Summary
Her beskriver vi bruken av spektral-domene optisk koherenstomografi (SD-OCT) for å visualisere retinale og okulære strukturer in vivo i modeller av retinal degenerasjon, glaukom, diabetisk retinopati og nærsynthet.
Abstract
Spektral-domene optisk koherens tomografi (SD-OCT) er nyttig for å visualisere retinale og okulære strukturer in vivo. I forskning er SD-OCT et verdifullt verktøy for å evaluere og karakterisere endringer i en rekke retinale og okulære sykdoms- og skademodeller. I lysinduserte retinal degenerasjonsmodeller kan SD-OCT brukes til å spore tynning av fotoreceptorlaget over tid. I DrDeramus-modeller kan SD-OCT brukes til å overvåke redusert retinal nervefiberlag og total retinal tykkelse og å observere optisk nervekopping etter å ha indusert okulær hypertensjon. Hos diabetiske gnagere har SD-OCT hjulpet forskere med å observere redusert total retinal tykkelse, samt redusert tykkelse av spesifikke retinale lag, spesielt retinal nervefiberlaget med sykdomsprogresjon. I musemodeller av nærsynthet kan SD-OCT brukes til å evaluere aksiale parametere, for eksempel aksiale lengdeendringer. Fordeler med SD-OCT inkluderer in vivo-avbildning av okulære strukturer, evnen til kvantitativt å spore endringer i okulære dimensjoner over tid, og dens raske skannehastighet og høye oppløsning. Her beskriver vi metodene for SD-OCT og viser eksempler på bruk i vårt laboratorium i modeller av retinal degenerasjon, glaukom, diabetisk retinopati og nærsynthet. Metoder inkluderer anestesi, SD-OCT-avbildning og behandling av bildene for tykkelsesmålinger.
Introduction
Spektral-domene optisk koherenstomografi (SD-OCT) er en presis, høyoppløselig bildebehandlingsmodalitet som gjør det mulig for klinikere og forskere å undersøke okulære strukturer ikke-invasivt. Denne avbildningsteknikken er basert på interferometri for å fange tredimensjonale retinale bilder in vivo på en mikrometerskala 1,2. Det har blitt en av de mest brukte bildebehandlingsmodalitetene i synsforskning og i klinikken på grunn av enkel påvisning og nøyaktighet av patologiske egenskaper som strukturelle defekter og / eller tynning av retinale lag og subretinalvæske3. I forskning ved hjelp av dyremodeller av synsrelaterte lidelser har SD-OCT gitt viktige ikke-invasive analyser av sammenhenger mellom struktur og funksjon og deres histopatologiske opprinnelse4. På grunn av oppløsningen (opptil 2-3 mikron, avhengig av dybden i øyet5), har SD-OCT evnen til å oppdage selv små endringer i retinallagtykkelsen. Denne typen analyse kan gi viktig informasjon for sykdomsprogresjon og vurdere effekten av nevrobeskyttende metoder og behandlinger for synsrelaterte lidelser.
SD-OCT er et ikke-invasivt alternativ til å undersøke struktur histologisk, og de to har vist seg å være korrelert6. Mens SD-OCT ikke når cellulær oppløsning, tillater det longitudinelle studier hos dyr. Dette er fordelaktig fordi sykdomsprogresjon kan spores hos individuelle dyr over tid i motsetning til å måtte avlive dyr på bestemte tidspunkter. Etter hvert som bildebehandlingsteknikkene fortsetter å forbedres, vil SD-OCT-teknologien også utvikle seg, noe som gir forbedret bildekvalitet, samt muligheten til å vurdere biologiske prosesser som retinal blodkarfunksjon i detalj. Selv siden adventen i 1991 har SD-OCT-teknologien sett store fremskritt innen oppløsning, hastighet og følsomhet7.
Denne studien benytter et SD-OCT-system for å kvantifisere endringer i retinale lag i gnagermodeller av retinal degenerasjon, glaukom og diabetisk retinopati. SD-OCT-systemet som brukes her er et Fourier-domene OCT-system som bruker laveffekt, nær-infrarødt lys for å anskaffe, behandle og lagre dybdeoppløste bilder i sanntid. SD-OCT-systemet har utvidet dybdeavbildningsevne i 800 nm bølgelengdebåndet, noe som gir 8 mm dybde og 4 μm oppløsning. I Fourier-domenedeteksjon blir interferenssignalet mellom spredt lys fra vevet og en referansebane Fourier transformert for å konstruere aksiale skanninger og/eller aksiale dybdeprofiler med spredt intensitet8. For studiene her skannes OCT-strålen over ønsket retinalstruktur mens man seriøst oppnår aksiale skanninger. Vanligvis får et skannemønster det todimensjonale rutenettet (B-skanninger) som en samling lineære endimensjonale skannelinjer (A-skanninger), som tilsvarer 2D-tverrsnittsbilder ved hjelp av et rasterskannemønster. For studier fokusert på nærsynthet hos mus, brukes dette systemet også til å måle dimensjoner av okulære strukturer (f.eks. Hornhindetykkelse, linsetykkelse, glasslegemedybde og aksial lengde).
Det nåværende systemet lar brukerne designe sine egne protokoller, lage skanninger som kan skreddersys og velges basert på de okulære strukturene av interesse. De viktigste skanningene i disse brukerdefinerte protokollene gjør denne bildebehandlingsteknikken brukervennlig. For bildeanalyser har vi utviklet tilpasset programmering i et matematisk modelleringsprogram. SD-OCT er et kraftig verktøy for ikke-invasivt å identifisere og kvantifisere patomorfologiske endringer i okulære strukturer og overvåke synsrelatert sykdomsprogresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne prosedyrer ble godkjent av Atlanta Veterans Affairs Institutional Animal Care and Use Committee og i samsvar med National Institutes of Health guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (NIH Publications, 8. utgave, oppdatert 2011).
MERK: SD-OCT-systemet som brukes til å utvikle protokollen nedenfor, er beskrevet i materialfortegnelsen. Mens noen av prosedyrene er spesifikke for dette bestemte systemet, kan den generelle tilnærmingen tilpasses andre OCT-enheter og dyremodeller. Videre, i vårt laboratorium, brukes disse protokollene ofte hos mus og rotter; Den generelle tilnærmingen kan imidlertid adopteres til forskjellige dyremodeller og SD-OCT-enheter, forutsatt at en person har riktig linse og evner på enheten.
1. Sett opp det optiske koherenstomografiutstyret
- Åpne SD-OCT-programvaren (Materialfortegnelse).
- Definer hvem som tar OCT, studien og behandlingsarmen (hvis relevant). Navngi disse kategoriene på en måte som vil hjelpe forskere med å søke etter de ønskede skanningene senere under dataanalysen.
- I kategorien Pasient/undersøkelse klikker du på Test Examiner. Velg navnet på eksaminator. Bruk knappen Sett opp sensorer og leger for å legge til nye sensorer.
- Klikk Studienavn for å definere studien. Klikk på Studie-fanen for å legge til en ny studie eller endre behandlinger i en eksisterende studie. Klikk til høyre for Velg behandlingsarm for å velge en behandlingsarm .
- Klikk på Legg til pasient-knappen , som brukes til å legge til et nytt tidspunkt for en hel gruppe. Når vinduet vises, skriver du inn ID-nummer, fornavn og etternavn. Velg Mann eller Kvinne. Skriv inn fødselsdatoen.
- Klikk på Legg til eksamen-knappen for å legge til de enkelte rottene. For å identifisere rottene, klikk på en eksamen. Klikk på Rediger eksamen. Skriv inn ID-nummeret i boksen Skriv inn notater . Klikk på Lagre endringer-knappen .
- Fest riktig objektiv til enheten (figur 1B), velg den tilsvarende konfigurasjonen i programvaren og still inn den tilknyttede referansearmposisjonen.
MERK: Det beskrevne SD-OCT-systemet har tilpassede linser, forhåndsinnstilte skannemønstre og referansearminnstillinger som er spesifikke for dyrearten og øyeområdet som avbildes (netthinnen eller hornhinnen, mus eller rotte). Noen av disse detaljene er spesifikke for SD-OCT-systemet som er beskrevet (se materialfortegnelse). For eksempel tilbyr ikke alle enheter manuell justering av referansearmens banelengde. - I kategorien Pasient/undersøkelse dobbeltklikker du på den markerte eksamenen for å gå videre til fanen Bildebehandling og begynner bildebehandling, eller bare klikker på fanen Bildebehandling . Hvis det er en standardskanning, høyreklikker du for å slette den.
- Last inn en forhåndsinnstilt skanneprotokoll ved å klikke på Velg en protokoll fra listeknappen . Alternativt kan du legge til individuelle skanninger.
- For rottemodeller av glaukom og diabetisk retinopati og musemodeller av retinal degenerasjon, velg en forhåndsinnstilling som består av fire bilder: 2 OD og 2 OS-skanninger. For musemyopi, velg en forhåndsinnstilling som består av 8 bilder: 4 OD og 4 OS-skanninger.
MERK: Forhåndsinnstilt avbildning vil bli forklart mer detaljert i avsnitt 3. Dette er noe hvert laboratorium lager for seg selv eller med produsenten under installasjonen på stedet.
2. Bedøv dyret
- Administrer bedøvelse.
- Bedøve rotter med ketamin (60 mg/kg) og xylazin (7,5 mg/kg) via intraperitoneal injeksjon.
- Bedøv mus med ketamin (80 mg/kg) og xylazin (16 mg/kg) via intraperitoneal injeksjon.
- Vent til dyrene er fullt bedøvet og ikke reagerer på tåklemme.
- Administrer elevdilatasjonsdråper (1% tropikamid). Vent til elevene utvider seg før avbildning.
MERK: Utvidelse av pupiller øker synsfeltet, men er ikke et krav. Lokale (hornhinnen) bedøvelsesdråper (0,5% tetrakain) for å dumpe øyet, bør også brukes hvis noe vil berøre øyet (for eksempel hvis du bruker kontaktlinser eller bruker en guide). En guide er en enhet som er plassert over skannehodet og hjelper nybegynnere til å stille opp øyet og skannehodet. - Etter bedøvelse av gnageren, plasser gnageren i et gnagerjusteringssystem som kan rotere dyret i 3-dimensjonalt rom (figur 1A, 1C og 1D). Gi termisk støtte.
MERK: For øyeblikket bruker vi gnagerjusteringssystemer for mus og rotter designet og solgt med SD-OCT-enheten. - Påfør væske (f.eks. saltvann eller kunstige tårer) for å holde øynene smurt. Sørg for at øyet ikke tørker ut under avbildning, slik at øyets optiske egenskaper opprettholdes mellom skanninger (når hornhinnen er våt, kan netthinnen ses tydelig).
- Sørg for å opprettholde fuktighet i motsatt øye når du skanner det første øyet, slik at det ikke tørker ut.
- Bruk en delikat arbeidsserviett for å transportere bort overflødig saltvann rett før avbildning, da for mye eller for lite smøremiddel på øyet vil påvirke bildekvaliteten.
MERK: Bruk av steril smøremiddelgel anbefales ikke under OCT siden det kan forstyrre avbildning. Om nødvendig kan steril smøremiddelgel brukes etter prosedyren. En kontaktlinse kan også brukes for å sikre tilstrekkelig fuktighet på øyet gjennom hele testen. Vår erfaring er at en kontaktlinse ikke ga en markant forbedring i bildekvaliteten, men kontaktlinser bidrar til å redusere risikoen for hornhinnetørking under bildebehandlingen.
3. Gnager OCT bildebehandling
- Begynn med ett øye (OS eller OD) og bilde det kontralaterale øyet etter.
- Plasser dyret ved hjelp av de to rotasjonsbevegelsene til gnagerjusteringssystemet, slik at blikket er horisontalt og ser nedover aksen til OCT-linsen (figur 1D).
- Bruk OCT i Free Run-modus til å orientere netthinnen for datainnsamling. Bruk Aim-modus (ved å klikke på Aim-knappen) i utgangspunktet for kontinuerlig visning av både horisontale og vertikale B-skanninger i sanntid.
- Flytt skannehodet nærmere øyet til netthinnen er synlig (da mus og rotte retina-linser er fast fokus, beveger linsen mot øyet fokuserer dypere inn i netthinnen). Bruk deretter gnagerjusteringssystemet til å justere dyreposisjonen opp/ned og svinge/vri for å plassere det optiske nervehodet i midten, gjøre den horisontale skanningen horisontal og den vertikale skanningen vertikal (figur 1A).
- Juster arbeidsavstanden slik at retinalbildet er flatt og ikke buet.
- Juster referansearmposisjonen for å holde bildet nær toppen av visningsvinduet. Vær forsiktig så du ikke skyver inn for langt, ellers vil øyebildet vende tilbake på seg selv.
- Retinal avbildning
- For glaukom, retinal degenerasjon og diabetisk retinopati modeller: Definer en volumskanning som består av 1000 x 100 x 1 (A skanner x B skanner x gjentatte B-skanninger) for gjennomsnitt. Ta en volumskanning som er 3 x 3 mm hos rotter. Ta en volumskanning på 1,5 x 1,5 mm hos mus.
- Sentrer optisk nerve i horisontal og vertikal tilgang slik at volumskanningen er i midten. Ta deg tid til å forsikre deg om at synsnervehodet er i midten av skanningen og rett langs de nasale-temporale og superior-inferior aksene (figur 2). Skann og sentrer på nytt for å sikre at den er nøyaktig i midten, om nødvendig. Gjenta denne skanningen etter behov til synsnervehodet er sentrert og justert langs begge aksene. Klikk på Snapshot-knappen for å ta et bilde.
MERK: Noen SD-OCT-enheter har mulighet til optisk å manipulere øyets krumning (f.eks. bildet er flatt) ved å justere avstanden til øyet fra lyskilden med referansearmen. Vi anbefaler å flate ut og sentrere bildene når du tar direkte tykkelsesmålinger gjennom netthinnelagene for å forbedre nøyaktigheten langs fremre-bakre retning. - Klikk på Lagre-knappen for å lagre bildet.
- Ta en radial skanning sentrert på synsnervehodet som er 1000 x 4 x 20 (A-scan x B-scan x gjentatte B-skanninger). Bruk gjentatte B-skanninger for å forbedre bildeklarheten i øyet eller netthinnen, noe som vil bidra til å tolke områder av øyet eller lagene i netthinnen under dataanalyse.
MERK: Igjen, hos rotter er denne radiale skanningen 3 mm, mens hos mus er den radiale skanningen 1,5 mm. - Lagre bildet.
- Gjenta trinn 3.1 til 3.2.5 i det kontralaterale øyet.
- Målinger av aksial lengde
- For prosjekter som involverer avbildning av hele øyet, for eksempel musenærsynthet, ta tre skanninger av hele øyet og en retina scan for hvert øye. Velg en forhåndsinnstilling som består av en radiell skanning som er 500 x 20 x 1 og omfatter øyets fulle diameter.
MERK: Denne innstillingen gir et bilde av hele lengden av museøyet fra hornhinnen til årehinnen. - Sentrer midten av øyet og netthinnen i synsfeltet. Ta tre radiale skanninger (hele øyeskanninger): en lineær B-skanning som er 1000 x 5 x 2 og to ekstra lineære B-skanninger på 1000 x 5 x 2 på samme sted. Lagre bildene.
- Etterpå, hvis ønskelig, zoom inn og ta en volum eller rektangulær skanning (retina scan) som ligner på beskrivelsen i 3.2 som består av 1000 x 20 A skanner x B skanner. Lagre volumskanningen.
- Gjenta trinn 3.3 til 3.3.3 i det kontralaterale øyet.
MERK: Aksiale lengdemålinger er bare mulig på små øyne (mus eller mindre) siden bildevinduet til nåværende systemer ikke er stort nok til å fange et større øye.
- For prosjekter som involverer avbildning av hele øyet, for eksempel musenærsynthet, ta tre skanninger av hele øyet og en retina scan for hvert øye. Velg en forhåndsinnstilling som består av en radiell skanning som er 500 x 20 x 1 og omfatter øyets fulle diameter.
4. Trinn etter bildebehandling
- Lagre lagrede data i en sky, noe som er god praksis for datahåndtering og gir enkel tilgang for senere analyse. Utføre dataanalyse med tilpasset programvare utviklet i et matematisk modelleringsprogram (Table of Materials).
- Fjern gnageren fra gnagerjusteringssystemet og gi en intraperitoneal injeksjon av atipamezol (1 mg / kg for rotter og mus) for å reversere effekten av xylazin, slik at gnageren vil våkne raskere.
- La gnagere komme seg på en varmepute på lav varme. Gi ekstra saltvannsdråper etter behov. Returner gnagere til hjemmeburet når de har gjenvunnet full ambulering.
- Lukk programmet og slå av OCT.
5. Etterbehandling av OCT-bilder
- Behandle bildene ved hjelp av tilpasset programvare utviklet i et matematisk modelleringsprogram for å passe spesifikke OCT-behov (f.eks. måle tykkelsen på interesseområder ved å merke bildene manuelt).
- Avhengig av formålet med bildet (netthinnen mus, netthinnen hos rotter eller nærsynthet/aksial lengde), bruk ett av tre forskjellige programmer:
- For å behandle netthinnen, velg OCT-skanningene du vil laste. Først definerer du midten av optisk nervehode med et enkelt klikk.
- Se på når programmet genererer vertikale linjer som definerer avstander på hver side av optisk nervehode. Merk at i rottehinnen er disse linjene 0,5 mm og 1,2 mm fra midten av optisk nervehode, for totalt 4 vertikale linjer som representerer de nasale-temporale og underordnede-overlegne aksene i øyet, avhengig av den radiale B-skanningen som for tiden analyseres.
MERK: I musehinnen er disse vertikale linjene på 0,25 mm og 0,5 mm fra synsnervehodet. - Avgrens følgende lag langs hver linje:
Retinalt nervefiberlag (RNFL), indre pleksiformt lag (IPL), indre kjernelag (INL), ytre pleksiformlag (OPL), ytre kjernelag (ONL), ekstern begrensningsmembran (ELM), indre segmenter / ytre segmenter (IS / OS), retinalpigmentepitel (RPE) og total retinal tykkelse.
MERK: Den radiale skanningen har vanligvis ikke nasale / temporale og overordnede / dårligere etiketter når den åpnes. Skanninger kan opprettes slik at de har en n/t- og s/I-retning, og spesielt disse skanningene analyseres senere. - Etter at et bilde er avgrenset og programmet lukket, eksporterer du disse målingene til et regnearkprogram for dataanalyse.
- Bruk disse lengde- og tykkelsesverdiene fra trinn 5 til å sammenligne mellom grupper, for eksempel bestemme om det er regionale forskjeller (n / t / s / i) eller langsgående endringer.
- For retinal målinger, bestem først om det er noen forskjeller i nasal-temporal og inferior-superior akse ved 0, 5 mm og 1, 2 mm avstander.
MERK: Hvis forskjeller i kvadranter ikke observeres, kan 0,5 mm og 1,2 mm målingene gjennomsnittes sammen. Dette er en lignende tilnærming for musens retinale skanner bare ved 0,25 mm og 0,5 mm. - For nærsynthet, bruk dette programmet til å vurdere de okulære parametrene langs øyets optiske akse. Åpne det matematiske modelleringsprogrammet. Velg først et bilde du vil laste inn.
- Etter at du har lastet inn bildet, merker du manuelt hver skanning (radial og B-skanning). Merk de fremre og bakre kantene av hornhinnen, linsen, glasslegemet og netthinnen, slik at programmet vil beregne hornhinnetykkelse, linsetykkelse, fremre og glassaktige kammerdybde, total retinal tykkelse, total aksial lengde.
- Etter merking, avslutt programmet som ber om en lagringsmeny. Lagre de avgrensede verdiene i et regnearkprogram og lag gjennomsnittet av de tre separate skanningene sammen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SD-OCT anses som vellykket hvis bilder av høy kvalitet oppnås slik at okulære dimensjoner kan måles pålitelig. Her er en rekke bruksområder av SD-OCT illustrert ved hjelp av modeller av retinal degenerasjon, glaukom, diabetisk retinopati og nærsynthet.
I en lysindusert retinal degenerasjon (LIRD) -modell induserer eksponering for sterkt lys (10.000 lux) degenerasjon av fotoreceptorceller i netthinnen9. Representative SD-OCT-bilder viser et tynnere ytre kjernelag, som inneholder fotoreseptorcellelegemer, i netthinner fra LIRD BALB/c-mus sammenlignet med uskadet (kontroll) mus (figur 3A&3B). Etter kvantifisering av retinallagtykkelsen ble det observert en signifikant forskjell mellom ubeskadigede og LIRD-mus for total retinaltykkelse (figur 3C), ytre nukleær lagtykkelse (figur 3D) og IS / OS-tykkelse (figur 3E).
For å eksperimentelt modellere glaukomatøs skade brukte vi en modell av okulær hypertensjon (OHT) 10. Kort fortalt fikk rottene (n=35) en injeksjon med hypertont saltvann i limbusvenen på det ene øyet, mens det kontralaterale øyet fungerte som internkontroll11. For DrDeramus-studier kvantifiserte vi retinal nervefiberlag (RNFL) tykkelse. Etter 8 uker med OHT observerte vi tydelig remodellering ved synsnervehodet, inkludert synsnervekopping (figur 4A&B). Deretter kvantifiserte vi RNFL-tykkelsen og fant RNFL-tynning etter 8 uker med OHT sammenlignet med baselinemålinger (figur 4C).
For å modellere diabetisk retinopati ble Goto-Kakizaki-rotter, en ikke-overvektig, polygen modell av diabetes som utvikler hyperglykemi så tidlig som 2-3 ukers alder, brukt12,13. Netthinner fra Goto-Kakizaki-rotter og Wistar-rotter (ikke-diabetiske kontroller) ble avbildet med SD-OCT (figur 5A&5B). Ved 6 ukers alder ble RNFL og total retinal tykkelse redusert hos Goto-Kakizaki-rotter sammenlignet med Wistar-rotter i den sentrale netthinnen (data ikke vist) og perifer retina (figur 5C&5D). De største forskjellene ble observert i retinas nedre og temporale kvadranter (figur 5C&5D).
For å evaluere musemodeller for nærsynthet ble aksial lengde målt i Bmal1-/- mus. Bmal1 er et klokkegen av interesse fordi sirkadiske rytmer kan spille en rolle i myopiutvikling14,15. Den aksiale lengden på Bmal1-/- museøyet (figur 6B) er synlig lengre enn villtypeøyet (figur 6A) på OCT-bildene. Kvantifisering av aksiallengden bekrefter at Bmal1-/- mus har signifikant lengre aksiale lengder ved 84 dagers alder (figur 6C), noe som viser at mangelen på klokkegenet bidrar til utvikling av nærsynthet.
Denne protokollen genererte bilder av okulære strukturer i modeller av retinal degenerasjon, glaukom, diabetisk retinopati og nærsynthet. Bildene var av tilstrekkelig kvalitet slik at okulære dimensjoner, inkludert ytre kjernelag, retinal nervefiberlag, total retinal tykkelse og aksial lengde, kunne kvantifiseres. Resultatene viste at signifikante forskjeller i dimensjonene av okulære strukturer kunne observeres in vivo ved bruk av SD-OCT.
Figur 1: Oppsett av SD-OCT-utstyr.
(A) Bilde av gnagerjusteringssystem og OCT-skannehode. (B) Bilde av rotte og mus OCT linser. (C) Bilde av justeringssystem for musegnagere som illustrerer dets evne til å bevege seg i 3-dimensjonalt rom. (D) Nærbilde av gnagerjusteringssystemet, spesielt knottene som styrer bevegelsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: SD-OCT-eksempelskanning.
Bilde av en live skanning av musehinnen like før du tar en volum- eller radial skanning. (A) viser den nasale-temporale justeringen, mens (B) viser den overlegne-underordnede justeringen. Når netthinnene i disse to bildene er rette i sine respektive vertikale eller horisontale plan og optisk nerve er sentrert i begge bildene, fortsetter vi å skaffe SD-OCT-bildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Bruk av SD-OCT for å spore tynning av fotoreceptorlaget over tid i en musemodell av retinal degenerasjon.
(A) Representativ SD-OCT skanning av en uskadet (kontroll) retina fra en BALB / c mus. (B) Representativ SD-OCT skanning av en retina fra en lysindusert retinal degenerasjon (LIRD) BALB / c mus. (VG Nett) Kvantifisering av total retinal tykkelse (C), ytre kjernefysisk lag (ONL) tykkelse (D), og indre segment / ytre segment (IS / OS) tykkelse (E) i uskadet og LIRD Balb / c mus. Mener ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Ved bruk av SD-OCT målte vi en reduksjon i retinal nervefiberlagtykkelse og observert optisk nervekopping etter å ha indusert okulær hypertensjon i en rottemodell av DrDeramus.
(A) Representativ SD-OCT-skanning av et retina og synsnervehode fra et rotteøye tatt før okulær hypertensjon induseres (baseline: OHT). (B) SD-OCT skanning av samme rotte retina etter 8 uker med OHT (eksperimentell modell av glaukom). (C) Kvantifisering av retinal nervefiberlag (RNFL) tykkelse ved baseline sammenlignet med OHT øyne. Mener ± SEM. Disse dataene er modifisert fra Feola et al.11Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bruk av SD-OCT for å observere redusert total retinal tykkelse samt redusert tykkelse av spesifikke retinale lag i en rottemodell av diabetes.
(A) Representativ SD-OCT skanning av en retina fra en Wistar (Wild-type kontroll) rotte. (B) Representativ SD-OCT skanning av en retina fra en Goto-Kakizaki (diabetiker) rotte. Netthinnelag: retinalt nervefiberlag (RNFL), indre pleksiformt lag (IPL), indre kjernelag (INL), ytre pleksiformlag (OPL), ytre nukleærlag (ONL), ekstern begrensende membran (ELM), indre segmenter/ytre segmenter (IS/OS), retinalpigmentepitel (RPE) og total retinaltykkelse (TRT). (VG Nett) Kvantifisering av RNFL (C) og total retinal tykkelse (D) i Wistar og Goto-Kakizaki retinas hvor den sentrale linjen er gjennomsnittet og det skyggelagte området er SEM for alle fire kvadranter (Sup, Superior; Temp, Temporal; inf, dårligere; Nas, Nasal) i perifer retina (1,2 mm fra synsnervehodet). ** p < 0,01, *** p < 0,001. Denne figuren er modifisert fra Allen et al.13Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Bruk av SD-OCT for å evaluere aksial lengde i en musemodell av nærsynthet.
SD-OCT-bilder av villtype (A) og Bmal1-/- (B) museøyne ved 84 dagers alder. Øynene til Bmal1-/- mus har betydelig lengre akselengde enn villtypeøynene (C). AL: aksial lengde; RT: retinal tykkelse; VCD: glasslegeme kammer dybde; LT: linsetykkelse; ACD: fremre kammerdybde; CT: hornhinde tykkelse. Den lange vertikale linjen indikerer aksiale lengdegrenser (topp og bunn indikert med horisontal linje) for villtypeøyet. Kort pil angir den bakre aksiale lengdemarkeringen for Bmal1-/- øyet. Mener ± SEM. Den sentrale linjen midt på hvert bilde (A&B) er en artefakt med loddrett metning. Det brukes vanligvis som en veiledning for å sentrere øyet, men hvis skanningen er godt justert, kan den gjøres for å forsvinne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Høyoppløselig avbildning av okulære strukturer in vivo muliggjør vurdering av retinale og okulære endringer over tid. I denne protokollen ble SD-OCT vist å fange forskjeller i okulære strukturer in vivo i modeller av retinal degenerasjon, glaukom, diabetisk retinopati og nærsynthet.
Det mest kritiske aspektet ved utførelse av SD-OCT er å få et klart bilde av netthinnen eller annen okulær struktur av interesse. Det er viktig å ta deg tid til å sørge for at netthinnen er perfekt sentrert og har utmerket klarhet. Tung pust av gnageren kan resultere i støyende bilder (netthinnen kan faktisk sees å vrikke på skjermen). Dette skjer noen ganger hvis et dyr ikke er helt bevisstløs etter bedøvelse. Du kan omgå dette problemet ved å beregne gjennomsnittet av flere B-skanninger for å visualisere hvor grensene for netthinnelagene er, og deretter kan det beste enkeltstående B-skanningsbildet analyseres.
En annen vanlig feil er at øyet er for tørt eller for vått. Dette kan enkelt kontrolleres ved å påføre en ekstra dråpe saltvann, transportere det bort med en laboratorieserviett og vurdere om bildet ble bedre i klarhet. En vurdering å ta hensyn til når du markerer retinallagtykkelser på SD-OCT-bilder, er hvordan du merker RNFL. Selv om det er mulig å skille mellom RNFL og GCL på noen gnager-OCT, kan disse to lagene ofte ikke skilles. For konsistens markerer vi hele RNFL-regionen (RNFL + GCL, når den er synlig) som RNFL. Noen studier rapporterer RNFL og GCL som separate lag eller kombinerer GCL og indre plexiforme lag16,17,18, selv om denne undersøkelsen vanligvis ble utført hos mennesker, som har mye større øyne enn gnagere. Rapportering av RNFL-tykkelse er mer typisk i gnagerstudier11,13,19,20. Et annet viktig problem er at svært små endringer i merking kan forårsake en svært stor forandring, spesielt i nærsynthet på grunn av den lille størrelsen på strukturene som måles. For eksempel er en 6 μm forskjell i måling lik en diopter av endring i brytningsfeil21. Fordi små endringer utgjør en så stor forskjell i måling, er bildeklarhet kritisk.
En begrensning av denne protokollen, og av SD-OCT generelt, er at klare okulære medier er nødvendig for et godt bilde. For eksempel kan hornhinneskader, linseavvik og grå stær forhindre brukere i å få klare bilder. Dette er et problem i diabetisk retinopati imaging, spesielt, da grå stær ofte utvikler seg hos diabetiske gnagere22. Hvis katarakt eller annet okulært problem er lite, er det noen ganger mulig å manøvrere skannehodet rundt det. For større okulære medieforstyrrelser er retinal OCT-bilder umulige å oppnå. Disse netthinnene kan fortsatt undersøkes ved hjelp av histologi, da retinal histologi ikke er betinget av klare okulære medier.
En ytterligere begrensning er det faktum at hyperreflekterende lesjoner, som ekssudater og blødninger, samt store retinale kar, resulterer i skygge av de underliggende retinale strukturer, og dermed går detaljer om den underliggende morfologien tapt. I et tilfelle med koroidal neovaskulær membran og diabetisk retinopati/makulaødem der retinaltykkelsen var over 400 μm, var det vanskelig å skjelne underliggende patologi og årehinnen23. I tillegg kan SD-OCT bare brukes til å vurdere tykkelse på bestemte steder. SD-OCT har også en begrenset penetrasjonsdybde for avbildning av årehinnen og for avbildning av hele øyne (hele øyet kan avbildes i mus, men ikke hos større dyr). En annen begrensning er at fluorescerende eller andre markører ikke kan brukes med SD-OCT som ved skanning av laseroftalmoskopi (SLO). Imidlertid tillater typiske SLO -enheter ikke visualisering av retinale lag i tverrsnitt med samme letthet som observeres med SD-OCT. Endelig er oppløsningen med SD-OCT ikke perfekt. Det er imidlertid mye forbedret i forhold til oppløsningen som var tilgjengelig ved begynnelsen av SD-OCT og fortsetter å forbedre seg over tid.
Avslutningsvis er fordelene og betydningen av SD-OCT-teknikken at den muliggjør in vivo-avbildning av okulære strukturer og kvantitativ sporing av endringer i okulære dimensjoner over tid, og at den utfører denne avbildningen med rask skannehastighet. På grunn av den høye oppløsningen til SD-OCT, kan den brukes til å oppdage subtile forskjeller som ikke kan observeres med det blotte øye (figur 4 &; figur 5). Videre er SD-OCT et nyttig verktøy for å måle flere parametere i øyet i en rekke sykdoms- og skademodeller. I denne protokollen alene ble SD-OCT brukt til å måle retinal tykkelse i modeller av retinal degenerasjon og diabetisk retinopati, retinal tykkelse og kopping i en DrDeramus-modell og aksial lengde i en nærsynthet modell. SD-OCT kan også brukes til å måle hornhindekurvatur24, vurdere retinale endringer etter blast og traumatisk hjerneskade 19,25,26, identifisere patologi i aldersrelatert makuladegenerasjon 27, og overvåke retinal helse under og etter okulære injeksjoner 28 og retinal plassering av proteser som subretinale implantater 29. Den kan også brukes i andre dyremodeller som trespissmus30 og ikke-menneskelige primater31. SD-OCT kan også brukes til å lokalisere retinal patologi basert på kvadrant (overlegen, underordnet, nasal, temporal) og plassering (sentral vs. perifer). De fremtidige SD-OCT-enhetene vil oppnå enda større oppløsning. I tillegg tillater OCT angiografi avbildning av retinal og choroidal mikrovaskulatur ved å benytte refleksjon av laserlys fra overflaten av røde blodlegemer når de beveger seg gjennom retinal vaskulatur32,33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Department of Veterans Affairs Rehab R&D Service Career Development Awards (CDA-1, RX002111; CDA-2; RX002928) til RSA, Merit Award (RX002615) og Research Career Scientist Award (RX003134) til MTP, Career Development Award (CDA-2, RX002342) til AJF, EY028859 til MTP, NEI Core Grant P30EY006360, Research to Prevent Blindness, og Foundation Fighting Blindness.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% tropicamide | Sandoz | Sandoz #6131403550; NDC- 24208-585-59 | |
| 0.5% tetracaine | Alcon | NDC 0065-0741-12 | |
| AIM-RAS G3 120 V | Leica Bioptigen | 90-AIMRAS-G3-120 | Specialized platform to hold the OCT Scanner Head for mice |
| Celluvisc gel | REFRESH CELLUVISC | #4554; NDC-0023-4554-30 | |
| G3 18 mm Telecentric Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-18 | |
| G3 Mouse Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-M | |
| G3 Rat Lens | Leica Bioptigen | 90-BORE-G3-R | |
| heating pad | Fabrication | 11-1130 | |
| InVivoVue software | Leica Bioptigen | Specialized software that pairs with the Leica Bioptigen SD-OCT system | |
| MATLAB | Mathworks | mathematical modeling program | |
| Mouse/Rat Kit | Leica Bioptigen | 90-KIT-M/R | Mouse/rat rodent alignment system |
| saline | ADDIPAK | 200-39 | |
| System Envisu R4300 VHR 120 V | Leica Bioptigen | 90-R4300-V1-120 | SD-OCT system |
References
- Wojtkowski, M., et al. Ultrahigh-resolution, high-speed, Fourier domain optical coherence tomography and methods for dispersion compensation. Optics Express. 12 (11), 2404-2422 (2004).
- Nassif, N., et al. In vivo high-resolution video-rate spectral-domain optical coherence tomography of the human retina and optic nerve. Optics Express. 12 (3), 367-376 (2004).
- Theelen, T., Teussink, M. M. Inspection of the Human Retina by Optical Coherence Tomography. Methods in Molecular Biology. 1715, 351-358 (2018).
- Nakazawa, M., Hara, A., Ishiguro, S. I. Optical Coherence Tomography of Animal Models of Retinitis Pigmentosa: From Animal Studies to Clinical Applications. Biomed Research International. 2019, 8276140 (2019).
- Drexler, W., et al. Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography. Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).
- VanLeeuwen, J. E., et al. Altered AMPA receptor expression with treadmill exercise in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-lesioned mouse model of basal ganglia injury. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 650-668 (2010).
- Tian, J., et al. Performance evaluation of automated segmentation software on optical coherence tomography volume data. Journal of Biophotonics. 9 (5), 478-489 (2016).
- Kraus, M. F., et al. Motion correction in optical coherence tomography volumes on a per A-scan basis using orthogonal scan patterns. Biomedical Optics Express. 3 (6), 1182-1199 (2012).
- Boatright, J. H., et al. Tool from ancient pharmacopoeia prevents vision loss. Molecular Vision. 12, 1706-1714 (2006).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64 (1), 85-96 (1997).
- Feola, A. J., et al. Menopause exacerbates visual dysfunction in experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 186, 107706 (2019).
- Goto, Y., Kakizaki, M., Masaki, N. Production of spontaneous diabetic rats by repetition of selective breeding. The Tohoku Journal of Experimental Medicine. 119 (1), 85-90 (1976).
- Allen, R. S., et al. Retinal Deficits Precede Cognitive and Motor Deficits in a Rat Model of Type II Diabetes. Investigative Ophthalmolology & Visual Science. 60 (1), 123-133 (2019).
- Stone, R. A., et al. Altered ocular parameters from circadian clock gene disruptions. PLoS One. 14 (6), 0217111 (2019).
- Chakraborty, R., et al. Circadian rhythms, refractive development, and myopia. Ophthalmic & Physiological Optics. 38 (3), 217-245 (2018).
- Davies, E. C., et al. Retinal ganglion cell layer volumetric assessment by spectral-domain optical coherence tomography in multiple sclerosis: application of a high-precision manual estimation technique. Journal of Neuro-ophthalmology. 31 (3), 260-264 (2011).
- Carnevali, A., et al. Optical coherence tomography angiography analysis of retinal vascular plexuses and choriocapillaris in patients with type 1 diabetes without diabetic retinopathy. Acta Diabetologica. 54 (7), 695-702 (2017).
- Springelkamp, H., et al. Population-based evaluation of retinal nerve fiber layer, retinal ganglion cell layer, and inner plexiform layer as a diagnostic tool for glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 8428-8438 (2014).
- Allen, R. S., et al. Long-Term Functional and Structural Consequences of Primary Blast Overpressure to the Eye. Journal of Neurotrauma. 35 (17), 2104-2116 (2018).
- Zhao, D., et al. Age-related changes in the response of retinal structure, function and blood flow to pressure modification in rats. Scientific Reports. 8 (1), 2947 (2018).
- Schmucker, C., Schaeffel, F. A paraxial schematic eye model for the growing C57BL/6 mouse. Vision Research. 44 (16), 1857-1867 (2004).
- Aung, M. H., Kim, M. K., Olson, D. E., Thule, P. M., Pardue, M. T. Early visual deficits in streptozotocin-induced diabetic long evans rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (2), 1370-1377 (2013).
- Puzyeyeva, O., et al. High-Resolution Optical Coherence Tomography Retinal Imaging: A Case Series Illustrating Potential and Limitations. Journal of Ophthalmology. 2011, 764183 (2011).
- Liu, A. S., et al. Topography and pachymetry maps for mouse corneas using optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 190, 107868 (2020).
- Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino, E., Kardon, R. H., Harper, M. M. Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (5), 3440-3450 (2013).
- Harper, M. M., et al. Blast-Mediated Traumatic Brain Injury Exacerbates Retinal Damage and Amyloidosis in the APPswePSENd19e Mouse Model of Alzheimer's Disease. Investigative Ophthalmology Visual Science. 60 (7), 2716-2725 (2019).
- Zhang, M., et al. Advanced image processing for optical coherence tomographic angiography of macular diseases. Biomedical Optics Express. 6 (12), 4661-4675 (2015).
- Muhlfriedel, R., et al. Optimized Subretinal Injection Technique for Gene Therapy Approaches. Methods in Molecular Biology. 1834, 405-412 (2019).
- Adekunle, A. N., et al. Integration of Perforated Subretinal Prostheses With Retinal Tissue. Translational Vision Science & Technology. 4 (4), 5 (2015).
- Sajdak, B. S., et al. Noninvasive imaging of the tree shrew eye: Wavefront analysis and retinal imaging with correlative histology. Experimental Eye Research. 185, 107683 (2019).
- Dominik Fischer, M., et al. Detailed functional and structural characterization of a macular lesion in a rhesus macaque. Documenta Ophthalmologica. 125 (3), 179-194 (2012).
- Hagag, A. M., Gao, S. S., Jia, Y., Huang, D. Optical coherence tomography angiography: Technical principles and clinical applications in ophthalmology. Taiwan Journal of Ophthalmology. 7 (3), 115-129 (2017).
- Treister, A. D., et al. Prevalence of Subclinical CNV and Choriocapillaris Nonperfusion in Fellow Eyes of Unilateral Exudative AMD on OCT Angiography. Translational Vision Science & Technology. 7 (5), 19 (2018).
