Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Silizium-Nanodrähte und optische Stimulation für Untersuchungen der intra- und interzellulären elektrischen Kopplung

4.1K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/61581

⸱

28. Januar 2021

 ,  ,  , 
1The James Franck Institute, The University of Chicago, 2Department of Chemistry, The University of Chicago, 3The Institute for Biophysical Dynamics, The University of Chicago

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Silizium-Nanodrähten für die intrazelluläre optische Biomodulation von Zellen in einer einfachen und einfach durchzuführenden Methode. Die Technik ist sehr anpassungsfähig an verschiedene Zelltypen und kann sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Anwendungen eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Myofibroblasten können spontan Silizium-Nanodrähte (SiNWs) verinnerlichen und sind damit ein attraktives Ziel für bioelektronische Anwendungen. Diese Zell-Silizium-Hybride bieten bleifreie optische Modulationsfunktionen mit minimaler Störung des normalen Zellverhaltens. Die optischen Fähigkeiten werden durch die photothermischen und photoelektrischen Eigenschaften von SiNWs ermittelt. Diese Hybriden können mit Standard-Gewebekulturtechniken geerntet und dann auf verschiedene biologische Szenarien angewendet werden. Wir zeigen hier, wie diese Hybriden verwendet werden können, um die elektrische Kopplung von Herzzellen zu untersuchen und zu vergleichen, wie Myofibroblasten miteinander oder mit Kardiomyozyten verzahnt werden. Dieser Prozess kann ohne spezielle Ausrüstung jenseits eines Fluoreszenzmikroskops mit gekoppelter Laserlinie durchgeführt werden. Gezeigt wird auch die Verwendung einer maßgeschneiderten MATLAB-Routine, die die Quantifizierung der Kalziumvermehrung innerhalb und zwischen den verschiedenen Zellen in der Kultur ermöglicht. Myofibroblasten haben nachweislich eine langsamere elektrische Reaktion als Kardiomyozyten. Darüber hinaus zeigt die myofibroblast-interzelluläre Ausbreitung etwas langsamere, wenn auch vergleichbare Geschwindigkeiten mit ihren intrazellulären Geschwindigkeiten, was auf eine passive Ausbreitung durch Spaltknoten oder Nanoröhren hindeutet. Diese Technik ist sehr anpassungsfähig und kann leicht auf andere zelluläre Arenen angewendet werden, sowohl für In-vitro-, als auch in vivo- oder ex vivo-Untersuchungen.

Einleitung

Alle biologischen Organismen nutzen Elektrizität in Form von Ionen, um das zelluläre Verhalten zu regulieren. Zellmembranen enthalten verschiedene Arten spezifischer Ionenkanäle, die den passiven und aktiven Transport von Ionen ermöglichen. Diese Ionen steuern die Funktionen von erregbaren Zellen, wie neuronale Aktivität und Skelett und Herzmuskelkontraktilität. Jedoch, Bioelektrizität spielt auch eine wichtige Rolle in nicht-erregbaren Zellen, die viele zelluläre Funktionen wie Zellproliferation1,Neuroimmunität2,3,4und Stammzelldifferenzierung5.

In den letzten Jahrzehnten hat der Bereich der Bioelektrizität ein wachsendes Interesse geweckt, was zur Entwicklung zahlreicher Technologien für bioelektronische Schnittstellen beigetragen hat. Mikroelektroden-Patchpipetten sind der Goldstandard der intrazellulären Aufzeichnung und Stimulation6. Bei dieser Methode wird eine Glaspipette unter bestimmten Bedingungen gezogen, um eine scharfe Kante mit einer Porengröße von wenigen Mikrometern zu bilden. Diese Pipette ist mit einem Puffer gefüllt und die Pipette ermöglicht den direkten Kontakt des Puffers mit dem intrazellulären Volumen. Daraus ergibt sich eine bioelektrische Schnittstelle, die extrem hohe Signal-Rausch-Verhältnisse, eine präzise Steuerung der zellulären elektrischen Aktivität und eine extrem hohe zeitliche Auflösung liefert. Obwohl diese Methode ein extrem leistungsfähiges Werkzeug ist, das vor kurzem auf eine Nanopipettenkonfiguration7herunterskaliert wurde, ist es mit mehreren wichtigen technischen Einschränkungen verbunden. Der Zytosolverdünnungseffekt8sowie mechanische Vibrationen beschränkt seinen Nutzen auf kurzfristige Verhöre und erfordert teure Spezialausrüstung und ein hohes Maß an technischem Geschick. Darüber hinaus begrenzt seine Sperrigkeit die Anzahl der Zellen, die gleichzeitig aufgezeichnet oder stimuliert werden können, und aufgrund seiner Invasivität kann es während eines Experiments nicht neu konfiguriert werden. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Mikroelektroden-Arrays entwickelt, aber die Größe der Elektroden begrenzt die räumliche Auflösung sowie den intrazellulären Zugang. Nanoelektroden-Arrays ermöglichen intrazelluläre Aufzeichnung und Stimulation, erfordern aber eine abrasive Elektroporation, um auf das Zytosol9,10zugreifen zu können. Darüber hinaus sind alle diese Methoden substratgebunden und daher auf In-vitro-Zellkulturen oder auf externe oberflächliche Zellen beschränkt, ohne Zugang zu Zellen, die sich in einem dreidimensionalen (3D) Gewebe befinden.

Optogenetik11 ist weit verbreitet, um diese 3D- und In-vivo-Beschränkungen zu beheben. Optogenetische Methoden basieren jedoch auf den Störungen von lichtaktivierten Plasmamembran-Ionenkanälen, die an der Plasmamembran verteilt werden, wodurch die räumliche 3D-Auflösung12 und intrazelluläre Fähigkeiten begrenzt werden.

Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Silizium-Nanodrähte (SiNWs) verwendet werden können, um intrazelluläre bioelektrische Verhöre mit submikronräumlicher Auflösung mit verschiedenen nicht erregbaren Zellen durchzuführen, nämlich Herzmyofibroblasten und Oligodendrozyten13. Darüber hinaus verwendeten wir diese SiNWs, um ex-vivo zellspezifische Verhöre innerhalb eines 3D-Herzgewebes durchzuführen, um zu untersuchen, wie Herzzellen in vivo14elektrisch koppeln. Ein großer Vorteil dieser Methode ist ihre Einfachheit; es erfordert keine genetische Veränderung oder sperrige Instrumentierung. Viele Zellen verinnerlichen spontan fotoresponsive SiNWs ohne Beschallung oder Elektroporation15. Darüber hinaus entfliehen sie spontan der endosomalen Verkapselung und bilden eine nahtlose Integration mit den Zytosolen und intrazellulären Organellen13,15. Diese Zell-SiNWs-Verbundwerkstoffe, sogenannte Zell-Silizium-Hybride, besitzen die dynamische, weiche und vielseitige Natur der ursprünglichen Zelle sowie die optoelektrischen Fähigkeiten der SiNWs. Nach der Hybridisierung kann der Zell-SiNW-Hybrid mit Standard-Gewebekulturtechniken geerntet und für verschiedene Anwendungen wie intrazelluläre bioelektrische Stimulation verwendet werden; Untersuchung der interzellulären bioelektrischen Kopplung in vitro; und für in vivo zellspezifische Verhöre. Da eine effektive Stimulation eine Kolokalisierung von hohen optischen Leistungsdichten und SiNWs erfordert, kann man sowohl in 2D als auch in 3D eine hohe räumliche Auflösung erzielen. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die Methodik sowie wie die Ergebnisse analysiert werden können. Der Schwerpunkt liegt auf der intra- und interzellulären Untersuchung in vitro, aber die in vivo Umsetzung dieser Methode kann direkt für viele andere biologische Szenarien genutzt werden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Um die Einhaltung ethischer Standards zu gewährleisten, wurden alle tiertierischen Verfahren im Zusammenhang mit der Isolierung von Kardiomyozyten aus Nagetierherzen zuerst vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Chicago genehmigt. Darüber hinaus wurden alle Tierversuche in vollständiger Übereinstimmung mit Anleitung der University of Chicago IACUC durchgeführt.

1. Herstellung von Zell-SiNWs-Hybriden

  1. Isolieren Sie primäre Kardiomyozyten (CMs) mit einem kommerziellen Kit nach den Richtlinien des Herstellers.
  2. Bereiten Sie komplettes DMEM für die primäre Zellisolation vor, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 1% L-Glutamin.
  3. Um Myofibroblast (MFs) von der MFs-CMs Suspension zu isolieren, die isolierten Zellen auf eine Gewebekulturschale (Zellen isoliert von 2 Herzen ab Schritt 1.1. pro 100 mm Schale) für 1 h vorzublenden. Da CMs eine Fibronectin- oder Kollagen-behandelte Oberfläche benötigen, um haften zu können, werden nur MFs an der Gewebekulturoberfläche befestigt.
  4. Aspirieren Sie die angereicherte CMs-Zellsuspension. Diese CMs können für heterozelluläre Kopplungsexperimente verwendet werden, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Spülen Sie die MFs mit DMEM, um alle verbleibenden CMs aus dem MFs-Gericht zu entfernen.
  5. Fügen Sie den MFs ein frisches Kulturmedium hinzu und lassen Sie sie sich vermehren, bis sie zu 80 % (2-4 Tage) konfluent sind. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag.
  6. Wenn die Zellen bereit sind (80% konfluent), bereiten Sie SiNWs für den hybridisierenden Schritt unten vor (Schritt 1.7).
    HINWEIS: Viele Arten von SiNWs können dafür verwendet werden. In diesem Experiment wurden SiNWs verwendet, die durch chemische Dampfabscheidung (CVD) mit einer Core-Shell p-i-n-Knotenkonfiguration angebaut wurden, wie zuvorbeschrieben 16. Während des CVD-Wachstums werden die SiNWs auf einem Siliziumwafersubstrat angebaut und schließlich als Siliziumchips mit SiNWs abgedeckt.
  7. Schneiden Sie einen 3 mm x 3 mm Chip aus einem Wafer mit CVD gewachsenen SiNWs mit einem Diamantschreiber. Verwenden Sie scharfe Zangen, um den Wafer zu behandeln und die Oberfläche zu minimieren, die mit den Zangen berührt wird, da dies die SiNWs brechen kann.
  8. Sterilisieren Sie den Chip, indem Sie ihn mit 70% Ethanol spülen und das Ethanol 30 min unter UV-Licht in einer biosafety laminaren Durchflusshaube trocknen lassen.
  9. Übertragen Sie den Chip in ein steriles Mikrozentrifugenrohr und spülen Sie überschüssiges Ethanol mit vollständigen Kulturmedien.
  10. Fügen Sie 1 ml Kulturmedien hinzu und beschallen Sie den Chip im Beschallungsbad für 1-10 min. Die Medien sollten trüb werden, wenn SiNWs in die Medien veröffentlicht werden.
    HINWEIS: Beschallungszeit und -leistung sollten für verschiedene Beschallungsgeräte oder verschiedene Zellen optimiert werden, da kürzere Dauern und geringere Kräfte längere SiNWs ergeben.
  11. Fügen Sie die SiNWs Suspension in 5 ml Kulturmedien ein und säen Sie sie mit MFs auf die 100 mm Gewebekulturschale. Lassen Sie die SiNWs 4 h verinnerlichen und spülen Sie die überschüssigen SiNWs mit Medien 5x ab. Erlauben Sie teilweise internalisierten SiNWs, die Internalisierung abzuschließen, indem sie vor der Verwendung weitere 1 H sitzen.
    HINWEIS: Verschiedene Zelltypen können unterschiedliche SiNWs-Konzentration und/oder Verinnerungszeiten erfordern.
  12. Bereiten Sie Kollagen-Beschichtungslösung durch Verdünnen von Kollagen-Stammlösung (3 mg/ml) mit steriler 20 mM Essigsäure im Verhältnis 1:50 vor. 0,5 ml Beschichtungslösung zu einer 35 mm Glasbodenschale geben und 1 h in 37 °C sitzen lassen. Entfernen Sie die Lösung und spülen Sie die Schale mit sterilem PBS.
  13. Ernte der Zell-SiNWs-Hybriden, indem Sie die Zellen mit 3 ml Trypsin für 2 min bei 37 °C behandeln. Fügen Sie 10 ml Kulturmedien hinzu und spülen Sie die Hybriden kräftig durch Pipettieren. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min vorsichtig bei 200 x g, um eine Beschädigung der Zellen mit den internalisierten SiNWs zu vermeiden. Entfernen Sie überschüssige Medien, suspendieren Sie Zellen mit 1 ml Medien und säen Sie sie auf die kollagen behandelte Glasbodenschale.
    HINWEIS: Die Hybriden können allein gesät werden, um die intrazelluläre oder interzelluläre Kopplung zu untersuchen, oder mit CMs, um die heterozelluläre Kopplung in vitro zu untersuchen.
  14. Führen Sie eine abschließende Überprüfung der SiNW-Internalisierung durch, indem Sie das Cytosol (Calcein-AM, 4 M) und die Membran (Membranmarker, 2 m) 30 min bei 37 °C beschriften und die Zelle mittels konfokaler Mikroskopie abbilden. Da SiNWs stark reflektierend sind, kann reflektiertes Licht anstelle von Fluoreszenz verwendet werden, um sie zu visualisieren.

2. Vorbereitung von Zellen für intra- und interzelluläre Untersuchungen

  1. Vorbereiten der Kollagenbeschichtungslösung wie in 1.12
  2. Für die intrazelluläre elektrische Stimulation, Kultur-Hybriden mit geringer Sädichte. Verwenden Sie ein Standardhämozytometer, um Zellen aus Abschnitt 1.11 zu zählen. und Säen Sie 50.000 Zellen auf einer 35 mm Glasbodenschale in Kulturmedien. Für interzelluläre Untersuchungen verwenden Sie höhere Zelldichten (500.000 Zellen pro Schale). Für die interzelluläre Kopplung zwischen CMs und MFs werden die Hybriden mit frisch isolierten CMs kokulturiert.
  3. Lassen Sie Zellen über Nacht anbringen, bevor Sie optische Stimulationsexperimente durchführen. Für interzelluläre Untersuchungen 48 h bei 37 °C für die Zellen erlauben, interzelluläre Spaltverbindungen auszudrücken, bevor das Experiment durchgeführt wird.
  4. Bereiten Sie kalziumempfindliche Farbstoff-Lösung (kann in -20 °C gehalten werden) durch Zugabe von 50 l DMSO zu 50 g Fluo-4 AM. Bereiten Sie die Färbelösung vor, indem Sie 1 l Farbstoff in 1 ml DMEM verdünnen.
  5. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Zellen und fügen Sie 1 ml Färbelösung hinzu. Farbstoff 20-30 min bei 37 °C in Zellen verinnerlichen lassen. Den Farbstoff ansaugen und zweimal mit sterilem PBS abspülen.
  6. Schließlich 1 ml vorgewärmtphenolrot-freie DMEM Media hinzufügen und die intrazelluläre Fluo-4 für 30 min bei 37 °C entestert werden lassen.
  7. Übertragen Sie Zellen zum Mikroskop zur Bildgebung und Stimulation.

3. Optische Bildgebung und Stimulation

  1. Vorheizen eines befeuchteten Mikroinkubators auf 37 °C und Blasenluft-CO2-Gemisch (95:5).
  2. Verwenden Sie ein Mikroskop mit einer kollimierten Laserlinie, die in den Lichtpfad für die Kalzium-Bildgebung und optische Stimulation gekoppelt ist.
    HINWEIS: Ein Raster-Konfokalmikroskop ist aufgrund seiner Punktstimulationsfähigkeiten die einfachste Option. Dieses Verfahren kann jedoch mit jedem Standardfloreszenzmikroskop durchgeführt werden, indem ein kollimierter Laserstrahl mit einem Strahlsplitter in den unendlichen Raum des Lichtpfades gekoppelt wird. Jedes Mikroskopobjektiv ist so konzipiert, dass ein kollimierter Laser, der durch ihn geleitet wird, auf einen beugungsbegrenzten Laserfleck an der Brennebene fokussiert wird. Die Laserwellenlänge sollte in der Nähe des Anregungslichts sein, so dass sie vom dichroitischen Spiegel reflektiert und vom Anregungsfilter übergeben wird.
  3. Visualisieren Sie die SiNWs und bestimmen Sie die Stimulationsstelle mithilfe von Hellfeldmikroskopie, durchlichtem Licht oder reflektierendem Licht. Konfigurieren Sie dann den Lichtpfad in den Fluoreszenzmodus, während Sie den Stimulationspunkt an der vordefinierten Position des SiNW beibehalten.
  4. Validieren Sie die optimale Stimulationsleistung und Pulslänge für jede SiNW-Größe und jeden Zelltyp, um photothermische Schäden an stimulierten Zellen zu minimieren. Führen Sie für ein typisches Stimulationsprotokoll eine 2-10 s Baseline-Aufzeichnung der intrazellulären Calciumaktivität durch. Wenden Sie dann einen einzelnen Laserpuls von 1-10 mW Leistung und 1-10 ms Dauer (entsprechend 30-300 kW/mm2) an, um den SiNW zu stimulieren, und zeichnen Sie die resultierende Kalziumwelle für weitere 2-10 s auf.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die optische Leistung und Pulslänge für jede SiNW-Größe und -Zellen zu optimieren. Dies ist notwendig, um photothermische Schäden an den stimulierten Zellen zu minimieren.
  5. Übertragen Sie ggf. die aufgenommenen Filme der optischen Stimulation zur weiteren Analyse.

4. Videoverarbeitung

  1. Visualisieren Sie Änderungen der Fluo-4-Fluoreszenz mithilfe desfür ImageJ18verfügbaren Makros "dF über F", das die Änderung der Fluoreszenzanzahl für jedes Pixel berechnet und durch den Durchschnittswert der Ruhebasislinie normalisiert. Konvertieren Sie die Ausgabe (Gleitkommaformat) zur weiteren Verarbeitung in 8 Bit.
  2. Verarbeiten Sie den dF/F-Film weiter mit dem selektiven Medianfilter "Ausreißerentfernen ", der in ImageJ verfügbar ist. Definieren Sie Parameter, um Pixel zu entfernen, deren Wert mehr als 10 über dem Medianwert in einem Radius von 2 Pixeln liegt, und ersetzen Sie diesen Pixelwert durch den Median.
  3. Berechnen Sie den optischen Fluss in jedem Frame über den Lucas-Kanade-Algorithmus, wie er in der Matlab Computer Vision Toolbox implementiert ist. Die Ausgabe dieser Funktion war ein Vektorfeld, das die x- und y-Komponenten des optischen Flusses an jedem Punkt in jedem Bild enthielt (Code ist in Der Zusatzdatei 1verfügbar).
    ANMERKUNG: Der mittlere optische Fluss innerhalb einer Zelle, <->, entspricht der Entwicklung des Kalziumflusses innerhalb einer Zelle. Das Differential des optischen Flusses, s<> liefert den Zeitpunkt, an dem die Calciumsignalisierung aktiviert wurde, indem ermittelt wird, wo das Signal maximiert wurde. Darüber hinaus korreliert die maximale Größe von s<> mit der Geschwindigkeit, mit der die Kalziumwellenfront durch die Zelle fortschreitet.
  4. Berechnen Sie die interzelluläre Geschwindigkeit der Kalziumübertragung gemäß der folgenden Gleichung.
    vCa2+ = rij / ( tmax,j
    wobei tmax,j und tmax,i die Zeiten der Aktivierung für die Zellen j bzw. i sind, und rij ist der Abstand zwischen den Schwerpunkten der Zellen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die Fähigkeit dieser Methode, einen direkten Zugang zum intrazellulären Zytosol zu ermöglichen, hängt von der spontanen Internalisierung des SiNW in die Zellen ab. Obwohl SiNWs einer spontanen Internalisierung in viele Zelltypen15unterzogen werden, werden einige Zellen, wie Kardiomyozyten und Neuronen, die SiNWs benötigen, um ihre Internalisierung zu ermöglichen19. In diesem Protokoll beschreiben wir den Internalisierungsprozess von p-i-n SiNWs mit 200-300 nm Durchmesser un...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Wir haben hier eine einfache Möglichkeit zur intrazellulären elektrischen Stimulation von Zellen demonstriert. In dieser Demo haben wir MFs verwendet, die mit SiNWs vorhybridisiert und dann mit CMs kokultiviert wurden. Im Allgemeinen haben die meisten sich vermehrenden Zellen die Tendenz, SiNWs zu internalisieren, was die Verwendung dieser Methode mit vielen anderen Zelltypen ermöglicht. Darüber hinaus haben wir zwar die intrazelluläre Stimulation von Zellen demonstriert, aber die gleichen Prinzipien können verwendet wer...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wird vom Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
35 mm GlasbodenschalenCellvisD35-10-0-N
3i Marianas Spinning Disk Confocal3i
Calcein-AMInvitrogenC1430
CellMask Orange Plasmamembran StainInvitrogenC10045
Collagen I, RattenschwanzGibcoA1048301
Deluxe Diamond Scribing PenTed Pella54468
DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat, kein GlutaminGibco10313039
DMSO, wasserfreiesInvitrogenD12345
Falcon Standard GewebekulturschalenFalcon08-772E
Fötales Rinderserum, zertifiziert, hitzeinaktiviert,Gibco10082147
Fibronektin Menschliches Protein, PlasmaGibco33016015
Fisherbrand 112xx Serie Erweiterter UltraschallreinigerFisher ScientificFB11201
Fluo-4, AM, zelldurchlässigInvitrogenF14201
FluoroBrite DMEM MedienGibcoA1896701
L-Glutamin (200 mM)Gibco25030081
OKO volle Klimakontrollkammer (konstant Temperatur, Luftfeuchtigkeit und CO2)OKO
PBS, pH 7,4Gibco10010023
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Gibco15140122
Pierce Primary Cardiomycyte Isolation KitThermo Scientific88281
Trypsin-EDTA (0,25%), PhenolrotGibco25200056

Referenzen

  1. Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle. Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).
  2. Dantzer, R. Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa. Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).
  3. Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression. Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497(2016).
  4. Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis. Nature Immunology. 18 (2), 116(2017).
  5. Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation. Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).
  6. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
  7. Jayant, K., et al. Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes. Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
  9. Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation. Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).
  10. Robinson, J. T., et al. Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits. Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).
  11. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  12. Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo. Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).
  13. Rotenberg, M. Y., et al. Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution. Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).
  14. Rotenberg, M. Y., et al. Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).
  15. Zimmerman, J. F., et al. Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires. Science Advances. 2 (12), 1601039(2016).
  16. Jiang, Y., et al. Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials. Nature protocols. 14 (5), 1339(2019).
  17. Ackman, J. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java. , Available from: https://gist.github.com/ackman678/11155761 (2020).
  18. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229(2017).
  19. Lee, J. -H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons. Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).
  20. Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., García-Rivas, G. Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we. Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).
  21. Lozano, O., et al. Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091(2019).
  22. Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin. Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).
  23. Klesen, A., et al. Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology. Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).
  24. He, K., et al. Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes. Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).
  25. Carvalho-de-Souza, J. L., et al. Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles. Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).
  26. Wang, S. -H., Lee, C. -W., Chiou, A., Wei, P. -K. Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images. Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33(2010).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Myofibroblasten-IsolierungCalcium-ImagingKonfokalmikroskopieLaserstimulationGap-Junction-AnalyseZell-Kokulturbioelektronische Anwendungen
Silizium-Nanodrähte und optische Stimulation für Untersuchungen der intra- und interzellulären elektrischen Kopplung
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.