Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Mikroinjektion und gleichzeitigen Abbildung mehrerer Drosophila-Embryonen während der embryonalen Entwicklung mit einem plattenbasierten, hochinhaltigen Imager vorgestellt.

Zusammenfassung

Moderne Ansätze in der quantitativen Livezellbildgebung sind zu einem wesentlichen Werkzeug für die Erforschung der Zellbiologie geworden, indem sie die Verwendung von Statistiken und computergestützter Modellierung zur Klassifizierung und Zum Vergleich biologischer Prozesse ermöglichen. Obwohl Zellkulturmodellsysteme für bildgebende Aufnahmen mit hohem Gehalt hervorragend sind, deuten Studien mit hohem Durchsatz der Zellmorphologie darauf hin, dass Ex-vivo-Kulturen bei der Rekapitulation der morphologischen Komplexität, die in Zellen in lebenden Organismen vorkommt, begrenzt sind. Daher ist ein skalierbares Modellsystem mit hohem Durchsatz erforderlich, um lebende Zellen innerhalb eines intakten Organismus abzubilden. Hier wird ein Protokoll für die Verwendung eines hochauflösenden Bildanalysators beschrieben, um gleichzeitig mehrere Zeitraffervideos der embryonalen Drosophila-Melanogaster-Entwicklung während der synzytialen Blastoderm-Phase zu erfassen. Das synzytiale Blastoderm diente traditionell als großartiges In-vivo-Modell für die Abbildung biologischer Ereignisse; Die Erlangung einer signifikanten Anzahl experimenteller Replikationen für quantitative und Hochdurchsatzansätze war jedoch arbeitsintensiv und durch die Abbildung eines einzelnen Embryos pro experimenteller Wiederholung begrenzt. Hier wird eine Methode vorgestellt, um bildgebende und Mikroinjektionsansätze an ein Bildgebungssystem mit hohem Inhalt oder ein invertiertes Mikroskop anzupassen, das in der Lage ist, eine automatisierte Multipoint-Erfassung zu erzielen. Dieser Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Erfassung von 6-12 Embryonen, abhängig von den gewünschten Erfassungsfaktoren, innerhalb einer einzigen Bildgebungssitzung.

Einleitung

In den letzten 30 Jahren haben Fortschritte in bildgebenden Technologien und molekularen Sonden für die Live-Zell-Bildgebung unser Verständnis der Komplexität und des inneren Funktionierens der Zelle erweitert. Begleitet wird dieser technologische Fortschritt durch die Verwendung von Ex-vivo-Zellkulturmodellen für die Erfassung von Bilddaten mit hohem Durchsatz. Zellkulturmodelle bieten mehrere Vorteile, einschließlich der Steuerung der Mikroumgebung durch mikrofluidische Systeme und die Möglichkeit, mehrere Zellen gleichzeitig abzubilden, was die Verwendung quantitativer Ansätze ermöglicht, die für das Hochdurchsatzscreening^1,2erforderlich sind. Es gibt jedoch auch erhebliche Nachteile, die mit Zellkulturmodellen im Kontext morphologischer Studien verbunden sind, wie zweidimensionale Glas- oder Kunststoffoberflächen, die verwirrende Effekte auf die Zellmorphologie und ihre Regulation^3,4,5erzeugen. Diese Effekte können falsche oder irreführende Daten in Bezug auf die Untersuchung biologischer Prozesse liefern, die die zelluläre Morphologie regulieren.

Obwohl die Alternative darin besteht, die zelluläre Morphologie im Kontext eines intakten Organismus zu untersuchen⁶, nur wenige geeignete intakte Organismen ermöglichen quantitative Lebendzellbilder mit hohem Durchsatz aufgrund von Schwierigkeiten, ganze Organismen durch Bildgebung am Leben zu erhalten, und Herausforderungen, die mit der Bildgebung in einem großen multizellulären Organismus verbunden sind. Infolgedessen konzentrierten sich zellbiologische Studien an intakten Organismen im Allgemeinen auf die Beobachtung eines einzelnen Organismus im Laufe der Zeit, was die Probengröße stark einschränkt. Darüber hinaus macht diese Ein-Tier-zu-eine-Zeit-Beschränkung die Verwendung von Live-Bildgebung in Form eines Bildschirms schwierig und kostspielig und schränkt die Fähigkeit ein, quantitative Analysewerkzeuge anzuwenden, da die Anzahl der Proben im Allgemeinen zu gering ist. So entsteht die Notwendigkeit eines multizellulären Modellorganismus, der für hochgehaltbasierte quantitative Ansätze verwendet werden kann.

Dieses Protokoll passt den Drosophila-Embryo für plattenbasierte Bildgebung mit hohem Gehalt an, um experimentelle Probengrößen zu generieren, die groß genug für quantitative Analysen sind. Drosophila melanogaster ist allgemein bekannt als der erste Modellorganismus. Die Forschung mit Drosophila hat zu Durchbrüchen in der Zell- und Molekularbiologie geführt, einschließlich der Übertragung genetischer Informationen, der Identifizierung von Zellsignalwegen und genetischen Anforderungen der embryonalen Entwicklung^7,8,9. Darüber hinaus wurde der Drosophila-Embryo verwendet, um die In-vivo-Mikrotubuli-Dynamik während der zellulären Teilung^10,11,12zu erforschen. Der Einsatz von Mikroinjektion zur Lieferung kleiner Moleküle und molekularer Sonden bietet eine zeitliche Kontrolle, die die embryonale Entwicklung von Drosophila besonders leistungsfähig für die Untersuchung zellulärer Prozesse in vivo^13,14macht. Die Generierung einer signifikanten Anzahl experimenteller Wiederholungen mit einem traditionellen bildgebenden Ansatz ist jedoch äußerst arbeitsintensiv und hat nur einen begrenzten Einsatz in bildgebenden Bildschirmen mit hohem Durchsatz und quantitativer Analyse. Unser Ansatz nutzt einen Hochgehaltsanalysator, der typischerweise für einzellige Analysen reserviert ist, und passt die in vivo-Bildgebungsanalyse im Syncytium der frühen Drosophila embryo an.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um Drosophila-Embryonen zu sammeln, zu inszenieren und zu mikroinjizieren, um die Mechanismen zu erforschen, die morphologische Veränderungen im Endoplasmaischen Retikulum (ER) während der Mitose¹⁵vorantreiben. Obwohl viele Studien die dynamische Natur des ER während des Zellzyklus^16,17,18,19skizziert haben, war es schwierig, die Auswirkungen mehrerer Störungen über die Zeit auf die ER-Morphologie zu vergleichen. Um die Komponenten zu identifizieren, die Veränderungen in der ER-Morphologie über die Zellteilung hinweg vorantreiben, wurden die in diesem Protokoll aufgeführten Methoden verwendet, um die Rolle von Mikrotubuli und anderen zytoskelettalen Faktoren bei der mitotischen ER-Reorganisation mithilfe der kortikalen synzytialen Teilung im frühen Drosophila-Embryo zu untersuchen. Zusammengenommen machen die Verfügbarkeit genetischer Störungen innerhalb der Drosophila-Gemeinschaft, die Fähigkeit, Medikamente und molekulare Sonden zu genauen Zeiten während der Entwicklung mikroinjizieren, und die kostengünstigen Kosten für die Arbeit mit Drosophila diesen Ansatz sehr freundlich für ein bildbasiertes Screening mit hohem Durchsatz. Die hier beschriebenen Methoden sind für die Untersuchung einer Vielzahl von zellulären und Entwicklungsprozessen in vivo mit dem Drosophila Embryo²⁰anwendbar. Insbesondere ist dieses Protokoll gut angepasst, um biologische Ereignisse zu untersuchen, die über einen längeren Zeitraum und innerhalb von 100 Mikrometern des Drosophila Embryokortex auftreten.

Protokoll

HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie Rezepte für Medien und Lösungen.

1. Einrichtung und Pflege eines Embryo-Entnahmekäfigs für die Live-Analyse²¹

1. Bevölkern Sie einen frischen Embryo-Sammelkäfig mit frischen Fliegen.
   HINWEIS: Während handelsübliche Sammelkäfige empfohlen werden, können Sammelkäfige einfach aus leeren Fliegenflaschen²¹hergestellt werden.
   1. Entsorgen oder übertragen Sie erwachsene Fliegen von Flaschen, wenn viele Welpen beginnen, sich in Stufe p14 zu verdunkeln; bei 20 °C tritt dies etwa 14 Tage nach dem Legen der Eier²²auf.
   2. Pupae schlüpfen lassen und die Flaschen für 12-24 h befüllen.
   3. Übertragen Sie frische Fliegen mit einem kleinen Trichter über die Öffnung des Sammelkäfigs in einen kleinen Sammelkäfig, um zu verhindern, dass Fliegen entkommen. Kombinieren Sie bis zu 3 Flaschen zu einem dicht besiedelten Käfig mit 200 bis 500 Fliegen.
   4. Transferfliegen in den Sammelkäfig, indem Sie wiederholt auf eine Fliegenflasche gegen eine harte Oberfläche tippen (um die Fliegen zu betäuben). Öffnen und umkehren Sie dann die Fliegenflasche über den Sammelkäfigtrichter. Tippen Sie ein paar Mal auf die offene Flasche auf den Sammelkäfig, um Fliegen in den Sammelkäfig zu werfen.
   5. Schließen Sie die offene Fliegenflasche, indem Sie sie schnell auf den Stecker stellen. Während Sie die offene Fliegenflasche vom Trichter auf ihren Stecker übertragen, stellen Sie sicher, dass die Flaschenöffnungspunkte nach unten zeigen, da Fliegen dazu neigen, von der Quelle des Abklopfens wegzukriechen.
   6. Drücken Sie den Trichter gegen die Öffnung des Fliegenkäfigs und tippen Sie wiederholt auf eine harte Oberfläche, um die Fliegen im Inneren zu betäuben. Entfernen Sie sofort den Trichter und sichern Sie sich einen frischen Traubenteller an der Fliegenkäfigöffnung. Verwenden Sie Etikettierband, um den Traubenteller zu sichern. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um bis zu 3 Flaschen zu kombinieren, um einen dicht besiedelten Sammelkäfig zu erzeugen.
      HINWEIS: Alternativ können Fliegen mit CO₂ oder anderen Fliegenschlafmitteln anästhesiert werden; dies erhöht jedoch die Akklimatisierungszeit in Schritt 1.2.
2. Akklimatisieren Sie den neuen Sammelkäfig für 24-48 h. Wenn CO₂ oder andere Schlafmittel verwendet wurden, akklimatisieren Sie den Sammelkäfig für mindestens 48 h.
   1. Ersetzen Sie den Traubenteller im Sammelkäfig durch einen frischen, der zweimal täglich, 8-10 h, Hefepaste enthält.
3. Richten Sie alle 5 Tage einen frischen Sammelkäfig ein.

2. Sammeln und Vorbereiten von Embryonen für die Bildgebung

1. Gewinnung von Embryonen mit synchronisierter Entwicklung
   1. Tauschen Sie den Traubenteller auf dem Sammelkäfig mit einem frischen mit einem Tupfer Hefepaste in der Mitte. Lassen Sie Fliegen Embryonen für 1 h legen. Den alten Traubenteller zu tossen.
      HINWEIS: Fliegen können Embryonen befruchten, bevor sie gelegt werden. Die erste Sammelplatte wird viele dieser vorentwickelten Embryonen enthalten. Wenn fliegen deiner Embryonen zuerst alte Embryonen abgeworfen werden können, wird die Entwicklungssynchronisierung zwischen Embryonen verbessert.
   2. Tauschen Sie die Traubenplatte gegen eine frische mit einem Tupfer Hefepaste in der Mitte und lassen Sie Fliegen Embryonen für 10 min legen. Den alten Traubenteller zu tossen.
      HINWEIS: Um eine Verlangsamung der embryonalen Entwicklung auf kalten Tellern zu vermeiden, erwärmen Sie die Traubenplatte und Hefepaste vor der Verwendung auf Raumtemperatur.
   3. Tauschen Sie den Traubenteller mit einem frischen (ohne Hefepaste) und speichern Sie die alte Traubenplatte, es hat die Embryonen für die Bildgebung. Falls erforderlich, fahren Sie mit dem Sammeln von Embryonen aus diesem Käfig fort, indem Sie Schritt 2.1.2 und 2.1.3 wiederholen.
2. Alter sammeln Embryonen für 30-45 min zu Bild synzytial Divisionen²³.
   HINWEIS: Um das synzytiale Blastoderm-Stadium in der embryonalen Entwicklung abzubilden, müssen die Embryonen innerhalb von 90 min nach der Entnahme montiert und am Mikroskop montiert werden. Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal versuchen, altern Embryonen 10-20 min in Schritt 2.2, um zusätzliche Zeit für die Einrichtung zwischen den Schritten zur Verfügung zu stellen.
3. Dechorionate Embryonen mit 50% Bleichmittel in DI-Wasser.
   1. Übertragen Sie gealterte Embryonen aus Schritt 2.2 in ein 140 nm Sieb, indem Sie die Traubenplatte mit DI-Wasser füllen, die Embryonen sanft mit einem Pinsel vertreiben und das Wasser mit Embryonen in das 140 nm Sieb gießen (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Dies kann über eine Spüle oder 1.000 ml Becher erfolgen.
   2. Mit einer Spritzflasche Embryonen kräftig mit einem DI-Wasser abspülen. Trockene Embryonen, indem Sie das Sieb auf ein trockenes Papiertuch bersten. Blot das Sieb, bis es aufhört, Wasserspuren auf dem Papiertuch zu hinterlassen (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Entfernen Sie alle Hefepaste von Embryonen, da sie die Bleichbehandlung im nächsten Schritt unwirksam machen kann.
   3. Füllen Sie eine leere 10 cm Platte mit frisch zubereiteten 50% Bleichmittel mit DI-Wasser verdünnt (1:1 Bleichmittel: DI-Wasser). Tauchen Sie das Sieb in 50% Bleichmittel für 2 min 45 s. Starten Sie eine Stoppuhr, sobald das Sieb die 50% Bleichmittel berührt. Blot das Sieb in und aus der 50% Bleiche 3-4x in den ersten 15 s embryo Klumpen zu brechen (Abbildung 1C).
   4. Mit einer Spritzflasche Embryonen mit DI-Wasser kräftig abspülen. Trocknen Sie die Embryonen, indem Sie das Sieb auf ein trockenes Papiertuch bersten. Kräftiges Spülen und Blot-Trocknungsverfahren für 5x wiederholen (Abbildung 1D).
      HINWEIS: Dies ist der wichtigste Schritt zum Entfernen von Resten. Verwenden Sie eine volle DI Spritzflasche und verwenden Sie die Hälfte der Flasche in diesem Schritt.
   5. Die blotgetrockneten Embryonen aus dem Sieb auf eine 10 cm-Traubenplatte mit einem Pinsel übertragen²¹ (Abbildung 1E)
      HINWEIS: Manuelle Dichlorination kann als Alternative zur Bleichdekoration²⁴verwendet werden.

Abbildung 1: Embryo-Dechorionation. (A) Embryonen wurden mit einer DI H20 Spritzflasche, einem Pinsel und einem 140 nm Sieb gesammelt. (B) Embryonen wurden mit einer DI H20 Spritzflasche kräftig gespült und trocken über einem Papiertuch ausgeblutet. (C) Die Dechorionation von Embryonen wurde in 50% Bleichmittel für 2 min und 45 s durchgeführt. (D) Embryonen wurden mit einer DI H20 Spritzflasche kräftig geräuscht und über einem Papiertuch trocken gefleckt. Dies wurde 4 Mal wiederholt, um überschüssige Chorion zu entfernen. (E) Embryonen wurden dann mit einem Pinsel auf 10 cm Traubenplatte übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3. Anhäufung von Embryonen an Abdeckungen

1. Unter einem Stereomikroskop mit Overhead-Gänsehalsbeleuchtung, organisieren Sie zwei Reihen von 15-20 Embryonen auf einem sauberen Abschnitt der Traubenplatte mit einem Eierpflücker-Werkzeug. Richten Sie die Embryonen auf ihrer ventralen Seite in der gleichen Ausrichtung in Bezug auf vordere und hintere Enden aus. Um Eierpflücker biegen feine Spitze Edelstahl Pinzette auf 45° Winkel. Zur Überprüfung der D/V-Embryos-Orientierung siehe Campos-Ortega et al.²⁰.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die ventrale Oberfläche auf der Traubenplatte sitzt, da die Embryonen in Schritt 3.5 auf einen Abdeckschlupf gepresst werden, wodurch die dorsale Oberfläche für die Bildgebung freigelegt wird. Da die dorsale Oberfläche viel flacher ist als die ventrale Oberfläche, erhöht die Abbildung der dorsalen Seitenoberfläche die Anzahl der Kerne, die innerhalb einer einzigen Z-Ebene vorhanden sind.
2. Bereiten Sie 75 mm x 25 mm Silikon-Abstandsdeckel vor.
   HINWEIS: Dies kann im Voraus vorbereitet werden. Bereiten Sie mehrere Abdeckungen vor und lagern Sie sie in einer Folienbox, um sie sauber zu halten.
   1. Verfolgen Sie den Umriss eines 75 mm x 25 mm Abdeckschlupfes auf ein 1,6 mm dickes Silikon-Abstandsblech und schneiden Sie den Silikonabstand mit einer Schere aus (Abbildung 2A).
   2. Mit einer Rasierklinge einen 40 mm x 15 mm Einset aus dem Abstandshalter ausschneiden (Abbildung 2A).
   3. Den Abstandsabstand auf den Deckelschlupf und Streifen 10 L Heptankleber nach unten den belichteten Deckelrutsch Glaseinset (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Das Absetzen und sogar Der Streifen stellt die Bildgebung von Embryonen auf derselben z-Ebene sicher.
3. Während der Heptankleber aus Schritt 3.2.3 trocknet, schneidet einen rechteckigen Abschnitt der Traubenplatte aus, der die Embryonen aus Schritt 3.1 enthält.
   1. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um ein Rechteck (kleiner als 40 mm x 15 mm) um die beiden Embryonenreihen zu schneiden. Entfernen Sie das Rechteck noch nicht.
   2. Schneiden Sie ein zweites Rechteck neben dem ersten aus. Entfernen Sie das zweite Rechteck mit der geraden Randseite eines Spachtelaus aus Edelstahl.
   3. Schieben Sie vorsichtig die gerade Kante eines Spachtelaus aus Edelstahl unter das erste Rechteck und entfernen Sie ihn (Abbildung 2B).
4. Legen Sie den Traubentellerausschnitt mit Embryonen auf die Außenseite einer 3,5 cm großen Schale(Abbildung 2C).
5. Senken Sie unter einem Stereomikroskop einen vorbereiteten Deckelüberschlag über die Embryonen und drücken Sie vorsichtig die beiden Embryonenreihen auf den Kleber (Abbildung 2D).
6. Wenn Mikroinjektionsembryonen, springen Sie zu Schritt 4.1. Wenn nicht Microinjecting setzen Schritt 3.7.
7. Bedecken Sie Embryonen, indem Sie den Silikon-Abstandsraum (halb nach oben) mit 1:1 - Halocarbonöl 700: Halocarbonöl 27 füllen.
8. Säen Sie die unteren Ränder eines 4-Schiebeplattenadapters mit doppelseitigem Klebeband, um zu verhindern, dass sich die Abdeckung verschiebt, aber stellen Sie sicher, dass das Band nicht in den Pfad der Objektivlinse gelegt wird. Dieses Band ist entscheidend. Wenn der Coverslip nur auf dem Adapter sitzt, bewegt er sich während der gesamten Erfassung. Montieren Sie den Deckelschlupf auf dem 4 Gleitplattenadapter.

Abbildung 2: Coverslip-Vorbereitung und Montage. (A) Ein Umriss von 75 mm x 25 mm Deckblatt wurde auf eine 1,6 mm dicke Silikonfolie zurückverfolgt. Verwenden Sie eine Schere, um den Umriss auszuschneiden. 40 mm x 15 mm Einschub wurden aus dem Silikonabstand herausgeschnitten und dann auf den Deckelmontierten montiert. Gestreift 15 l in der Mitte des Einsets. B) Zwei Reihen von 15-20 Embryonen wurden auf einer Traubenplatte in einer Fläche kleiner als 40 mm x 15 mm angeordnet, dann wurde dieser Bereich mit einem Rasiermesser und einem Spachtel aus Edelstahl ausgeschnitten. (C) Ausgeschnittene Traubenteller wurden auf die Oberseite einer leeren 3,5 cm Schale gelegt. (D) Unter einem Stereomikroskop wurde der Deckschein von (A) abgesenkt und die Embryonen auf den Leimstreifen geklebt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

4. Austrocknung und Mikroinjektion von Embryonen

1. Legen Sie den Deckelrutsch mit Embryonen über eine Rutsche, um zu verhindern, dass der Boden des Deckels während der Austrocknung und Mikroinjektion schmutzig wird.
   HINWEIS: Der Deckbeleg wird ohne eine Folie abgebildet. Daher ist ein invertiertes Mikroskop für die Bildgebung notwendig.
2. Entimitieren Sie Embryonen für 5-10 min, abhängig von der Temperatur des Raumes. Die Embryonen, die für die Bildgebung in den repräsentativen Ergebnissen verwendet wurden, wurden 7 min bei 20 °C in einer Kammer ausgetrocknet, die eine 1:1 Schicht Kieselgelperlen über einem Trocknungsmittel enthielt (Abbildung 3A).
3. Unmittelbar nach der Austrocknung Embryonen mit 1:1 bedecken - Halocarbonöl 700: Halocarbonöl 27. Füllen Sie den Silikonabstands auf halbem Weg nach oben.
   HINWEIS: Es ist wichtig, ein hochviskoses Halocarbonöl mit einem niedrigviskosen Halocarbonöl zu mischen. Reines Halocarbonöl 700 (hohe Viskosität) verlangsamt die Zellzyklenprogression 30 min nach der Anwendung. Eine 1:1-Mischung aus Halocarbonöl 700 und Halocarbonöl 27 fixierte dieses Artefakt.
4. Mikroinjektionsnadeln mit Injektor beladen, dann am Mikroinjektor montieren und unter Druck aufschneiden.
   HINWEIS: Üben Sie Schritt 4.4 ein paar Mal, bevor Sie den vollständigen Test mit wertvollen Reagenzien durchführen. Dies ist der schwierigste Schritt im Mikroinjektionsprozess.
   1. Laden Sie Mikroinjektionsnadeln mit 2 L Injektor mit einer verlängerten Ladespitze. Es wird nur eine Mikroinjektionsnadel benötigt, aber es ist gut, dass sie in der Nähe von Ersatznadeln sind, die 2 oder 3 Nadeln vorbereiten.
      HINWEIS: Informationen zu erweiterten Ladespitzen finden Sie in der Tabelle der Materialien. Mikroinjektionsnadeln können aufgrund der einzigartigen Natur unserer Mikroinjektionstechnik, die vor dem Öffnen der Spitze auf dem Luftdruck im Inneren einer versiegelten und geladenen Nadel beruht, nicht ohne verlängerte Ladespitzen geladen werden.
   2. Montieren Sie eine Nadel auf den Mikroinjektor und drücken Sie den Kolben auf halbem Weg zur Spitze. Ziel ist es, den Luftdruck innerhalb der Glaskapillare zu erhöhen (Abbildung 4A).
      HINWEIS: Verwenden Sie einen Mikroinjektor auf Mineralölbasis ohne Mineralöl. Anstatt Druck mit Mineralöl aufzubauen, verwenden Sie den Kolben, um Luftdruck aufzubauen.
   3. Senken Sie die Glasnadel auf eine Glasrutsche und schneiden Sie die Spitze der Nadel mit einem neuen #9 Rasiermesser auf. Schneiden Sie die Nadel in einem 45°-Winkel, um eine scharfe offene Spitze zu erzeugen. Der Injektor sollte bis zum Boden der Spitze fließen, ohne aus der Nadel zu fließen. Fügen Sie vorsichtig 20 l Halocarbonöl über die Spitze der Nadel und schneiden Sie es bei 45° wieder auf. Der Injektor sollte schnell zu fließen beginnen.
   4. Sofortige Senkung des Luftdrucks durch Einziehen des Kolbens, aber stellen Sie sicher, dass eine kontinuierliche Durchflussrate beibehalten wird, um zu verhindern, dass die Nadel mit der Embryomembran zwischen den Injektionen verstopft. (Abbildung 4B).
      HINWEIS: Wenn das Injizant klar ist, sehen Sie sich die Injektionsrate an, indem Sie die Mikroinjektionsnadel in und aus Halocarbonöl heben und die Bildungsrate für injizierende Tröpfchen unter einem Stereomikroskop beobachten. Stellen Sie den Luftdruck ein, indem Sie den Kolben mit ein paar Klicks gleichzeitig drücken, und tauchen Sie dann die Mikroinjektionsspitze in und aus Halocarbonöl, um die Formationsrate für neue Tröpfchen nach der Anpassung anzuzeigen.
   5. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel in der Mitte des Sichtfeldes zu positionieren, heben Sie dann die Nadel mit dem Mikromanipulator an und entfernen Sie den Glasschlitten unter ihr. Die Nadel ist nun für die Injektion kalibriert.

Abbildung 3: Austrocknungskammerdiagramm. (A) Dies ist ein Diagramm einer Austrocknungskammer. Die Kammer besteht aus einer 1:1 Schicht Kieselgelperlen über einer Schicht Von Driedrit. Um die Austrocknung durchzuführen, wurden Embryonen auf einen einzigen Brunnenplattendeckel gelegt. Die Austrocknungskammer wurde 7 min geschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

5. Mikroinjek-Embryonen
   1. Legen Sie die Embryonen auf die Stereomikroskop-Stufe unter Mikroinjektionsnadel, senken Sie aber nicht die Nadel.
   2. Konzentrieren Sie sich auf Embryonen bei 50-facher Vergrößerung.
   3. Senken Sie die Nadel, bis sie in die gleiche Fokusebene wie die Embryonen kommt. Bewegen Sie die Folie mit einer Hand und bedienen Sie den Mikroinjektor mit der anderen, injizieren Sie eine Reihe von Embryonen.
   4. Heben Sie die Nadel an und drehen Sie den Schlitten um 180°, um die zweite Reihe von Embryonen der Mikroinjektionsnadel auszusetzen. Senken Sie die Nadel und injizieren Sie die zweite Reihe von Embryonen.
      HINWEIS: Versuchen Sie, dies in weniger als 10 min zu tun. Lassen Sie einige nicht injizierte Embryonen als Kontrollen verwendet werden.

Abbildung 4: Mikroinjektionsnadelpräparation. (A) In dieserAbbildung ist die Intensität von Magenta in der Nadel repräsentativ für den Luftdruck. Eine geladene Nadel wurde auf den Mikroinjektor montiert und der Kolben wurde um 50% verlängert, um den Luftdruck innerhalb der Nadel zu erhöhen. Stellen Sie sicher, dass der Kolben vor der Montage maximal eingefahren wird. (B) Die Nadelspitze wurde unter Druck geschnitten und der Kolben zurückgezogen, um den Luftdruck und die Durchflussmenge zu verringern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Imaging auf einem Hochgehaltsanalysator

1. Erstellen Sie vor dem Ausführen dieses Testes eine Plattenkarte für einen Folienadapter. Verwenden Sie den Plattenhalter-Editor im Menü Plattenkarten-Manager, um die Dimension für einen benutzerdefinierten Plattenadapter einzugeben.
   HINWEIS: Für den handelsüblichen Plattenadapter wurde eine benutzerdefinierte Plattenkarte erstellt (siehe Materialtabelle). Die Plattenkarte enthält die folgenden Einstellungen; Schlittendicke: 1000 m, Bodenhöhe: 1.607 mm, Bodenhöhenvariabilität: 100 m, Substratmaterial: Glas, Deckblattdicke: 150 m, Deckbedeckungsposition: unten – Reihen: 1 – Abstand: 56,987 mm, Spalten: 4 – Abstand 28,391, Größe und Form: Rechteck, Breite 23,00 mm, Höhe: 73,00 mm, Versatz zu A1 21,29 mm – 42,74 mm)
2. Laden Sie den Schiebeadapter auf das Mikroskop, und verwenden Sie die Vorschaufunktion, um ein helles 10-faches Bild des Coverslips zu kacheln.
3. Wählen Sie einen Embryo oben oder unten einer Reihe aus, wählen Sie dann Ziel und wechseln Sie zu 60x (NA 0.95). Bestimmen Sie eine geeignete Exposition für den gewünschten Fluoreszenzkanal.
   HINWEIS: Halten Sie die Laserintensität unter 25 % für die Live-Zell-Bildgebung.
4. Verwenden Sie auf dem Hauptdashboard die Vorschaufunktion, um ein fluoreszierendes 60-faches Bild zu kacheln, das beide Embryonenreihen enthält.
5. Wählen Sie im Haupt-Dashboard das Dropdown-Menü Binning aus und stellen Sie die Binning auf 1 x 1 für eine optimale Auflösung ein.
6. Verwenden Sie die Registerkarte z Stack Setup, um Parameter für z-Stacks zu definieren.
   1. Verwenden Sie auf der Registerkarte z Stack Setup die Pfeile nach oben und unten, um die oberen und unteren z-Stack-Grenzwerte zu ermitteln. Sobald die oberen und unteren Grenzwerte definiert sind, wählen Sie das grüne Bleistiftsymbol aus, um die Z-Stack-Position zu speichern. Beachten Sie die z-Stack-Position, wie sie in Schritt 5.6.5 verwendet wird.
   2. Verwenden Sie auf der Registerkarte z Stack Setup das Eingabefeld z Step, um den Abstand zwischen z-Slices zu definieren.
      HINWEIS: Die Gesamtzahl der Slices wird durch Modulation der Schritte 5.6.1 und 5.6.2 bestimmt.
   3. Klicken Sie auf dem Haupt-Dashboard mit der rechten Maustaste auf den Fluoreszenzkanal, und verwenden Sie das Dropdown-Menü Bildmodus, um den Bildverarbeitungsmodus auf 3D einzustellen.
   4. Wählen Sie im Haupt-Dashboard die Laser-Autofokus-Box aus, um den Autofokus zu deaktivieren.
   5. Definieren Sie auf dem Haupt-Dashboard den Anfangsfokus mit der Z-Stack-Position aus Schritt 5.6.1 und wählen Sie dann die Initial Focus Box aus, um die Funktion"Neufokus an jedem Zeitpunkt"zu deaktivieren.
7. Verwenden Sie auf der Registerkarte Felder das Dropdown-Menü Feldplatzierung, um benutzerdefinierte Punktezu aktivieren, und verwenden Sie dann die Pfeile, um Punkte für die Bildgebung auszuwählen.
   HINWEIS: Das Zeitintervall zwischen den Erfassungen (Schritt 5.8) bestimmt, wie viele benutzerdefinierte Punkte gleichzeitig abgebildet werden können.
8. Wählen Sie auf der Registerkarte Zeitreihe das Feld Zeitreihen erfassen aus, um die Zeitreihenfunktion zu aktivieren, und definieren Sie dann die Gesamtzahl der Zeitpunkte.
   HINWEIS: 6 benutzerdefinierte Punkte x 5 Z Slices x 80 Stacks = 2.400 Images, 2.400 Bilder x 8,2 MB pro Bild = 19,68 GB Speicherplatz.
9. Verwenden Sie im Hauptdashboard das Feld Namenseingabe, um die Erfassungseinstellungen zu benennen, und wählen Sie dann Datei und Speichern aus, um die Erfassungseinstellungen zu speichern.
10. Wählen Sie im Hauptdashboard die Schaltfläche Scannen aus, um die Erfassung auszuführen.

6. Bildverarbeitung nachstellen

1. Ziehen Sie die xdce-Datei in Fidschi, um die Bildserie als mehrdimensionalen Hyperstack zu öffnen.
2. Speichern Sie den Hyperstack als tIF-Datei.
3. Erstellen Sie maximale Intensitätsprojektionen und speichern Sie sie als tIF-Dateien.
4. Stellen Sie eine Bibliothek mit Projektionen mit maximaler Intensität zusammen, und erstellen Sie eine Pipeline für die Datenextraktion und -analyse.

Ergebnisse

Der in diesem Protokoll vorgestellte Ansatz wurde verwendet, um die Rolle von Mikrotubuli bei der Reorganisation von Endoplasmaic Reticulum (ER) während der Mitose im Drosophila-Embryo ¹⁵zu untersuchen. Während der Mitose zeigt die Struktur des ER eine dramatische Reorganisation, aber die Kräfte, die diese Veränderungen vorantreiben, sind schlecht verstanden. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine Familie von ER-Formierproteinen die Bildung von ER Tubule^25,26,27,28, fördert, die für ihre Nähe zu Mikrotubuli²⁸bekannt sind. Um die Rolle der Mikrotubuli auf er-Morphologie zu untersuchen, wurden die im Protokoll vorgesehenen Methoden verwendet, um Daten zu generieren, um die Auswirkungen mehrerer mikroinjizierter Arzneimittelbehandlungen auf die ER-Reorganisation während der Mitose quantitativ zu vergleichen. Colchicin, das eine neue Mikrotubulipolymerisation verhindert, hat festgestellt, dass es die Reorganisation des ER während der Mitose drastisch reduziert, wie in Abbildung 5 und Abbildung 6dargestellt. Darüber hinaus ermöglichte der hier beschriebene Ansatz die Erstellung von Zeitrunden-Bilddaten für 32 Embryonen. Mittelwert- und Max-Intensitätsmessungen wurden aus 12.800 Interessengebieten mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Skript erstellt, das auch beschreibende und inferentiale Statistiken generierte, die für Vergleiche zwischen medikamentösen Behandlungen unerlässlich sind. Aufgrund der Verfügbarkeit molekularer Sonden und der Einfachen von Mikroinjektionen sind die hier beschriebenen Methoden leicht anpassungsfähig, um eine Vielzahl biologischer Prozesse mittels Fluoreszenzintensitätsquantifizierung zu untersuchen.

Abbildung 5: Repräsentative Bilder der Rtnl1-GFP- und ReepB-GFP-Anreicherung an den Spindelstangen während der Mitose. (A) 60x Sichtfeld von ReepB-GFP während der Mitose im Zellzyklus 10. Das blaue Quadrat stellt das Sichtfeld dar, das für die Bedienfelder B-E verwendet wird. Panel A wird mit einem binären Schwellenwertfilter verarbeitet. Dieser Filter wurde nicht auf die Bedienfelder B-E angewendet, da er Daten von Pixeln unterhalb des festgelegten Schwellenwerts ausschließt. (B,D) ReepB-GFP unter Kontrolle und in Colchicin. (C,E) Rtnl1-GFP unter Kontrolle und in Colchicin. Diese Zahl wurde von Diaz et al.¹⁵geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Quantifizierung der Rtnl1-GFP- und ReepB-GFP-Anreicherung an den Spindelstangen während der Mitose. 20 Spindeln und 20 Zytoplasma-ROIs über 10 Frames wurden für 32 Embryonen unter folgenden Bedingungen analysiert. (A) 10% DMSO-Kontrollinjektionen für Rtnl1-GFP. Kontrollembryonen zeigten eine 0,1-fache Erhöhung der Anreicherung (p<0.001 für alle Proben bei T210) im Vergleich zu nicht injizierten Proben (p < 0,001 für alle Proben bei T210). (B) ReepB-GFP-Embryonen, die mit 10 % DMSO injiziert werden, um als Kontrolle dienen. Kontrollembryonen zeigten eine 0,1-fache Erhöhung der Anreicherung (p<0.001 für alle Proben bei T210) im Vergleich zu nicht injizierten Proben(Abbildung 1E; p < 0,001 für alle Proben bei T210). (C) Rtnl1-GFP-Embryonen, die mit 5 M Colchicin injiziert werden. Hier haben wir eine Reduktion der Rtnl1-GFP-Anreicherung auf Spindeln (p < 0,001 für alle Proben bei T210) im Vergleich zu den Kontrollen (A) (p < 0,001 für alle Proben bei T210) gemessen. (D) ReepB-GFP-Embryonen, die mit 5 M Colchicin injiziert werden. Wir haben eine Reduktion der ReepB-GFP-Anreicherung auf Spindeln (p<0.001 für alle Proben bei T210) im Vergleich zu den Kontrollen (B) (p<0.001 für alle Proben bei T210) gemessen. Diese Zahl wurde von Diaz et al.¹⁵geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Hefepaste21	2. Traubenteller21	3. Heptankleber24
1.1 7 Gramm aktive Trockenhefe zu einem 50 ml konischen geben. Fügen Sie 9 Milliliter DI-Wasser hinzu und mischen Sie mit einem Metallspachtel gleichmäßige Konstanz.	2.1 Lösung a: Fügen Sie 6 Gramm Agar zu 140ml DI-Wasser in einem 250ml Kolben hinzu und autoklavieren Sie es.	3.1 Füllen Sie eine Glasszintillationsflasche mit 50 Zoll doppelseitigem Klebeband.
1.1 7 Gramm aktive Trockenhefe zu einem 50 ml konischen geben. Fügen Sie 9 Milliliter DI-Wasser hinzu und mischen Sie mit einem Metallspachtel gleichmäßige Konstanz.	2.2 Lösung b herstellen: 0,1 Gramm Methylparaben in 2ml Ethanol mischen und dann 60 ml Grapefruitsaftkonzentrat hinzufügen.	3.2 20 ml Heptan hinzufügen und Glasszintillationsflasche mit Parafilm versiegeln. Drehen Sie über Nacht bei Raumtemperatur.
	2.3 Unmittelbar nach dem Autoklavieren Lösung a mischen sie in Lösung b und gießen Sie die Mischung in 10 x 35mm Perti-Gerichte. (macht 35 Traubenteller)	3.3 Entfernen Sie Kunststoffband-Abfall, indem Sie den Kleber 15 Minuten lang in 2 15 ml konische Schläuche und Zentrifugieren bei 3000 U/min übertragen.
	2.4 Lassen Sie Traubenteller über Nacht bei Raumtemperatur mit abschaltenden Tellerdeckeln einstellen. Platten mit Deckeln abdecken und nach dem Einstellen in 4C° lagern.	3.4 Leim überlagern sie zur Lagerung in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre.

Tabelle 1: Medienrezepte und Lösungen.

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ist sehr vielseitig und leicht anpassungsfähig für die Untersuchung biologischer Ereignisse in einer Vielzahl von Stadien der Embryonalentwicklung von Drosophila. Dieses Protokoll eignet sich gut für die Untersuchung biologischer Prozesse, die über lange Zeiträume hinweg auftreten. Zum Beispiel, Studien der Zellularisierung^29,30 oder die Bildung von Heterochromatin-Domänen in Drosophila^31,32 könnte von der Verwendung der in diesem Protokoll beschriebenen Methoden profitieren, da diese Prozesse über einen längeren Zeitraum auftreten. Darüber hinaus kann die Stichprobengröße durch abnehmende Vergrößerung erhöht werden, um Fragen zu untersuchen, die weniger optische Auflösung erfordern, wie z. B. das Timing zwischen den Synzytial-Divisionen³³ oder die Dauer der Gastrulation³⁴.  Ebenso ermöglicht ein 20-faches Objektiv die Abbildung von zwei Embryonen innerhalb einer Bildebene. Die Methoden in diesem Protokoll bieten eine dynamische Plattform, um biologische Fragen zu stellen, indem sie die embryonale Entwicklung als Modellsystem für die quantitative Analyse verwenden.

Dieses Protokoll besteht aus drei wichtigen Schritten. Nach der Dechorionation bei 50% Bleichmittel ist es zwingend erforderlich, dass Embryonen fünfmal kräftig gespült und getrocknet werden (2.3.4). Dieser Schritt entfernt alle übrig gebliebenen kleinen Akkordstücke. Übrige Chorion wird das Sichtfeld bei der Abbildung des Embryos behindern. Bei der Montage der Embryonen auf den Glasdeckel (3.5) ist es wichtig, die Embryonen mit gleichmäßigem Druck auf den Leim zu drücken. Dadurch werden die Embryonen auf der gleichen z-Ebene platziert. Beim Schneiden der Mikroinjektionsnadel ist es wichtig, den Kolben sofort zurückzuziehen, um die Durchflussrate der Nadel einzustellen, oder Sie verlieren alle Ihre Injektion.

Unsere Studie wurde durch zwei Faktoren begrenzt. Der erste Faktor war kein automatisierter Segmentierungsprozess. Wir haben jedoch ein manuelles Segmentierungsskript mit MATLAB entwickelt; mit einem genetisch kodierten Spindelmarker könnte dieser Prozess automatisiert werden. In Zukunft möchten wir CNN-RFP²¹, Rtln1-GFP und CNN-RFP produzieren; Transgene ReepB-GFP-Linien zur automatisierten Spindelsegmentierung. Weitere Informationen zu unserer MATLAB-Skript- und Analysepipeline finden Sie unter ergänzenden Materialien von Diaz et al.¹⁵. Zweitens waren wir auch durch unser Erfassungsintervall von 35 s eingeschränkt, was uns nur erlaubte, 6 Embryonen gleichzeitig abzubilden. Ein längeres Erfassungsintervall würde es uns ermöglichen, mehr Embryonen gleichzeitig abzubilden. Obwohl der Durchsatz der Arzneimittelabgabe erhöht werden kann, indem die Mikroinjektion durch einen Permeationsschritt ersetzt wird, hielten wir dies für unnötig, da unsere Stichprobengröße bereits durch das Erfassungsintervall begrenzt war.

Während dieses Protokoll verwendet wurde, um Drosophila embryonale Entwicklung abzubilden, ist der Gesamtansatz anpassungsfähig für die Untersuchung der embryonalen Entwicklung in anderen multizellulären Modellsystemen, wie C. elegans, Sea Urchins, und Xenopus. Embryonen sind äußerst nützlich für die quantitative Analyse, da sie leicht durch Entnahme oder Befruchtung synchronisiert werden können. Darüber hinaus bewegen sich Embryonen nicht aus einem Sichtfeld oder schwimmen weg, was die Verwendung einer einfachen Multipoint-Erfassungssoftware ermöglicht, um mehrere Zeitraffervideos für die quantitative Analyse zu erstellen. Obwohl wir in unserer Studie einen Analyser mit hohem Inhalt verwendet haben, kann jedes invertierte Mikroskopsystem, das multipoint-erfassung ist, mit den hier genannten Methoden gekoppelt werden.

Ähnliche Ergebnisse können mit einem Multipoint-Erfassungsfähigen invertierten konfokalen Mikroskop erzielt werden; Die Vorteile eines Analyseprogramms mit hohem Inhalt ergeben sich jedoch, wenn die Stichprobengröße erhöht wird, um Fragen zu untersuchen, die weniger zeitliche Auflösung erfordern. Ein offensichtlicher Vorteil bei der Verwendung eines Analysators mit hohem Inhalt ist die Möglichkeit, 4 separate Dias gleichzeitig abzubilden, verglichen mit 1 Folie auf herkömmlichen Systemen. Mit einem vollständigen Satz von 4 Dias und 40 Embryonen auf jedem Dia können 160 Embryonen über mehrere Stunden abgebildet werden, solange das Erfassungsintervall mindestens 15 min zwischen den Rahmen beträgt. Ein weiterer wichtiger Vorteil bei der Verwendung eines Hochgehaltsanalysators besteht darin, dass die Proben vollständig von externen Lichtquellen abgeschottet sind, was für fluoreszenzintensitätsbasierte Messungen erforderlich ist. Schließlich verfügt der in unserer Studie verwendete High-Content-Analysator über eine 5,5-Megapixel-CMOS-Kamera, die ein großzügiges Sichtfeld von 221,87 m bei 60-facher Vergrößerung bietet. Dieses größere Sichtfeld ermöglichte es uns, einen halben Embryo pro Erfassungspunkt abzubilden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 x 35mm Micro Dish	VWR	Cat #: 10799-192	N/A
100% Traubensaftkonzentrat	Welch's, 100% Konzentrat Traubensaft	N/A	Kauf im Lebensmittelgeschäft
250ml Erlenmeyerkolben, engmaulig	VWR	Cat #: 10536-914	N/A
3" nichtmetallisches Sieb Nr. 140	Gilson Company	SV-165 #140	N/A
4 Slide Imaging Tablett	Grace Biolabs	SKU: 400104	N/A
ACROS Organics , n-Heptan, 99+%, für die Spektroskopie	Fisher Scientific	Kat #: AC411255000	N/A
Acros Organics, Ethanol, 99,5%, ACS Reagenz, absolut, 200	proof Fisher Scientific	Cat# : AC615095000	N/A
Acros Organics, Methyl-4-hydroxybenzoat, 99% . (Methylparaben)	Fisher Scientific	Cat#: AC126961000	N/A
Deckglas, rechteckig, 25 x 75 mm, #1 Floatglas	Fisher Scientific	Cat #: 50-143-782	N/A
Culture Well Silikon Plattenmaterial - 1,6 mm dick	Grace Biolabs	SKU: 664273	N/A
DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Flüssigszintillation Fläschchen	Fisher Scientific	Cat #: 03-341-71A	N/A
Embryo-Entnahme Cage-Mini	Genesee Scientific	Katze #: 59-105	N/A
Eppendorf Microloader Pipettenspitzen	Fisher	Scientific Produktcode: 10289651	N/A
Falcon 15mL Konische Zentrifuge	Fisher Scientific	Katze #: 05-527-90	N/A
Falcon 50mL Konische Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	Katze #: 14-432-22	N/A
Fleischmann's, Aktive Trockenhefe	Fleischmann's	N/A	Kauf im Supermarkt
Traubenplatten	REFFER ZUR REZEPTVORBEREITUNG	N/A	N/A
Halogenkohlenstoff 27 Öl	Genesee Scientific	Kat #: 59-133	N/A
Halogenkohlensäure 700 Öl	Genesee Scientific	Kat #: 59-131	N/A
Heptankleber	REFFER ZUR REZEPTVORBEREITUNG	N/A	N/A
Industrielle Rasierklingen (Chirurgischer Kohlenstoffstahl) Einschneidig Nr. 9	VWR	Cat #: 55411-050	N/A
Parafilm M Labor-Versiegelungsfolie, 4 Zoll x 250 Fuß Rolle	Fisher Scientific	Cat #: 50-998-944	N/A
Scotch Doppelseitiges Klebeband mit Spender, schmale Breite, Entwickelt für die Verklebung, 1/2" x 7 yds., 3/Pack Caddy	Fisher Scientific	Cat #: NC0879005	N/A
Kieselgelkügelchen, Trockenmittel ~ 2 - 5 mm	Millipore Sigma	Artikelnummer: 1077351000	N/A
Edelstahl Löffel/Spatel	VWR	Kat #: 470149-044	N/A
W.A. Hammond Drierit anzeigende Absorptionsmittel	Fisher Scientific	Kat #: 23-116582	N/A
Hefepaste	REFFER ZUR REZEPTVORBEREITUNG	N/A	N/
AEQUIPMENT
Allegra X-12 Tischgerät, Zentrifuge	Beckman Schar	N/A	Sie benötigen Zugang zu 15 ml konischen Zentrifugeneinsätzen.
Autoklav	N/A	N/A	Jeder Autoklav ist geeignet.
Drummond Nanoject II Mikroinjektor.	Drummond Scientific	N/A	Hierbei handelt es sich um ein Injektionssystem auf Mineralölbasis.
GE Healthcare IN Zellanalysator 6000.	GE healthcare	N/A	Ein schnelles konfokales Mikroskop, das Mehrpunkterfassung ermöglicht, kann ersetzt werden.
Kühlschrank (4C°)	N/A	N/A	Flugmedium und Hefepaste müssen bei (4C°) gelagert werden.
Zies Stemi 508 Stereomikroskop mit Durchleuchtungssockel 300 und Schwanenhalsbeleuchtung.	Zeiss Mikroskopie	N/A	Die Durchleuchtungsbasis und die Schwanenhalsbeleuchtung sind erforderlich.