Visualisierung der Diffusionsdynamik von Gold-Nanostäben auf der Zellmembran mit Single Nanoparticle Darkfield-Mikroskopie

Summary

Hier zeigen wir den Einsatz der traditionellen Dunkelfeldmikroskopie zur Überwachung der Dynamik von Gold-Nanostäben (AuNRs) auf der Zellmembran. Die Position und Ausrichtung einzelner AuNRs wird mit ImageJ und MATLAB erkannt, und die diffusiven Zustände von AuNRs sind durch eine einzelfaktnverfolgte Analyse gekennzeichnet.

Abstract

Die Analyse der Diffusionsdynamik von Nanopartikeln auf der Zellmembran spielt eine wichtige Rolle für ein besseres Verständnis des zellulären Aufnahmeprozesses und bietet eine theoretische Grundlage für die rationale Gestaltung der Nanomedizin-Entbindung. Die Einzelpartikelverfolgungsanalyse (SPT) könnte die Position und Ausrichtung einzelner Nanopartikel auf der Zellmembran untersuchen und deren Translations- und Rotationszustände aufzeigen. Hier zeigen wir, wie sie die traditionelle Dunkelfeldmikroskopie nutzt, um die Dynamik von Gold-Nanostäben (AuNRs) auf der lebenden Zellmembran zu überwachen. Wir zeigen auch, wie Sie die Position und Ausrichtung von AuNRs mit ImageJ und MATLAB extrahieren und die diffusiven Zustände von AuNRs charakterisieren. Die statistische Analyse von Hunderten von Partikeln zeigt, dass einzelne AuNRs Brownsche Bewegungen auf der Oberfläche der U87 MG-Zellmembran durchführen. Die individuelle Langzeitanalyse zeigt jedoch, dass AuNRs zwei deutlich unterschiedliche Arten von Bewegungszuständen auf der Membran aufweisen, nämlich Langstreckentransport und ein begrenztes Gebiet. Unsere SPT-Methoden können potenziell verwendet werden, um die Oberflächen- oder intrazelluläre Partikeldiffusion in verschiedenen biologischen Zellen zu untersuchen und kann zu einem leistungsfähigen Werkzeug für Untersuchungen komplexer zellulärer Mechanismen werden.

Introduction

Die Dynamik von Nanopartikeln (NPs) auf der Membran ist eng mit dem zellulären Aufnahmeprozess verbunden, der für das Verständnis von Zellfunktionen, viralen oder bakteriellen Infektionen und der Entwicklung künstlicher nanomedizinischer Abgabesysteme^1,2wesentlich ist. Die Single-Partikel-Tracking-Technik (SPT) ist ein robustes Werkzeug zur Charakterisierung des heterogenen Verhaltens von NPs^3,4. Im Allgemeinen ist die Zellmembran flüssig, was bedeutet, dass sich die Komponenten wie Proteine und Lipide seitlich in der Plasmamembranebene

Protocol

1. Zellkultur

1. Bereiten Sie ein komplettes Medium für U87 MG-Zellen vor, indem Sie fetales Rinderserum hinzufügen (Endkonzentration 10%) und Penicillin-Streptomycin (Endkonzentration 1%) auf das minimale wesentliche Medium (MEM). Verwenden Sie Kunststoff-Zellkulturschale für Zellen Subkultur.
2. Durchgangszellen 2 bis 3 Mal pro Woche.
   1. Entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Zellschicht mit der phosphatgepufferten Saline (D-PBS) von Dulbecco 2-3 mal, wenn sie konfluent ist (80 % bis 90 %).
   2. Fügen Sie der Zellkulturschale 1,0 bis 2,0 ml Trypsin-EDTA-Lösung hinzu und beobachten Sie Zellen unter einem invertierten Mikroskop, bis....

Results

Im Protokoll wurden die unveränderten 40 x 85 nm CTAB-AuNRs verwendet. Wie in Abbildung 2Bdargestellt, liegt sein Längsplasmamaximum bei 650 nm (roter Bereich) und die Querresonanz bei 520 nm (grüner Bereich). Frühere Literaturen haben gezeigt, dass sich die optischen Eigenschaften (wie die LSPR-Intensität) von plasmonischen AuNRs mit ihrem Durchmesser^20,22signifikant verändern werden. In Abbildung 2Czei.......

Discussion

Das vorgestellte Protokoll wird verwendet, um die Dynamik von AuNRs auf Zellmembran zu untersuchen. Das Protokoll besteht aus vier Teilen, einschließlich mikroskopischer Bildgebung, Datenextraktion, Berechnung dynamischer Parameter und Datenanalysemethoden, und jedes Teil ist flexibel und universell. Daher gibt es viele mögliche zukünftige Anwendungen, zum Beispiel die Untersuchung der Bewegung von NP-verknüpften Membranmolekülen auf der Membran, endozytose Dynamik von NP-markierten Rezeptoren, dynamische Analyse von int.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAB-beschichtete Gold-Nanostäbchen (CTAB-AuNRs)	Nanoseedz	NR-40-650	85 nm * 40 nm
Farb-CMOS-Kamera	Olympus	DP74	Japan
Deckgläser	Citoglas	z10212222C	22*22 mm
Dunkelfeldmikroskopie	Nikon	80i	aufrechtes Mikroskop
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco	10099141
Fiji	National Institutes of Health	2.0.0-rc-69/1.52 p	eine Verteilung von ImageJ
Rillenglasschlitten	Segel Marke	7103	Einfach konkav
Image J	National Institutes of Health	1.52 j
MATLAB	MathWorks	R2019b
MATLAB Code			https://github.com/fenggeqd/JOVE-2020
Minimum essentielles Medium (MEM)	Gibco	10-010-CVR	mit Phenolrot
Minimum essentielles Medium (MEM)	Gibco	51200038	kein Phenolrot
Herkunft	HerkunftLab	Origin Pro 2018C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Zellkulturschalen aus Kunststoff	Falcon	353002
Zellkultur aus Kunststoff Schüsseln	Falcon	353001	35*10 mm
U87 MG Zelle	American Type Culture Collection	ATCC HTB-14	eine humane primäre Glioblastom-Zelllinie