Summary
여기에서는 망막 변성, 녹내장, 당뇨병 성 망막증 및 근시 모델에서 생체 내 망막 및 안구 구조를 시각화하기 위해 스펙트럼 도메인 광학 간섭 단층 촬영 (SD-OCT)을 사용하는 방법을 설명합니다.
Abstract
스펙트럼 영역 광학 간섭 단층 촬영 (SD-OCT)은 생체 내에서 망막 및 안구 구조를 시각화하는 데 유용합니다. 연구에서 SD-OCT는 다양한 망막 및 안구 질환 및 손상 모델의 변화를 평가하고 특성화하는 데 유용한 도구입니다. 광 유도 망막 변성 모델에서 SD-OCT는 시간 경과에 따른 광수용체 층의 얇아짐을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 녹내장 모델에서 SD-OCT는 감소된 망막 신경 섬유층과 총 망막 두께를 모니터링하고 안구 고혈압을 유도한 후 시신경 부항을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 당뇨병 설치류에서 SD-OCT는 연구자들이 총 망막 두께 감소와 특정 망막 층, 특히 질병 진행에 따른 망막 신경 섬유층의 두께 감소를 관찰하는 데 도움이 되었습니다. 근시의 마우스 모델에서 SD-OCT는 축 방향 길이 변화와 같은 축 방향 매개 변수를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. SD-OCT의 장점에는 안구 구조의 생체 내 이미징, 시간 경과에 따른 안구 치수의 변화를 정량적으로 추적하는 기능, 빠른 스캔 속도 및 고해상도가 포함됩니다. 여기에서는 SD-OCT의 방법을 자세히 설명하고 망막 변성, 녹내장, 당뇨병 성 망막증 및 근시 모델에서 실험실에서 사용 된 예를 보여줍니다. 방법에는 마취, SD-OCT 이미징 및 두께 측정을 위한 이미지 처리가 포함됩니다.
Introduction
스펙트럼 영역 광학 간섭 단층 촬영(SD-OCT)은 임상의와 연구자가 안구 구조를 비침습적으로 검사할 수 있는 정밀한 고해상도 이미징 방식입니다. 이 이미징 기술은 간섭계를 기반으로 하여 마이크로미터 규모의 생체 내 3차원 망막 이미지를 캡처합니다.1,2. 망막층 및 망막하 액의 구조적 결함 및/또는 얇아짐과 같은 병리학적 특징의 쉬운 감지 및 정확성으로 인해 시력 연구 및 클리닉에서 가장 자주 사용되는 영상 양식중 하나가 되었습니다3. 시각 관련 장애의 동물 모델을 사용한 연구에서 SD-OCT는 구조와 기능 간의 관계와 조직 병리학 적 기원에 대한 필수적인 비 침습적 분석을 제공했습니다4. 해상도 (눈의 깊이에 따라 최대 2-3 미크론5)로 인해 SD-OCT는 망막 층 두께의 작은 변화도 감지 할 수 있습니다. 이러한 유형의 분석은 질병 진행에 필수적인 정보를 제공하고 시력 관련 장애에 대한 신경 보호 방법 및 치료의 효능을 평가할 수 있습니다.
SD-OCT는 조직 학적으로 구조를 검사하는 비 침습적 대안이며, 둘은 상관 관계가있는 것으로 나타났습니다6. SD-OCT는 세포 분해능에 도달하지 않지만 동물에 대한 종단 연구를 허용합니다. 이는 특정 시점에서 동물을 안락사시키는 것과는 대조적으로 시간이 지남에 따라 개별 동물에서 질병 진행을 추적 할 수 있기 때문에 유리합니다. 이미징 기술이 계속 향상됨에 따라 SD-OCT 기술도 발전하여 향상된 이미지 품질과 망막 혈관 기능과 같은 생물학적 과정을 세부적으로 평가할 수 있는 기능을 제공할 것입니다. 1991년 등장 이래에도 SD-OCT 기술은 해상도, 속도 및 감도7에서 엄청난 발전을 이루었습니다.
본 연구는 SD-OCT 시스템을 활용하여 망막 변성, 녹내장 및 당뇨병 성 망막증의 설치류 모델에서 망막 층의 변화를 정량화합니다. 여기에 사용된 SD-OCT 시스템은 저전력, 근적외선을 활용하여 깊이 해상도 이미지를 실시간으로 획득, 처리 및 저장하는 푸리에 영역 OCT 시스템입니다. SD-OCT 시스템은 800nm 파장 대역에서 확장된 깊이 이미징 기능을 제공하여 8mm 깊이 및 4μm 해상도를 제공합니다. 푸리에 도메인 검출에서, 조직으로부터의 산란광과 기준 경로 사이의 간섭 신호는 산란 강도8의 축 방향 스캔 및 / 또는 축 방향 깊이 프로파일을 구성하기 위해 푸리에 변환된다. 여기의 연구를 위해 OCT 빔은 축 방향 스캔을 연속적으로 획득하면서 원하는 망막 구조 위로 스캔됩니다. 일반적으로 스캔 패턴은 래스터 스캔 패턴을 사용하여 2D 단면 이미지에 해당하는 선형 1차원 스캔 라인(A-스캔)의 모음으로 2차원 그리드(B-스캔)를 획득합니다. 마우스의 근시에 초점을 맞춘 연구의 경우이 시스템은 안구 구조의 차원 (예 : 각막 두께, 렌즈 두께, 유리체 챔버 깊이 및 축 길이)을 측정하는 데에도 사용됩니다.
현재 시스템을 통해 사용자는 자신의 프로토콜을 설계하여 관심 있는 안구 구조에 따라 맞춤화하고 선택할 수 있는 스캔을 생성할 수 있습니다. 이러한 사용자 정의 프로토콜에 포함된 주요 스캔은 이 이미징 기술을 사용자 친화적으로 만듭니다. 이미지 분석을 위해 우리는 수학적 모델링 프로그램에서 맞춤형 프로그래밍을 개발했습니다. SD-OCT는 안구 구조의 병리학적 변화를 비침습적으로 식별 및 정량화하고 시력 관련 질병 진행을 모니터링하는 강력한 도구입니다.
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Protocol
설명 된 모든 절차는 애틀랜타 재향 군인 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드 (NIH 간행물, 8판 , 2011 년 업데이트)를 준수했습니다.
참고: 아래 프로토콜을 개발하는 데 사용되는 SD-OCT 시스템은 재료 표에 설명되어 있습니다. 일부 절차는 이 특정 시스템과 관련이 있지만 전체 접근 방식은 다른 OCT 장치 및 동물 모델에 맞게 조정할 수 있습니다. 또한, 우리 실험실에서 이러한 프로토콜은 생쥐와 쥐에서 일반적으로 사용됩니다. 그러나 전반적인 접근 방식은 개인이 장치에 올바른 렌즈와 기능을 가지고 있는 경우 다양한 동물 모델 및 SD-OCT 장치에 채택될 수 있습니다.
1. 광학 간섭 단층 촬영 장비 설정
- SD-OCT 소프트웨어(재료 표)를 엽니다.
- OCT, 연구 및 치료 부문을 복용하는 사람(해당되는 경우)을 정의합니다. 연구원이 나중에 데이터 분석 중에 원하는 스캔을 검색하는 데 도움이 되는 방식으로 이러한 범주의 이름을 지정합니다.
- 환자/시험 탭에서 시험 시험관을 클릭합니다. 심사관의 이름을 선택합니다. Setup Examiners & Physicians 버튼을 사용하여 새 심사관을 추가합니다.
- 스터디 이름을 클릭하여 스터디를 정의합니다. 스터디 탭을 클릭하여 새 스터디를 추가하거나 기존 스터디에서 처리를 수정합니다. 치료대 선택의 오른쪽을 클릭하여 치료대를 선택합니다.
- 전체 그룹에 대한 새 시점을 추가하는 데 사용되는 환자 추가 버튼을 클릭합니다. 창이 나타나면 ID 번호, 이름 및 성을 입력합니다. 남성 또는 여성을 선택합니다. 생년월일을 입력합니다.
- 시험 추가 버튼을 클릭하여 개별 쥐를 추가합니다. 쥐를 식별하려면 시험을 클릭하십시오. 시험 편집을 클릭합니다. 메모 입력 상자에 ID 번호를 입력합니다. 변경 내용 저장 버튼을 클릭합니다.
- 장치에 적절한 렌즈를 부착하고(그림 1B), 소프트웨어에서 해당 구성을 선택하고, 관련 기준 암 위치에서 다이얼합니다.
참고: 설명된 SD-OCT 시스템에는 맞춤형 렌즈, 사전 설정 스캔 패턴 및 이미징되는 동물 종 및 눈 영역(망막 또는 각막, 마우스 또는 쥐)에 특정한 참조 암 설정이 있습니다. 이러한 세부 사항 중 일부는 설명된 SD-OCT 시스템에만 해당됩니다(자료 표 참조). 예를 들어, 모든 장치가 기준 암 경로 길이를 수동으로 조정할 수 있는 것은 아닙니다. - 환자/검사 탭에서 강조 표시된 검사를 두 번 클릭하여 이미징 탭으로 이동하여 이미징을 시작하거나 이미징 탭을 클릭합니다. 기본 스캔이 있는 경우 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 삭제합니다.
- 목록에서 프로토콜 선택 버튼을 클릭하여 사전 설정된 스캔 프로토콜을 로드합니다. 또는 개별 검사를 추가합니다.
- 녹내장 및 당뇨병 성 망막증의 쥐 모델과 망막 변성의 마우스 모델의 경우 4 개의 이미지 (2 개의 OD 및 2 개의 OS 스캔)로 구성된 사전 설정을 선택하십시오. 마우스 근시의 경우 8개의 이미지(4개의 OD 및 4개의 OS 스캔)로 구성된 사전 설정을 선택합니다.
참고: 사전 설정된 이미징은 섹션 3에서 자세히 설명합니다. 이것은 각 실험실이 현장 설치 중에 스스로 또는 제조업체와 함께 만드는 것입니다.
2. 동물을 마취
- 마취제를 투여하십시오.
- 복강 주사를 통해 케타민 (60 mg / kg)과 자일 라진 (7.5 mg / kg)으로 쥐를 마취하십시오.
- 복강 주사를 통해 케타민 (80 mg / kg)과 자일 라진 (16 mg / kg)으로 마우스를 마취하십시오.
- 동물이 완전히 마취 될 때까지 기다렸다가 발가락 꼬집음에 반응하지 마십시오.
- 동공 확장 방울 (1 % 트로피 아미드)을 투여하십시오. 이미징하기 전에 동공이 확장될 때까지 기다리십시오.
참고: 동공의 확장은 시야를 증가시키지만 필수 사항은 아닙니다. 눈을 마비시키는 국소 (각막) 마취제 (0.5 % 테트라 카인)는 눈에 닿을 경우 (예 : 콘택트 렌즈를 적용하거나 가이드를 사용하는 경우) 사용해야합니다. 가이드는 스캔 헤드 위에 배치되는 장치로 초보자가 눈과 스캔 헤드를 정렬하는 데 도움이 됩니다. - 설치류를 마취 한 후 설치류를 3 차원 공간에서 동물을 회전 할 수있는 설치류 정렬 시스템에 놓습니다 (그림 1A, 1C 및 1D). 열 지원을 제공하십시오.
참고 : 현재 우리는 SD-OCT 장치로 설계 및 판매되는 생쥐와 쥐를위한 설치류 정렬 시스템을 사용합니다. - 액체(예: 식염수 또는 인공 눈물)를 바르고 눈에 윤활유를 바르십시오. 스캔 사이에 눈의 광학적 특성이 유지되도록 이미징 중에 눈이 건조하지 않도록 합니다(각막이 젖었을 때 망막이 명확하게 보일 수 있음).
- 첫 번째 눈을 스캔할 때 반대쪽 눈이 건조해지지 않도록 습기를 유지하십시오.
- 눈에 윤활유가 너무 많거나 너무 적으면 이미지 품질에 영향을 미치므로 이미징 직전에 섬세한 작업 물티슈를 사용하여 과도한 식염수를 제거하십시오.
알림: 멸균 윤활제 젤의 사용은 이미징을 방해할 수 있으므로 OCT 동안 사용하지 않는 것이 좋습니다. 필요한 경우 절차 후에 멸균 윤활제 젤을 사용할 수 있습니다. 콘택트 렌즈를 적용하여 테스트 내내 눈에 적절한 수분을 공급할 수도 있습니다. 우리의 경험에서, 콘택트 렌즈는 이미지 품질에 현저한 개선을 제공하지 않았지만 콘택트 렌즈는 이미징 세션 동안 각막 건조의 위험을 줄이는 데 도움이됩니다.
3. 설치류 OCT 영상
- 한쪽 눈(OS 또는 OD)으로 시작하고 반대쪽 눈을 이미지화합니다.
- 설치류 정렬 시스템의 두 회전 동작을 사용하여 시선이 수평이 되고 OCT 렌즈의 축을 내려다보도록 동물을 배치합니다(그림 1D).
- 자유 실행 모드에서 OCT를 사용하여 데이터 수집을 위해 망막의 방향을 지정합니다. 처음에는 조준 모드(조준 버튼 클릭)를 사용하여 수평 및 수직 B-스캔을 실시간으로 연속적으로 표시합니다.
- 망막이 보일 때까지 스캔 헤드를 눈에 더 가깝게 이동합니다(마우스와 쥐 망막 렌즈는 고정 초점이므로 렌즈를 눈 쪽으로 이동하면 망막 깊숙이 초점을 맞춥니다). 그런 다음 설치류 정렬 시스템을 사용하여 동물의 위치를 위/아래로 조정하고 회전/비틀어 시신경 헤드를 중앙에 배치하고 수평 스캔을 수평으로 만들고 수직 스캔을 수직으로 만듭니다(그림 1A).
- 망막 이미지가 평평하고 구부러지지 않도록 작동 거리를 조정하십시오.
- 참조 암 위치를 조정하여 이미지가 디스플레이 창 상단 근처에 유지되도록 합니다. 너무 멀리 밀어 넣지 않으면 눈 이미지가 저절로 뒤집히지 않도록 주의하십시오.
- 망막 영상
- 녹내장, 망막 변성 및 당뇨병성 망막증 모델의 경우: 평균화를 위해 1000 x 1000 x 1(A 스캔 x B 스캔 x 반복 B 스캔)로 구성된 볼륨 스캔을 정의합니다. 쥐의 경우 3 x 3 mm의 볼륨 스캔을하십시오. 마우스에서 1.5 x 1.5mm 볼륨 스캔을 수행합니다.
- 시신경을 수평 및 수직 접근의 중앙에 배치하여 볼륨 스캔이 중앙에 오도록 합니다. 시간을 내어 시신경 헤드가 스캔의 중심에 있고 비강-측두엽 및 상하축을 따라 직선인지 확인합니다(그림 2). 필요한 경우 스캔하고 다시 중앙에 배치하여 정확히 중앙에 있는지 확인합니다. 시신경 헤드가 중앙에 있고 두 축을 따라 정렬될 때까지 필요에 따라 이 스캔을 반복합니다. 스냅샷 버튼을 클릭하여 사진을 찍습니다.
참고: 일부 SD-OCT 장치에는 기준 암으로 광원에서 눈의 거리를 조정하여 눈의 곡률을 광학적으로 조작(예: 이미지가 병합됨)할 수 있는 옵션이 있습니다. 망막층을 통해 직접 두께를 측정할 때 이미지를 평평하게 하고 중앙에 배치하여 전후방 방향을 따라 정확도를 높이는 것이 좋습니다. - 저장 버튼을 클릭하여 이미지를 저장합니다.
- 시신경두를 중심으로 1000 x 4 x 20의 방사형 스캔을 수행합니다(A-스캔 x B-스캔 x 반복 B-스캔). 반복적인 B 스캔을 사용하여 눈이나 망막의 이미지 선명도를 향상시켜 데이터 분석 중에 눈 영역 또는 망막 층을 해석하는 데 도움이 됩니다.
참고: 다시 말하지만, 쥐의 경우 이 방사형 스캔은 3mm이고 생쥐의 경우 방사형 스캔은 1.5mm입니다. - 이미지를 저장합니다.
- 반대쪽 눈에서 3.1-3.2.5단계를 반복합니다.
- 축 길이 측정
- 쥐 근시와 같이 눈 전체를 영상화하는 프로젝트의 경우 눈 전체를 세 번 스캔하고 각 눈에 대해 한 번의 망막 스캔을 수행합니다. 500 x 20 x 1이고 눈의 전체 직경을 포함하는 방사형 스캔으로 구성된 사전 설정을 선택합니다.
참고: 이 설정은 각막에서 맥락막까지 마우스 눈의 전체 길이의 이미지를 제공합니다. - 시야에서 눈과 망막의 중앙을 중앙에 놓습니다. 방사형 스캔(전체 눈 스캔): 1000 x 5 x 2인 선형 B 스캔과 동일한 위치에서 1000 x 5 x 2의 추가 선형 B 스캔 2개를 수행합니다. 이미지를 저장합니다.
- 그런 다음 원하는 경우 확대하여 1000 x 20A 스캔 x B 스캔으로 구성된 3.2의 설명과 유사한 볼륨 또는 직사각형 스캔(망막 스캔)을 수행합니다. 볼륨 스캔을 저장합니다.
- 반대쪽 눈에서 3.3-3.3단계를 반복합니다.
참고: 축 방향 길이 측정은 현재 시스템의 이미징 창이 더 큰 눈을 캡처할 만큼 충분히 크지 않기 때문에 작은 눈(마우스 또는 더 작은)에서만 가능합니다.
- 쥐 근시와 같이 눈 전체를 영상화하는 프로젝트의 경우 눈 전체를 세 번 스캔하고 각 눈에 대해 한 번의 망막 스캔을 수행합니다. 500 x 20 x 1이고 눈의 전체 직경을 포함하는 방사형 스캔으로 구성된 사전 설정을 선택합니다.
4. 이미징 후 단계
- 저장된 데이터를 클라우드에 저장하는 것은 데이터 관리에 좋은 방법이며 나중에 분석하기 위해 쉽게 액세스할 수 있도록 합니다. 수학적 모델링 프로그램(재료 표)에서 개발된 맞춤형 소프트웨어로 데이터 분석을 수행합니다.
- 설치류 정렬 시스템에서 설치류를 제거하고 자일라진의 효과를 역전시키기 위해 아티파메졸(쥐와 생쥐의 경우 1mg/kg)을 복강 주사하여 설치류가 더 빨리 깨어나도록 합니다.
- 설치류가 저온의 가열 패드에서 회복되도록하십시오. 필요에 따라 식염수를 추가로 투여하십시오. 설치류가 완전히 회복되면 집 케이지로 되돌립니다.
- 프로그램을 닫고 OCT를 끕니다.
5. OCT 이미지의 후처리
- 특정 OCT 요구 사항에 맞게 수학적 모델링 프로그램에서 개발된 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다(예: 이미지를 수동으로 표시하여 관심 영역의 두께 측정).
- 이미지의 목적(마우스 망막, 쥐 망막 또는 근시/축 길이)에 따라 다음 세 가지 프로그램 중 하나를 사용합니다.
- 망막을 처리하려면 로드할 OCT 스캔을 선택합니다. 먼저 간단한 클릭으로 시신경 헤드의 중심을 정의하십시오.
- 프로그램이 시신경 머리의 양쪽에서 거리를 정의하는 수직선을 생성하는 것을 지켜보십시오. 쥐 망막에서이 선은 시신경 머리의 중심에서 0.5mm 및 1.2mm 떨어져 있으며, 현재 분석 된 방사형 B 스캔에 따라 눈의 비강 측두엽 및 하부 상축을 나타내는 총 4 개의 수직선이 있습니다.
참고: 마우스 망막에서 이 수직선은 시신경 머리 중심에서 0.25mm 및 0.5mm에 있습니다. - 각 선을 따라 다음 레이어를 묘사합니다.
망막 신경 섬유층 (RNFL), 내부 플렉시 폼 층 (IPL), 내부 핵 층 (INL), 외부 플렉시 폼 층 (OPL), 외부 핵 층 (ONL), 외부 제한막 (ELM), 내부 세그먼트 / 외부 세그먼트 (IS / OS), 망막 색소 상피 (RPE) 및 총 망막 두께.
참고: 방사형 스캔은 일반적으로 열릴 때 비강/측두 및 상급/하부 레이블이 없습니다. 스캔들은 n/t 및 s/I 배향을 갖도록 생성될 수 있고, 특히 이들 스캔들은 나중에 분석된다. - 이미지가 묘사되고 프로그램이 닫힌 후 데이터 분석을 위해 이러한 측정값을 스프레드시트 소프트웨어로 내보냅니다.
- 5단계의 길이 및 두께 값을 사용하여 그룹 간에 비교(예: 지역차(n/t/s/i) 또는 종단 변경이 있는지 확인)합니다.
- 망막 측정의 경우 먼저 0.5mm 및 1.2mm 거리에서 비강-측두엽 및 하부-상축에 차이가 있는지 확인합니다.
참고: 사분면의 차이가 관찰되지 않으면 0.5mm 및 1.2mm 측정값을 함께 평균화할 수 있습니다. 이것은 0.25mm 및 0.5mm에서만 마우스 망막 스캔에 대한 유사한 접근 방식입니다. - 근시 연구의 경우이 프로그램을 사용하여 눈의 광축을 따라 안구 매개 변수를 평가하십시오. 수학적 모델링 프로그램을 엽니다. 먼저 로드할 이미지를 선택합니다.
- 이미지를 로드한 후 각 스캔(방사형 및 B 스캔)을 수동으로 표시합니다. 각막, 렌즈, 유리체 및 망막의 전방 및 후방 가장자리를 표시하여 프로그램이 각막 두께, 렌즈 두께, 전방 및 유리체 챔버 깊이, 총 망막 두께, 총 축 길이를 계산하도록합니다.
- 마킹 후 저장 메뉴를 표시하는 프로그램을 종료합니다. 묘사된 값을 스프레드시트 소프트웨어에 저장하고 세 개의 개별 스캔을 함께 평균화합니다.
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Representative Results
SD-OCT는 안구 치수를 안정적으로 측정 할 수 있도록 고품질 이미지를 얻으면 성공한 것으로 간주됩니다. 여기에서는 망막 변성, 녹내장, 당뇨병 성 망막증 및 근시 모델을 사용하여 SD-OCT의 다양한 용도를 설명합니다.
광-유도성 망막 변성 (LIRD) 모델에서, 밝은 빛(10,000 lux)에의 노출은 망막에서 광수용체 세포의 퇴행을 유도한다9. 대표적인 SD-OCT 이미지는 손상되지 않은 (대조군) 마우스와 비교하여 LIRD BALB / c 마우스의 망막에서 광 수용체 세포체를 포함하는 더 얇은 외부 핵층을 보여줍니다 (그림 3A & 3B). 망막 층 두께를 정량화 한 후, 총 망막 두께 (그림 3C), 외부 핵 층 두께 (그림 3D) 및 IS/OS 두께 (그림 3E)에 대해 손상되지 않은 마우스와 LIRD 마우스 간의 유의 한 차이가 관찰되었습니다.
녹내장 손상을 실험적으로 모델링하기 위해 안구 고혈압 (OHT) 모델을 사용했습니다 10. 간단히 말해서, 브라운 노르웨이 쥐 (n = 35)는 한쪽 눈의 윤부 정맥에 고장성 식염수를 주사하고 반대쪽 눈은 내부 대조군역할을했습니다 11. 녹내장 연구를 위해 망막 신경 섬유층(RNFL) 두께를 정량화했습니다. OHT의 8 주 후, 우리는 시신경 부항을 포함하여 시신경 머리에서 뚜렷한 리모델링을 관찰했습니다 (그림 4A & B). 그런 다음 RNFL 두께를 정량화하고 기준선 측정과 비교하여 OHT 8주 후 RNFL 박리화를 발견했습니다(그림 4C).
당뇨병성 망막증을 모델링하기 위해 빠르면 2-3주령에 고혈당증이 발생하는 비만이 아닌 다유전자 당뇨병 모델인 Goto-Kakizaki 쥐를12,13마리에 사용했습니다. Goto-Kakizaki 쥐와 Wistar 쥐 (비 당뇨병 대조군)의 망막은 SD-OCT를 사용하여 이미지화되었습니다 (그림 5A & 5B). 6주령에, RNFL 및 총 망막 두께는 중심 망막(데이터는 표시되지 않음) 및 말초 망막의 Wistar 쥐와 비교하여 Goto-Kakizaki 쥐에서 감소하였다(그림 5C&5D). 가장 큰 차이는 망막의 하부 및 측두엽 사분면에서 관찰되었습니다 (그림 5C & 5D).
근시에 대한 마우스 모델을 평가하기 위해, 축 방향 길이를 Bmal1-/- 마우스에서 측정하였다. Bmal1은 일주기 리듬이 근시 발달에 역할을 할 수 있기 때문에 관심있는 시계 유전자입니다14,15. Bmal1-/- 마우스 눈(그림 6B)의 축 길이는 OCT 이미지에서 야생형 눈(그림 6A)보다 눈에 띄게 깁니다. 축 길이의 정량화는 Bmal1-/- 마우스가 84 일령에 축 길이가 상당히 길다는 것을 확인시켜 (그림 6C), 시계 유전자의 부족이 근시 발달에 기여한다는 것을 보여줍니다.
이 프로토콜은 망막 변성, 녹내장, 당뇨병 성 망막증 및 근시 모델에서 안구 구조의 이미지를 생성했습니다. 이미지는 외부 핵층, 망막 신경 섬유 층, 총 망막 두께 및 축 길이를 포함한 안구 치수를 정량화 할 수있을 정도로 충분한 품질이었습니다. 결과는 SD-OCT를 사용하여 생체 내에서 안구 구조의 치수에 상당한 차이가 관찰 될 수 있음을 보여주었습니다.
그림 1: SD-OCT 장비 설정
(A) 설치류 정렬 시스템 및 OCT 스캔 헤드 사진. (B) 쥐와 쥐 OCT 렌즈의 사진. (C) 3차원 공간에서 이동하는 능력을 보여주는 마우스 설치류 정렬 시스템의 그림. (D) 설치류 정렬 시스템, 특히 움직임을 제어하는 손잡이를 닫습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: SD-OCT 샘플 스캔
볼륨 또는 방사형 스캔을 수행하기 직전의 마우스 망막의 라이브 스캔 사진. (A)는 비강-측두엽 정렬을 나타내고 (B)는 상하부 정렬을 보여줍니다. 이 두 이미지의 망막이 각각의 수직 또는 수평면에서 직선이고 시신경이 두 이미지의 중심에 있으면 SD-OCT 이미지를 획득합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: SD-OCT를 사용하여 망막 변성 마우스 모델에서 시간 경과에 따른 광수용체 층의 얇아짐을 추적합니다.
(A) BALB/c 마우스의 손상되지 않은(대조군) 망막의 대표적인 SD-OCT 스캔. (B) 광 유도 망막 변성 (LIRD) BALB / c 마우스의 망막에 대한 대표적인 SD-OCT 스캔. (씨-에) 손상되지 않은 LIRD Balb/c 마우스에서 총 망막 두께(C), 외부 핵층(ONL) 두께(D) 및 내부 세그먼트/외부 세그먼트(IS/OS) 두께(E)의 정량화. SEM± 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: SD-OCT를 사용하여 망막 신경 섬유층 두께의 감소를 측정하고 녹내장 쥐 모델에서 안구 고혈압을 유도한 후 시신경 부항을 관찰했습니다.
(A) 안구 고혈압을 유도하기 전에 채취한 쥐의 눈에서 망막 및 시신경 두의 대표적인 SD-OCT 스캔(기준선: OHT). (B) OHT의 8주 후 동일한 래트 망막의 SD-OCT 스캔(녹내장 실험 모델). (C) OHT 눈과 비교하여 기준선에서 망막 신경 섬유층 (RNFL) 두께의 정량화. SEM± 평균. 이 데이터는 Feola et al.11에서 수정되었습니다.11이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: SD-OCT를 사용하여 당뇨병 쥐 모델에서 총 망막 두께 감소와 특정 망막 층의 두께 감소를 관찰했습니다.
(A) Wistar (야생형 대조군) 래트로부터의 망막의 대표적인 SD-OCT 스캔. (B) 고토카키자키(당뇨병) 쥐의 망막에 대한 대표적인 SD-OCT 스캔. 망막 층 : 망막 신경 섬유층 (RNFL), 내부 플렉시 폼 층 (IPL), 내부 핵 층 (INL), 외부 플렉시 폼 층 (OPL), 외부 핵 층 (ONL), 외부 제한막 (ELM), 내부 세그먼트 / 외부 세그먼트 (IS / OS), 망막 색소 상피 (RPE) 및 총 망막 두께 (TRT). (씨디) 중심선이 평균이고 음영 영역이 4 사분면 모두에 대한 SEM 인 Wistar 및 Goto-Kakizaki 망막에서 RNFL (C) 및 총 망막 두께 (D)의 정량화 (Sup, Superior; 임시, 시간; Inf, 열등한; Nas, 비강) 말초 망막 (시신경 머리에서 1.2mm). ** p < 0.01, *** p < 0.001. 이 그림은 Allen et al.13에서 수정되었습니다.13이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: SD-OCT를 사용하여 근시 마우스 모델에서 축 방향 길이 평가.
84일령의 야생형(A) 및 Bmal1-/ - (B) 마우스 눈의 전체 눈 SD-OCT 이미지. Bmal1-/- 마우스의 눈은 야생형 눈(C)보다 축 길이가 훨씬 깁니다. AL : 축 길이; RT: 망막 두께; VCD: 유리질 챔버 깊이; LT: 렌즈 두께; ACD: 전방 깊이; CT : 각막 두께. 긴 수직선은 야생형 눈의 축 방향 길이 경계 (수평선으로 표시된 위쪽과 아래쪽)를 나타냅니다. 짧은 화살표는 Bmal1-/- 눈의 후축 길이 표시를 나타냅니다. SEM± 평균. 각 이미지 (A & B)의 중간에있는 중심선은 수직 채도 아티팩트입니다. 일반적으로 눈 중앙에 맞추는 가이드로 사용되지만 스캔이 잘 정렬되면 사라지게 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
생체 내 안구 구조의 고해상도 이미징을 통해 시간 경과에 따른 망막 및 안구 변화를 평가할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 SD-OCT는 망막 변성, 녹내장, 당뇨병 성 망막증 및 근시 모델에서 생체 내 안구 구조의 차이를 포착하는 것으로 입증되었습니다.
SD-OCT를 수행할 때 가장 중요한 측면은 망막 또는 기타 관심 있는 안구 구조의 선명한 이미지를 얻는 것입니다. 망막이 완벽하게 중앙에 있고 투명도가 뛰어나지 않도록 시간을 할애하는 것이 중요합니다. 설치류의 심한 호흡은 시끄러운 이미지를 초래할 수 있습니다 (망막은 실제로 화면에서 흔들리는 것을 볼 수 있습니다). 이것은 마취 투여 후 동물이 완전히 의식을 잃지 않은 경우에 때때로 발생합니다. 이 문제를 해결하기 위해 여러 B 스캔의 평균을 구하여 망막층의 경계가 어디에 있는지 시각화한 다음 최상의 단일 B 스캔 이미지를 분석할 수 있습니다.
또 다른 일반적인 실수는 눈이 너무 건조하거나 너무 젖었다는 것입니다. 이것은 식염수를 한 방울 더 바르고 실험실 물티슈로 닦아내고 이미지의 선명도가 향상되었는지 평가하여 쉽게 확인할 수 있습니다. SD-OCT 이미지에서 망막층 두께를 마킹할 때 고려해야 할 사항은 RNFL을 마킹하는 방법입니다. 일부 설치류 OCT에서 RNFL과 GCL을 구별하는 것이 가능하지만 종종 이 두 층은 구별할 수 없습니다. 일관성을 위해 전체 RNFL 영역(RNFL + GCL, 보이는 경우)을 RNFL로 표시합니다. 일부 연구에서는 RNFL과 GCL을 별도의 층으로 보고하거나 GCL과 내부 플렉시폼 층16,17,18을 결합하지만, 이 연구는 일반적으로 설치류보다 훨씬 큰 눈을 가진 인간에서 수행되었습니다. RNFL 두께의 보고는 설치류 연구11,13,19,20에서 더 일반적입니다. 또 다른 중요한 문제는 마킹의 아주 작은 변화가 특히 측정되는 구조의 크기가 작기 때문에 근시에서 매우 큰 변화를 일으킬 수 있다는 것입니다. 예를 들어, 측정값의 6μm 차이는 굴절 오차21의 변화 디옵터와 같습니다. 약간의 변화가 측정에 큰 차이를 만들기 때문에 이미지 선명도가 중요합니다.
이 프로토콜과 일반적으로 SD-OCT의 한계는 좋은 이미지를 위해 투명한 안구 매체가 필요하다는 것입니다. 예를 들어, 각막 병변, 수정체 이상 및 백내장으로 인해 사용자가 선명한 이미지를 얻지 못할 수 있습니다. 이것은 당뇨병성 망막증 영상화에서 문제이며, 특히 백내장이 당뇨병성 설치류에서 흔히 발생하기 때문이다(22). 백내장이나 기타 안구 문제가 작은 경우 때때로 스캔 헤드를 그 주위로 조작할 수 있습니다. 더 큰 안구 매체 장애의 경우 망막 OCT 이미지를 얻을 수 없습니다. 이러한 망막은 망막 조직학이 투명한 안구 매체에 의존하지 않기 때문에 조직학을 사용하여 여전히 조사할 수 있습니다.
또 다른 한계는 삼출물 및 출혈과 같은 과반사 병변과 주요 망막 혈관이 기본 망막 구조의 그림자를 초래하여 기본 형태의 세부 사항이 손실된다는 사실입니다. 맥락막 두께가 400μm 이상인 맥락막 신생혈관막 및 당뇨병성 망막병증/황반부종을 나타내는 경우 근본적인 병리와 맥락막23을 식별하기 어려웠습니다. 또한 SD-OCT는 특정 위치에서 두께를 평가하는 데만 사용할 수 있습니다. SD-OCT는 또한 맥락막 이미징 및 전체 눈의 이미징을위한 침투 깊이가 제한되어 있습니다 (전체 눈은 마우스에서 이미징 할 수 있지만 큰 동물에서는 이미징 할 수 없음). 또 다른 한계는 형광등 또는 기타 마커를 주사 레이저 검안경 (SLO)과 마찬가지로 SD-OCT와 함께 사용할 수 없다는 것입니다. 그러나 일반적인 SLO 장치는 SD-OCT에서 관찰되는 것과 동일한 용이성으로 단면의 망막층을 시각화하는 것을 허용하지 않습니다. 마지막으로, SD-OCT의 해상도는 완벽하지 않습니다. 그러나 SD-OCT 초기에 사용 가능한 해상도보다 훨씬 개선되었으며 시간이 지남에 따라 계속 개선되고 있습니다.
결론적으로, SD-OCT 기술의 장점과 중요성은 안구 구조의 생체 내 이미징과 시간 경과에 따른 안구 치수 변화의 정량적 추적을 허용하고 빠른 스캔 속도로 이 이미징을 수행한다는 것입니다. SD-OCT의 고해상도로 인해 육안으로 관찰할 수 없는 미묘한 차이를 감지하는 데 사용할 수 있습니다(그림 4 및 그림 5). 또한, SD-OCT는 다수의 질병 및 손상 모델에서 눈의 다중 파라미터를 측정하는데 유용한 도구이다. 이 프로토콜에서만 SD-OCT를 사용하여 망막 변성 및 당뇨병 성 망막증 모델에서 망막 두께, 녹내장 모델에서 망막 두께 및 부항, 근시 모델에서 축 길이를 측정했습니다. SD-OCT는 또한 각막 곡률24을 측정하고, 폭발 및 외상성 뇌 손상 19,25,26 후 망막 변화를 평가하고, 연령 관련 황반 변성27의 병리를 확인하고, 안구 주사28 및 망막하 임플란트29와 같은 보철 장치의 망막 배치 중 및 후의 망막 건강을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 나무 송곳니(30) 및 비인간 영장류(31)와 같은 다른 동물 모델에서도 사용될 수 있다. SD-OCT는 또한 사분면 (상급, 하위, 비강, 측두엽) 및 위치 (중앙 대 주변)를 기반으로 망막 병리를 국소화하는 데 사용할 수 있습니다. 미래의 SD-OCT 장치는 훨씬 더 높은 해상도를 달성할 것입니다. 추가적으로, OCT 혈관조영술은 적혈구가 망막 혈관구조를 통해 이동할 때 표면으로부터 레이저 광의 반사를 이용함으로써 망막 및 맥락막 미세혈관구조의 이미징을 가능하게 한다(32,33).
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 재향 군인회 재활 R&D 서비스 경력 개발 상(CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928)을 RSA로, 공로상(RX002615) 및 연구 경력 과학자상(RX003134)을 MTP로, AJF에 경력 개발 상(CDA-2, RX002342), MTP에 EY028859, NEI 코어 보조금 P30EY006360, 실명 예방 연구 및 실명 퇴치를 위한 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% tropicamide | Sandoz | Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59 | |
| 0.5% tetracaine | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| AIM-RAS G3 120 V | Leica Bioptigen | 90-AIMRAS-G3-120 | Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice |
| Celluvisc gel | REFRESH CELLUVISC | #4554; NDC-0023-4554-30 | |
| G3 18 mm Telecentric Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-18 | |
| G3 Mouse Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-M | |
| G3 Rat Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-R | |
| heating pad | Fabrication | 11-1130 | |
| InVivoVue software | Leica Bioptigen | Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system | |
| MATLAB | Mathworks | mathematical modeling program | |
| Mouse/Rat Kit | Leica Bioptigen | 90-KIT-M/R | Mouse/rat rodent alignment system |
| saline | ADDIPAK | 200-39 | |
| System Envisu R4300 VHR 120 V | Leica Bioptigen | 90-R4300-V1-120 | SD-OCT system |
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