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Methodenartikel

In-vitro-Präparation von aktiv reifenden Knorpelexplantaten von Rindern für die Röntgen-Phasenkontrastbildgebung

938 Ansichten

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DOI:

10.3791/61607

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31. Januar 2022

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1Inserm UA07, Rayonnement Synchrotron pour la Recherche Biomédicale (STROBE), 2Centre of Nanohealth, Swansea University Medical School, 3ISTerre, Université Grenoble Alpes, CS, Grenoble Cedex 9, 4Novitom, R&D Grenoble, 5ESRF, European Synchrotron Radiation Facility, CS, Grenoble Cedex 9

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von in vitro bovinem Gelenkknorpel für die hochauflösende Bildgebung mit Röntgenstrahlen. Diese Explantate durchlaufen aktiv eine postnatale Reifung. Wir beschreiben hier die notwendigen Schritte von der Biopsie bis zur Datenanalyse der 3D-Röntgen-Phasenkontrastbildgebung, über die Explantatkultur, die Gewebefixierung und die Synchrotronpräparation.

Zusammenfassung

Das Verständnis der Mechanismen, die der postnatalen Reifung des Gelenkknorpels zugrunde liegen, ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung der nächsten Generation von Tissue-Engineering-Strategien und die potenzielle Reparatur von erkranktem oder geschädigtem Knorpel. Im Allgemeinen erfolgt die postnatale Reifung des Gelenkknorpels, d. h. eine umfassende Veränderung der Kollagenstruktur und -funktion des Gewebes, um das Wachstum des Organismus zu ermöglichen, über einen Zeitraum von Monaten bis Jahren. Umgekehrt ist die Auflösung der strukturellen Organisation des Knorpels, die auch über lange Zeiträume erfolgt, das Kennzeichen der Gewebedegeneration. Unsere Fähigkeit, diese biologischen Prozesse im Detail zu untersuchen, wurde durch die Erkenntnis verbessert, dass Wachstumsfaktoren eine vorzeitige In-vitro-Reifung von unreifem Gelenkknorpel induzieren können. Die entwicklungs- und krankheitsbedingten Veränderungen, die im Gelenk auftreten, betreffen Knochen und Knorpel, und die Fähigkeit, diese Gewebe gemeinsam abzubilden, würde unser Verständnis ihrer miteinander verflochtenen Rollen erheblich verbessern.

Die gleichzeitige Visualisierung von Weichteil-, Knorpel- und Knochenveränderungen ist heutzutage eine Herausforderung, die es für konventionelle präklinische Bildgebungsverfahren zu bewältigen gilt, die für die Nachsorge von Gelenkerkrankungen eingesetzt werden. Dreidimensionale Röntgen-Phasenkontrast-Verfahren (PCI) werden seit 20 Jahren ständig weiterentwickelt, da sie bei der Abbildung von Objekten mit geringer Dichte eine hohe Leistung aufweisen und im Vergleich zur herkömmlichen Röntgenbildgebung zusätzliche Informationen liefern können.

In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert das Verfahren, das in unseren Experimenten verwendet wurde, von der Biopsie des Knorpels über die Erzeugung von in vitro gereiftem Knorpel bis hin zur Datenanalyse von Bildern, die mit Hilfe der Röntgen-Phasenkontrastbildgebung aufgenommen wurden.

Einleitung

Unreifer Gelenkknorpel ist eine adäquate Unterstützung, um morphologische, strukturelle und biomolekulare Veränderungen1 zu initiieren, um eine adulte gelenkspezifische Funktion zu erhalten. Die wichtigste Veränderung ist die Reorganisation der Kollagenfibrillen von einem, der eine parallele Ausrichtung in Bezug auf die Oberfläche im unreifen Knorpel aufweist, zu einer, bei der die Fibrillen tiefer im Gewebe senkrecht im reifen Knorpel stehen. Die Pseudoschichtung des adulten Knorpels zeigt sich durch die Reorganisation der residenten Chondrozyten entlang der Richtung der Kollagenfibrillenorientierung, wobei die Zellen an der Oberfläche scheibenförmig und parallel zur Oberfläche verlaufen und in den tieferen Zonen die Zellen zunehmend größer und in Säulen organisiert werden. Es ist bekannt, dass sich die postnatale Reifung über viele Monate erstreckt und im Wesentlichen am Ende der Pubertät abgeschlossen ist, so dass die lange Zeitskala die Untersuchung dieses wichtigen Entwicklungsübergangs bestenfalls schwierig oder technisch unmöglich macht, sie im Detail zu untersuchen2. Einige Fortschritte bei der Lösung dieses Problems wurden durch die Entdeckung erzielt, dass der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 und der transformierende Wachstumsfaktor-β1 zusammen in der Lage sind, wichtige physiologische und morphologische Veränderungen zu induzieren, die die Reifung des Gelenkknorpels replizieren 2,3 (Abbildung 1). Die Wachstumsfaktor-induzierte In-vitro-Reifung erfolgt innerhalb von drei Wochen und erfordert keinen biomechanischen Input. Nach der Kultur ist die Kollagen-Typ-II-Expression signifikant reduziert und das Verhältnis von reifen dreiwertigen zu unreifen zweiwertigen Kollagenvernetzungen nimmt zu, wie es beim reifenden Knorpel zu beobachten ist. Auch die Organisation der extrazellulären Matrix und der Kollagenfibrillen ist näher an der des reifen Knorpels, obwohl diese Facette des Übergangs noch nicht abgeschlossen ist. Biochemisch gesehen ahmt die Zusammensetzung des mit Wachstumsfaktoren behandelten Knorpels einen adulten Gelenkknorpelnach 3.

Das in diesem Artikel verwendete Modell basiert auf einem in vitro Kultur von Explantaten mit einem Durchmesser von 4 oder 6 mm, die unter sterilen Bedingungen aus der lateralen Seite des medialen Kondylus des Metacarpophalangealgelenks von unreifen männlichen (7 Tage alten) Rindern exzidiert wurden. Eine dünne Schicht aus verkalktem Knorpel und subchondralem Knochen wurde auf der basalen Seite jedes Explantats belassen. Der Gelenkknorpel wurde in einem klassischen serumfreien Medium Dulbecco's modifiziertem Eagles Medium (hoher Glukosegehalt 4,5 g/L) kultiviert, in dem Insulin-Transferrin-Selen (ITS), 10 mM HEPES-Puffer pH 7,4, Ascorbinsäure und 50 μg/ml Gentamicin zugesetzt wurden. Dieses Kulturmedium wird mit 100 ng/ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) und 10 ng/ml transformierendem Wachstumsfaktor β1 (TGF-β1) ergänzt, die jeden dritten Tag mit Medienwechseln aufgefüllt werden2. Eine stark beschleunigte Knorpelreifung wird durch die Kombination von Wachstumsfaktoren induziert. Diese Änderungen treten innerhalb von 21 Tagen ein. Die Stimulation des Wachstumsfaktors induziert zusätzlich die Apoptose und Resorption aus dem basalen Aspekt und die zelluläre Proliferation in den Oberflächenchondrozyten3. Die Zusammensetzung des Nährmediums wird in Tabelle 1. In Anlehnung an das Modell von Khan et al. 20112werden Gelenkknorpelexplantate mit TGF-β1 in einer Konzentration von 10 ng/μl und FGF2 in einer Konzentration von 100 ng/μl kultiviert (Stammkonzentrationen 10 μg/ml und 100 μg/ml, gelöst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung/0,1 % BSA). Pro 1 ml des Mediums wird 1 μl jedes Wachstumsfaktors verwendet. DMEM-F12 mit L-Glutamin und hohem Glukosegehalt ist ein künstliches Medium, das nach der Ergänzung mit Insulin, Transferrin und Selen (ITS), Ascorbinsäure, Gentamicin und HEPES eine vollständige Supplementierung des Mediums mit allen physiologischen Wachstumsanforderungen bietet, die für die verschiedenen Zelllinien und Explantatkulturen spezifisch sind. DMEM-F12 besteht aus mehreren verschiedenen anorganischen Salzen (z. B. NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, NaH2PO4), Glukose, Aminosäuren (Stickstoffquellen), Vitamine, Co-Faktoren und Wasser. Diese Salze liefern einen ausreichenden Energieeintrag, um das zelluläre Überleben und das normale Wachstum in Kultur aufrechtzuerhalten. Die Mineralionen tragen dazu bei, die Osmolarität nahe an der natürlichen physiologischen Umgebung zu halten. Die höhere Konzentration an Glukose (4,5 g/L) wird verwendet, da Chondrozyten hauptsächlich durch Glykolyse atmen. Eine F12-Medium-Supplementierung wird verwendet, da sie eine Reihe von Quellen für Sulfat, CuSO4, FeSO4, ZnSO4 und MgSO4 Erforderlich für die Synthese von sulfatiertem Glykosaminoglykan. Wie durch farbige Indikatoren (hier Phenolrot) und CO2/HCO-3 Puffer in Kombination mit Phosphaten bleibt der pH-Wert konstant bei einem Wert nahe 7,4. Der wichtigste Atemweg, der von Chondrozyten genutzt wird, ist die Glykolyse, bei der Milchsäure das Endprodukt ist, das einen Anstieg des pH-Werts verursacht, daher wirkt HEPES in Abwesenheit von biomechanischen Kräften, die dazu beitragen würden, lokal produzierte Milchsäure zu entfernen, um eine gepufferte Umgebung für physiologische Prozesse aufrechtzuerhalten. Gentamicin ist ein Aminoglykosid-Antibiotikum, das die äußere bakterielle Kontamination durch Hemmung des Wachstums kontrolliert. Ascorbinsäure wird als mittlere Ergänzung für ihre antioxidative Wirkung verwendet4. Ascorbinsäure ist ein Co-Faktor für Enzyme, Prolylhydroxylasen, die Prolinreste im Kollagen hydroxylieren und seine dreifach helikale Struktur stabilisieren. Das Transferrin dient in der Regel als extrazelluläres Antioxidans (Toxizität und ROS-Reduktionen)5,6. Es wird auch dem Kulturmedium zugesetzt, da es die extrazelluläre Eisenspeicherung und den Transport in der Zellkultur ermöglichen und erleichtern kann. Transferrin bindet Eisen unter physiologischen Bedingungen so fest, dass es praktisch kein freies Eisen gibt, das die Produktion von freien Radikalen katalysiert7. Die Signalübertragung des Insulinhormons von seinem gebundenen Rezeptor erhöht die Absorption mehrerer Elemente wie Glukose und Aminosäuren. Es ist auch an verschiedenen Prozessen beteiligt, wie z. B. dem intrazellulären Transport, der Lipogenese, der Protein- und Nukleinsäuresynthese. Insulin hat eine wachstumsfördernde Wirkung. Selen liegt zusätzlich in der Kompositlösung "Insulin-Transferrin-Selen" als Natriumselenit vor. Es wird hauptsächlich als Cofaktor für (Seleno-) Proteine wie Gluthationperoxidase (GPX), als ergänzendes Antioxidans in der Kultur verwendet. In in vitro artikuläre Chondrozyten scheint ITS die zelluläre Proliferation und die Erhaltung des Phänotyps zu verbessern, indem es die Genexpression im Zusammenhang mit zellulärer Dedifferenzierung und hypertropher Differenzierung hemmt8. Wachstumsfaktoren wie der Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 und der transformierende Wachstumsfaktor-β1 werden dem Kulturmedium zugesetzt. Sie werden verwendet, um die Differenzierung, das Wachstum, die Heilung und die Entwicklung von Zellen zu induzieren und zu regulieren2,3. FGF-2 und TGF-β1 in Kombination fördern auch die zelluläre Proliferation in kultivierten Zellen und Geweben9.

Dieses In-vitro-Reifungsmodell des Gelenkknorpels ist aus drei Hauptgründen nützlich. Erstens ermöglicht uns der beschleunigte Übergang der Entwicklungsphase in diesem Modell, nicht wahrnehmbare Veränderungen zu untersuchen, die über viele Monate in in vivo-Modellen auftreten, wie z.B. die erhöhte Expression von Lysloxidase-L1 während der Reifung10. Zweitens leidet das Tissue Engineering von Gelenkknorpel darunter, dass Knorpel mit einer isotropen Morphologie und Struktur gebildet wird, der bei der Transplantation in Gelenke zur Reparatur von fokalen Defekten funktionell defizitär ist. Das Verständnis, wie man reifungsbedingte Veränderungen induziert, wird die Entwicklung voll funktionsfähiger implantierbarer Geräte beschleunigen. Drittens, und das ist für diese Studie relevant, gibt es degenerative Gelenkerkrankungen wie die Kashin-Beck-Krankheit, die in der Kindheit auftreten und zu schweren Gelenkdeformitäten im Erwachsenenalter führen. Diese spezielle Krankheit ist stark mit geografischen Gebieten (China) mit endemischen Mängeln an Selen und Jod verbunden, von denen möglicherweise Dutzende Millionen Einwohner betroffen sind 11,12,13. Die Untersuchung von Skelettdefekten bei der Kashin-Beck-Krankheit zeigt, dass sie peripubertal auftritt, was auf eine Störung der skelettalen Reifungsprozesse hindeutet. Um die Rolle von Selen im Gelenkknorpel (AC) besser zu verstehen, ist daher ein robustes Modell für das Knorpelwachstum und die Knorpelentwicklung erforderlich. Ein in vitro Wachstumsfaktor-induziertes Reifungsmodell bietet einen nützlichen Ausgangspunkt für Studien über das Wachstum und den Metabolismus von Gelenkknorpel während der Reifung in Gegenwart oder Abwesenheit von Selenionen 14,15,16. Unser Wissen über die Auswirkungen von Selen (Se)-Mangel auf komplexe und miteinander zusammenhängende biologische Prozesse ist nach wie vor sehr gering. Das Hauptproblem liegt in der Tatsache, dass Selen aufgrund seines restriktiven Wirkungsbereichs (erforderliche Konzentration zwischen 40 und 400 μg/kg17) und der sehr geringen Konzentration ein zu untersuchendes Element bleibt. Das Modell der beschleunigten Reifung mit unreifem Rinderknorpel bietet eine noch nie dagewesene Möglichkeit, biologische Veränderungen zu untersuchen, die während einer wichtigen Entwicklungsphase auftreten. Die Se-Konzentration in Organismen wird streng kontrolliert, und dieses Modell ist ein Ausgangspunkt für die Entwicklung bildgebender Verfahren, die eine präzise Verfolgung während der Reifung ermöglichen. Diese Techniken könnten dann ein leistungsfähiges Instrument sein, um Strategien zur Verhinderung des AC-Abbaus zu untersuchen und möglicherweise die Grundlage für neuartige Therapien auf Basis der regenerativen Medizin zu entwickeln.

Die gleichzeitige Visualisierung von Weichteil-, Knorpel- und Knochenveränderungen ist eine große Herausforderung in der konventionellen präklinischen Bildgebung. Dies wäre in der Tat eine wichtige Hilfe für die Nachbeobachtung von Gelenkerkrankungen18,19 . So zeigt beispielsweise die konventionelle Röntgen-Mikro-Computertomographie (μCT) schlechte Leistungen für Weichgewebe, die ihre Verwendung auf die Darstellung von Knochendefekten, Osteophyten und die indirekte Visualisierung von Knorpel beschränken. Die Magnetresonanztomographie (MRT) hingegen wird konventionell für die Weichteilbildgebung eingesetzt, obwohl sie nur wenig in der Lage ist, Veränderungen im Knochen (z. B. Mikroverkalkungen) im Anfangsstadium von Krankheiten präzise wiederzugeben. Die Fähigkeit, empfindlich auf Knochen und Knorpel zu reagieren und die konstitutiven Zellen des Knorpels, der Chondrozyten, zu unterscheiden, ist von enormer Bedeutung. Die Phasenkontrastbildgebung (PCI) beruht auf der Eigenschaft, dass der Brechungsindex der Röntgenstrahlung von Materialien tausendmal größer sein kann als der Absorptionsindex für leichte Elemente. Dadurch wird ein höherer Kontrast für Weichteile im Vergleich zu herkömmlichen Methoden auf Basis der Sohlenabsorption erzeugt. Daher ist die PCI in der Lage, alle Gewebe, aus denen das Gelenk besteht, abzubilden, wobei gleichzeitig sowohl stark absorbierendes (z. B. Knochen) als auch weniger absorbierendes Gewebe (z. B. fibröser Knorpel, Bänder, Sehnen, Meniskus und zugehörige Weichteile (Synovialmembranen und Muskeln)) dargestellt werden)18,19,20,21.

Wie in Ref.20 gezeigt, übertrifft die Röntgen-PCI die anderen präklinischen Bildgebungsmodalitäten für Knorpel. Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, das Verfahren detailliert zu beschreiben und einige repräsentative Ergebnisse zu zeigen. Das Schema der Wirkung von Wachstumsfaktoren auf das unreife Knorpelexplantat ist in Abbildung 1 dargestellt.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Ethical Research Committee der Swansea University genehmigt und das Biopsiematerial wurde unter Lizenz des britischen Ministeriums für Umwelt, Ernährung und ländliche Angelegenheiten (DEFRA) erworben. Dieses Protokoll folgt den Tierhaltungsrichtlinien unserer Einrichtungen.

1. Explantat-Kulturen

  1. Vorbereitung der Explantate aus der Kopfhaut der Rinderkeulen
    1. Bereiten Sie einen saugfähigen Protektor und ein Skalpell vor, ein chirurgisches Standardskalpell mit #10 Skalpellklinge.
    2. Besprühen Sie alle Materialien mit 70%iger Ethanollösung.
    3. Die Rinderkeule (7 Tage alte männliche Ochsen, die mit tierärztlicher Genehmigung vom Schlachthof stammen) mit Wasser einweichen, um Blut und Schlamm zu entfernen.
    4. Reinigen Sie das Bein mit Seife und schrubben Sie es mit einer Bürste.
    5. Bei ausreichender Reinigung das Bein mit 70%igem Ethanol besprühen.
    6. Lege es auf ein saugfähiges Papier.
    7. Schneiden Sie mit einem Skalpell um die Füße herum.
    8. Ziehen Sie eine zarte Linie entlang der Länge des Beins.
    9. Seien Sie besonders vorsichtig im Gelenkbereich.
    10. Entfernen Sie die Haut des Beins vorsichtig entlang der Längsskalpelllinie.
    11. Legen Sie den Abfall (Haut, benutztes Taschentuch, Papier und Handschuhe) in einen klinischen Abfallbeutel.
    12. Reinigen/bürsten Sie das Bein mit Seife und sterilisieren Sie es erneut mit Ethanol, wenn die Haut entfernt wurde.
    13. Beschädigen Sie nicht den Bereich in der Nähe der Gelenkhöhle. Wenn die Kavität geöffnet oder durch Blutinfiltration beschädigt wird, ist sie nicht mehr steril und das Bein kann nicht mehr verwendet werden.
    14. Legen Sie das Bein in eine Al-Folie, die mit 70% Ethanol besprüht wurde.
    15. Legen Sie die Latexhandschuhe in der richtigen Größe über die Beinenden, um einen Blutaustritt aus dem proximalen Ende oder eine mögliche Kontamination durch den Huf zu verhindern.
    16. Entsorgen Sie die Abfälle in geeigneter Weise unter Beachtung der institutionellen Vorschriften.
  2. Explantatextraktion und -kultur
    HINWEIS: Die Explantate müssen aus dem inneren Teil der Fuge gewonnen werden (Abbildung 2, zwei erste Phasen). Um vergleichbare Bedingungen zu erhalten, müssen vier (oder sechs) Explantate aus derselben Zone gestanzt werden, um die vier (oder sechs) verschiedenen Behandlungen auf Proben anzuwenden, die nahezu die gleiche Form und die gleichen Eigenschaften aufweisen.
    1. Öffnen Sie die Laminar-Flow-Haube 25 min vor Gebrauch, reinigen Sie sie mit Alkohol 70%.
    2. Legen Sie das Nährmedium in ein Wasserbad, um es zu erwärmen.
    3. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 1,5 ml basischem Medium, nur DMEM-F12 (Waschmedium) in jeder Well vor.
    4. Bereiten Sie eine weitere Well-Platte mit 1,5 ml vollständigem Nährmedium vor. Bis zur Verwendung im Kulturbrutkasten bei 37 °C lagern
    5. Bereiten Sie das Material auf einem Gestell vor: eine Universaltube mit 70 % Ethanol und eine weitere Universaltube mit Waschmedium.
    6. Bereiten Sie ein Skalpell und einen 4- oder 6-mm-Biopsiestempel vor (in das Universalröhrchen für Alkohol gelegt).
    7. Legen Sie die Rohre und die Materialien unter die Haube.
    8. Legen Sie einen saugfähigen Schutz, der mit 70% Ethanol besprüht ist, unter die Motorhaube.
    9. Bereiten Sie einige Taschentücher vor, die mit 70% Ethanol besprüht sind.
    10. Nehmen Sie eine Sezierplatte und bedecken Sie sie mit Al-Folie.
    11. Nehmen Sie die gleichen, zuvor vorbereiteten Füße aus dem Kühlschrank (4 °C) und besprühen Sie sie mit 70 % Ethanol.
    12. Entsorgen Sie gefährliche und klinische Beutel in der Nähe der Haube, um den Abfall später zu autoklavieren.
    13. Sprühen Sie den Fuß mit 70% Ethanol ein.
    14. Bewegen Sie das Gelenk, um die Mittellinie des Gelenks zu finden, an der der Schnitt gemacht werden soll. Tun Sie dies unter der Motorhaube.
    15. Nehmen Sie das sterile Skalpell.
    16. Schneiden Sie vorsichtig entlang der Mittellinie und folgen Sie dabei der Kontur der Fugenkanten. Berühren Sie nicht den medialen Kondylenknorpel des Metacarpophalangealgelenks.
    17. Schneiden Sie das Band vorsichtig durch, wenn das Gelenk geöffnet wird.
    18. Werfen Sie den unteren Teil der Füße in einen Autoklavenbeutel.
    19. Entfernen Sie alle anderen Gewebe, um den gesamten Knorpel des Gelenks freizulegen (Abbildung 2).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nichts mit den Füßen zu berühren.
    20. Legen Sie das Skalpell und die Biopsie-Stanze in Alkohol und dann in das Waschmedium.
    21. Mache mit diesem Stempel einige Kreise (4-5 pro Fläche) mit etwas Kraft entlang der Innenflächen der Knochen.
    22. Geben Sie den Bio-Punsch in Alkohol, wenn er fertig ist, um ihn zu reinigen.
    23. Nehmen Sie ein Skalpell und schneiden Sie zwischen jedem Kreis und entlang der Mittellinie des Knochens (ziehen Sie eine Linie).
    24. Um das Knorpelexplantat zu entfernen, schneiden Sie vertikal an einem der Ränder der Kreisbiopsie und schneiden Sie dann horizontal sehr vorsichtig auf den subchondralen Knochen.
    25. Um das Knorpelexplantat zu entfernen, das horizontal unterhalb der Lochlinie entlang des subchondralen Knochens und des verkalkten Knorpels geschnitten wird, springen die Explantate heraus.
      HINWEIS: Explantate sollten, wenn möglich, eine gleichmäßige Dicke haben.
    26. Legen Sie das Explantat in die mit 1,5 ml Waschmedium gefüllte Wellplatte.
      HINWEIS: Führen Sie immer eine experimentelle Kontrolle und Behandlung von Explantaten durch, die von der gleichen Stelle in der Fuge stammen.
    27. Prüfen Sie, ob das Explantat richtig ausgerichtet ist. Die Oberfläche des Explantats sollte nach oben zeigen und der subchondrale Knochenteil des Explantats sollte zum Boden der Well-Platte zeigen.
    28. Halten Sie die Well-Platte zwischen jeder Biopsie geschlossen.
    29. Entfernen Sie das Waschmittel.
    30. Nochmals mit Waschmittel waschen. 2-3 h im Waschmittel lassen. Knochenreste, Blut haben Zeit, im Medium auszufließen.
    31. Übertragen Sie die Explantate in eine neue Well-Platte, die das vollständige Kulturmedium enthält. Achtung: Berühren Sie nichts mit der Pipette.
    32. Vergewissern Sie sich, dass sich die Explantate noch in der richtigen Position befinden (Knochen zum unteren Teil der Well-Platte).
    33. Reinigen Sie alles und entsorgen Sie den klinischen Abfall an einem geeigneten Ort.
    34. Sobald die Explantate in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 in Kultur gebracht wurden, wechseln Sie das Explantat-Kulturmedium alle zwei Tage mit warmem, frischem Medium, um es den unterschiedlichen Bedürfnissen der Zellen/Gewebe anzupassen. Vergewissern Sie sich, dass sich die Explantate noch in der richtigen Position befinden (Knochen zum unteren Teil der Well-Platte).
  3. Fixierung der Probe (optional)
    HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt erst am Ende der Zellkultur durch, d.h. nach 3 Wochen Kultur. Die Explantate haben dann das Reifestadium erreicht.
    1. Waschen Sie die Explantate mit DMEM-F12 mit einer Pipette unter der Gewebekulturhaube.
    2. Waschen Sie die Explantate zweimal mit PBS mit einer Pipette unter der Gewebekulturhaube.
    3. Fixieren Sie sie über Nacht bei 4 °C, indem Sie 10 % NBFS (Neutral Buffer Formalin Saline) einweichen.
    4. Legen Sie die fixierten Explantate in PBS in ein Mikrozentrifugenröhrchen
    5. Lagern Sie die Explantate bei 4 °C. Feste Explantate können unter diesen Bedingungen bis zu 6 Monate bleiben.

2. Probenvorbereitung für die Bildgebung

  1. Verwenden Sie konische Kunststoffspitzen in geeigneter Größe (in der Regel 1 ml-Spitze) in Bezug auf die Probe und das Sichtfeld der Kamera.
  2. Versiegeln Sie die Kegelspitze (indem Sie sie mit einer Flamme erhitzen), um einen wasserdichten Probenbehälter zu erhalten.
  3. Füllen Sie die Spitze mit PBS. Halten Sie die Probe mit einer Pinzette fest und führen Sie sie in das Röhrchen ein. Entfernen Sie die Luftblase durch langsames Schütteln.
  4. Montieren Sie den Schlauch auf dem Tomographietisch und richten Sie ihn durch einfache Röntgenaufnahmen aus.

3. Röntgen-Phasenkontrast-Bildgebung

  1. Platzieren Sie den Detektor in einem Abstand von 2,5 m von der Probe
  2. Stellen Sie die Röntgenphotonenenergie auf 17 keV ein, indem Sie ein doppeltes Siliziumkristallsystem innerhalb einer Bragg-Bragg-Geometrie verwenden.
  3. Der Mount Imaging Detektor bestand aus einer wissenschaftlichen CMOS-Kamera22 auf einer Optik mit einer resultierenden isotropen Voxelgröße von 3,5 μm im 3D-Bild.
  4. Verwenden Sie ein 60 μm dickes Gadoliniumoxysulfid-Szintillatorsieb, um die Röntgenstrahlung in sichtbares Licht umzuwandeln
  5. Datenerfassung: Erfassen Sie 2000 Projektionen während eines 360°-Scans der Probe mit einer Belichtungszeit von 2 s für jede Projektion.
  6. Verwenden Sie einen Phasen-Retrieval-Algorithmus, um das Phasensignal zu extrahieren, wie in Ref.23 beschrieben. Der Algorithmus nutzt ein a priori Wissen über die komplexe Brechungsindexverteilung innerhalb der Probe. Die Haupthypothese, die hier nicht überprüft wird, ist, dass es ein Material gibt, das rekonstruiert werden muss. In diesem speziellen Fall wurde das Verhältnis zwischen dem Brechungs- und dem Absorptionsindex auf 1.200 gesetzt, was experimentell beobachtet wurde, um den besten Kompromiss für die Knochen- und Knorpelvisualisierung zu erzielen.
  7. Verwenden Sie den standardmäßigen CT-Rekonstruktionsalgorithmus für gefilterte Rückprojektion unter Verwendung einer Open-Source-Implementierung des PyHST2-Codes(GPU), die auf der Graphics Processing Unit (GPU) basiert.

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Ergebnisse

Es wurde ein einfacher, auf Ausbreitung basierender Bildgebungsaufbau25 verwendet, wie in Abbildung 3 skizziert. Bei der auf Synchrotronausbreitung basierenden Bildgebung beleuchtet ein kohärenter Röntgenstrahl das Objekt, wodurch räumlich variierende Phasenverschiebungenentstehen 19. Wenn sich der Röntgenstrahl nach der Probe ausbreitet, erzeugt die verzerrte Wellenfront ein charakteristisches Muster. Durch die Analyse dieser charakteristische...

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Diskussion

Wir präsentierten eine komplette Studie von der Probenvorbereitung bis zur Bildvisualisierung, einschließlich der Datenerfassungsprotokolle, für die Untersuchung von in vitro schnell reifenden Gelenkknorpel. Die Ergebnisse einer Synchrotron-Bildgebung zeigten die Güte des Modells.

In dem hier vorgestellten Modell müssen einige Beobachtungen und Grenzen genannt werden. Diese "beschleunigte Reifung" erfolgt innerhalb von 21 Tagen nach der Kultur. Bei lä...

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Danksagungen

Die Autoren danken der ESRF für die Bereitstellung von interner Strahlzeit. Die Autoren danken Eric Ziegler für die wissenschaftlichen Diskussionen. Das beschriebene PCI-Experiment wurde an der Beamline BM05 der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble, Frankreich, durchgeführt. CB dankt Explora'doc Auvergne Rhône Alpes und Stipendien der University of Swansea und der Université Grenoble Alpes für die Finanzierung eines Teils dieser Studie.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Material : Biologische Produkte
DMEM/F-12 (1:1) (1X) + GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12 Nutriment Mixture (Ham) 500mLGibco von life technologies31331-028
Gentamicin Reagenzlösung, 50 mg/mLGibco von life technologies15750-060
HEPES, Spezialpräparat, 1M, pH 7,5 gefiltertSigmaH-3375
ITS, Insulin-Transferrin-SelenGibco von life technologies51500-057
L-Ascorbinsäure-2-Phosphat, Sesquimagnesium-Salf-Hydrat, 95%SigmaA8960-5G
Neutralpuffer Formalin (NBF)Sigma AldrichHT501128
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4Gibco von life technologies10010023
CultureAusrüstungen:
Absordent Protector, BenchkoteWhatmanTMCat Nr. 2300731,Polystyrol mit Rückseite, 460 cm * 50 m
Accurpette VWR
Autoklavierbarer EntsorgungsbeutelFür die Entsorgung von kontaminiertem Kunststoff sollte der Hals offen gelassen werden, um das Eindringen von Dampf zu ermöglichen, Sondermüll, STERILIN (weißer Beutel)
BiopsiestempelMILTEX von KAIref 33-364 & 6 mm Durchmesser
Klinische Abfälle für alternative Behandlungen Medium Duty(UN-zugelassenes Gewicht 5 kg, Un-Verschlussmethoden, UN-SH4/Y5/S/II/GB/4/06 (orangefarbener Beutel)
Eppendorf-Röhrchen0,5 mL und 1,5 mL
Falcon Röhrchen15 mL und 50 mL
frei von nachweisbarer RNase, DNase, DNA & Pyrogene 1000ul abgeschrägt, FilterspitzeStarlab, TipOne (steril)S1122-1830
frei von nachweisbarer RNase, DNase, DNA& Pyrogene 20µ l Abgeschrägt, FilterspitzeStarlab, TipOne (steril)S1120-1810
frei von nachweisbarer RNase, DNase, DNA& Pyrogens 200ul Abgeschrägt, FilterspitzeStarlab, TipOne (steril)S1110-1810
InkubatorInkubator bei 37°; C, befeuchtete Atmosphäre mit 5% CO2
Optisches Mikroskop
Pipette-Boy25mL-, 10mL- und 5mL sterile Kunststoff-Pipetten
Pipetten (25-10-5 ml)CellStar, Greiner Bio-one
KunststoffpinzetteOxford InstrumentAGT 5230
Skalpellspitzen
P1000, P200 und P10 mit P1000, P200 und P10 Spitzen (steril)
Gewebekulturhaube
Vakuumpumpe
Wasserbad 37°;
12- und 24-Well-Platten
Schutzausrüstung:
face shield
Handschuhe
Laborkittel
,
Datenerfassungsgeräte:
PyHST-Rekonstruktions-ToolkitOpen-Source-Software
C-Well-Platten, , , SchutzbrilleFidschi Software Open-Source-Software

Referenzen

  1. Little, C. B., Ghosh, P. Variation in proteoglycan metabolism by articular chondrocytes in different joint regions is determined by post-natal mechanical loading. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (1), 49-62 (1997).
  2. Khan, I. M., et al. Fibroblast growth factor 2 and transforming growth factor β1 induce precocious maturation of articular cartilage. Arthritis and Rheumatology. 63 (11), 3417-3427 (2011).
  3. Khan, I. M., et al. In vitro growth factor-induced bio engineering of mature articular cartilage. Biomaterials. 34 (5), 1478-1487 (2013).
  4. Ascorbate in Cell Culture. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/learning-center/media-expert/ascorbate.html (2020).
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