montrons comment nous pouvons étudier la façon différente dont différentes cellules sont couplées les unes aux autres et décrit une façon reproductible de quantifier la propagation et la vitesse du calcium. La technique est adaptable à d’autres types de cellules, ainsi qu’aux paramètres in vivo et ex vivo. Il est basé sur la microscopie standard de fluorescence et un laser couplé qui sont largement disponibles aux laboratoires biomédicaux standard, et il n’y a aucun besoin d’équipement spécialisé. La technique peut être facilement maîtrisée et peut permettre la collecte de grands ensembles de données en un temps minimal, par rapport aux techniques disponibles.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ces travaux sont appuyés par le Bureau de la recherche scientifique de la Force aérienne (AFOSR FA9550-18-1-0503).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass bottom dishes | Cellvis | D35-10-0-N | |
| 3i Marianas Spinning Disk Confocal | 3i | ||
| Calcein-AM | Invitrogen | C1430 | |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Invitrogen | C10045 | |
| Collagen I, rat tail | Gibco | A1048301 | |
| Deluxe Diamond Scribing Pen | Ted Pella | 54468 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| DMSO, Anhydrous | Invitrogen | D12345 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes | Falcon | 08-772E | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, | Gibco | 10082147 | |
| Fibronectin Human Protein, Plasma | Gibco | 33016015 | |
| Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | FB11201 | |
| Fluo-4, AM, cell permeant | Invitrogen | F14201 | |
| FluoroBrite DMEM Media | Gibco | A1896701 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2) | OKO | ||
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Scientific | 88281 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
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