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Methodenartikel

Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis

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DOI:

10.3791/61609

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12. August 2020

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1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center at West Virginia University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Infektion von neonatalen Mäusen mit biolumineszierendem E. coli O1:K1:H7 führt zu einer septischen Infektion mit signifikanter Lungenentzündung und Lungenpathologie. Hier beschreiben wir Verfahren zur Modellierung und weiteren Untersuchung der neonatalen Sepsis unter Verwendung von längsinaler intravitaler Bildgebung parallel zur Aufzählung systemischer bakterieller Belastungen, entzündlicher Profilierung und Lungenhistopathologie.

Zusammenfassung

Neonate haben ein erhöhtes Risiko für bakterielle Sepsis aufgrund des einzigartigen Immunprofils, das sie in den ersten Lebensmonaten zeigen. Wir haben ein Protokoll zur Untersuchung der Pathogenese von E. coli O1:K1:H7, einem Serotyp, der für hohe Sterblichkeitsraten bei Neonaten verantwortlich ist, erstellt. Unsere Methode nutzt intravitale Bildgebung von neonatalen Welpen zu verschiedenen Zeitpunkten während des Fortschreitens der Infektion. Diese Bildgebung, parallel zur Messung von Bakterien im Blut, entzündliche Profilierung und Gewebehistopathologie, bedeutet einen strengen Ansatz zum Verständnis der Infektionsdynamik während der Sepsis. Im aktuellen Bericht modellieren wir zwei infektiöse Inokulaums zum Vergleich der bakteriellen Belastungen und der Schwere der Krankheit. Wir stellen fest, dass subscapulare Infektion führt zu einer disseminierten Infektion durch 10 h Post-Infektion. Bis 24 h war eine Infektion mit lumineszierendem E. coli im Blut, in der Lunge und anderen peripheren Geweben reichlich vorhanden. Die Expression von entzündlichen Zytokinen in der Lunge ist bei 24 h signifikant, gefolgt von einer zellulären Infiltration und Hinweisen auf Gewebeschäden, die mit der infektiösen Dosis zunehmen. Intravital-Bildgebung hat einige Einschränkungen. Dazu gehören eine leuchtende Signalschwelle und einige Komplikationen, die bei Neonaten während der Anästhesie auftreten können. Trotz einiger Einschränkungen stellen wir fest, dass unser Infektionsmodell einen Einblick bietet, um die Dynamik der Längsinfektion bei neonataler muriner Sepsis zu verstehen, die bis heute nicht gründlich untersucht wurde. Wir erwarten, dass dieses Modell auch angepasst werden kann, um andere kritische bakterielle Infektionen im frühen Leben zu untersuchen.

Einleitung

Bakterielle Sepsis ist ein wichtiges Anliegen für Neonate, die ein einzigartiges Immunprofil in den ersten Tagen des Lebens aufweisen, die keinen angemessenen Schutz vorInfektionenbieten 1 . Neonatale Sepsis ist nach wie vor ein erhebliches US-Gesundheitsproblem, das mehr als 75.000 Fälle pro Jahr allein in den USA ausmacht2. Um diese Infektionen eingehend zu untersuchen, sind neuartige Tiermodelle erforderlich, die Aspekte menschlicher Krankheiten rekapitulieren. Wir haben ein neonatales Mausinfektionsmodell mit Escherichia coli, O1:K1:H73. E. coli ist die zweithäufigste Ursache für neonatale Sepsis in den USA, ist aber für die Mehrheit der Sepsis-assoziierten Sterblichkeit4,5verantwortlich. Es ist jedoch die Hauptursache, wenn Vor- und sehr niedrige Geburtsgewicht (VLBW) Babys unabhängig betrachtet werden5. Der K1-Serotyp wird am häufigsten mit invasiven Blutkreislaufinfektionen und Meningitis bei Neonaten6,7in Verbindung gebracht. Derzeit gibt es keine anderen Behandlungsmöglichkeiten als Antibiotika und unterstützende Pflege. In der Zwischenzeit steigen die Antibiotikaresistenzraten für viele pathogene Bakterien weiter an, wobei einige Stämme von E. coli gegen eine Vielzahl von Antibiotika resistent sind, die häufig in der Behandlung verwendet werden8. Daher ist es unerlässlich, dass wir weiterhin Methoden generieren, um die Mechanismen der Sepsis und die Wirtsreaktion in Neonaten zu untersuchen. Diese Ergebnisse können dazu beitragen, aktuelle Behandlungen und Infektionsergebnisse zu verbessern.

Der Immunzustand von Neonaten ist sowohl durch phänotypische als auch funktionelle Unterschiede im Vergleich zu Erwachsenen gekennzeichnet. Zum Beispiel, erhöhte Konzentrationen von entzündungshemmenden und regulatorischen Zytokinen, wie Interleukin (IL)-10 und IL-27, haben gezeigt, dass durch Nabelschnurblut-abgeleitete Makrophagen produziert werden und sind in höheren Konzentrationen im Serum der murinen Neonate9,10,11. Dies stimmt mit niedrigeren IFN-α-, IFN-ɣ-, IL-12- und TNF-α überein, die häufig von neonatalen Zellen im Vergleich zu erwachsenen Pendants berichtet werden10. Darüber hinaus ist das neonatale Immunsystem in Richtung einer Th2 und regulatorischen T-Zell-Antwort im Vergleich zu Erwachsenen12verzerrt. Erhöhte Anzahl von Neutrophilen, T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Monozyten sind auch in Neonaten vorhanden, aber mit erheblichen funktionellen Beeinträchtigungen. Dazu gehören Defekte in der Expression von Zelloberflächenmarkern und Antigendarstellungen, die auf Unreife13,14,15hindeuten. Darüber hinaus sind neonatale Neutrophile signifikant mangelhaft in ihrer Fähigkeit, zu chemotaktischen Faktoren zu migrieren16. Myeloide-abgeleitete Suppressorzellen (MDSCs) sind auch auf erhöhten Niveaus in Neonaten gefunden und vor kurzem gezeigt, dass eine Quelle von IL-2711. MDSCs sind gegenüber T-Zellen17stark unterdrückend. Zusammen zeigen diese Daten Einschränkungen der neonatalen Immunität, die eine erhöhte Anfälligkeit für Infektionen verleihen.

Um das Fortschreiten der bakteriellen Belastung zu untersuchen und schützende Wirtsimmunreaktionen während einer neonatalen Sepsis zu sezieren, haben wir ein neuartiges Infektionsmodell entwickelt. Neonatale Mäuse an den Tagen 3-4 des Lebens sind schwierig, in den intraperitonealen Raum oder Schwanz Vene zu injizieren. In unserem Modell werden Tag 3 oder 4 Welpen das bakterielle inokulum oder PBS subkutan in den Skapulierbereich verabreicht. Eine systemische Infektion entwickelt sich und mit lumineszierenden E. coli O1:K1:H7 können wir einzelne neonatale Mäuse längs abbilden, um der verbreiteten bakteriellen Belastung in peripheren Geweben zu folgen. Dies ist das erste gemeldete Modell, um intravitale Bildgebung zu nutzen, um die Kinetik der Verbreitung von Bakterien während der Sepsis in murinen Neonaten zu verstehen3.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Induzieren septischer E. coli-Infektionen bei neonatalen Mäusen3. Wir beschreiben, wie man das bakterielle Inokulum für die Injektion vorbereitet und wie man Gewebe für die Beurteilung der Pathologie, die Messung von Entzündungsmarkern durch Genexpressionsanalyse und die Aufzählung der bakteriellen Belastung erntet. Darüber hinaus wird die Verwendung von lumineszierendem E. coli für die intravitale Bildgebung infizierter Neugeborenen und die Quantifizierung der bakteriellen Tötung durch neonatale Immunzellen beschrieben. Diese Protokolle können auch angepasst werden, um andere wichtige bakterielle Infektionen bei Neonaten zu untersuchen. Die hier vorgestellten Daten stellen einen neuartigen Gesamtansatz zum Verständnis der Infektionsdynamik in einem übersetzbaren neonatalen Sepsismodell dar.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden von den West Virginia Institutional Animal Care and Use Committees genehmigt und in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durch den National Research Council18durchgeführt.

1. Herstellung von bakteriellem Inokulum

  1. Streifen Sie eine Tryptic Soja-Agar -Platte (TSA) mit einer Impfschlaufe zur Isolierung einer einzelnen Kolonie aus einem Gefrierbestand von E. coli O1:K1:H7-lux, die stabil luziferase ausdrückt und Kanamycin-Widerstandträgt 3. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
  2. Am nächsten Tag kann die Luria-Brühe (LB) in einem Biosicherheitsschrank auf Raumtemperatur (25 °C) kommen.
  3. Identifizieren Sie unter einer Biosicherheits-Schrankhaube eine einzelne Kolonie aus der gestreiften Platte und impfen Sie sie in 3 ml LB, ergänzt mit Kanamycin (30 g/ml). Über Nacht bei 37 °C mit Schütteln (220 Rpm) inkubieren. Das ist die Starterkultur.
  4. Die Starterkultur 1:100 in eine frische 3 ml LB unter einer Biosicherheits-Schrankhaube verdünnen und bei 37 °C mit Schütteln (220 U/min) für 2-3 h in den Inkubator zurückgeben. Das ist die Aktienkultur.
  5. Lesen Sie die optische Dichte (OD) sowohl der Rohlings- als auch der Bestandskultur bei 600 nm mit einem Spektralphotometer. Fügen Sie 100 l LB (ohne Bakterien) in einen Brunnen einer 96 gut flachen Boden-Assay-Platte; Dies ist das Leerzeichen. Dann fügen Sie 100 l aus der Bestandskultur zu einem separaten Brunnen hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang für zwei weitere Replikationen. Die Absorption wird mit einem Plattenleser abgelesen.
  6. Subtrahieren Sie die Leerabsorption vom Absorptionswert der Bestandskultur (dem OD-Wert) und vergleichen Sie mit einer zuvor generierten und validierten Wachstumskurve, um eine Annäherung der Bakteriendichte in der Bestandskultur zur Herstellung einer infektiösen Dosis zu bestimmen.
  7. Generieren Sie Zielinokulume in Abhängigkeit von der Forschungsfrage. Für diese Studie wurden Zielinokulum von 2 x 106 (niedrig) und 7 x 106 (hohe) koloniebildende Einheiten (KBE) pro Maus (/Maus) verwendet.
    1. Dividieren Sie die Zieldosis pro Maus (DoseT) durch die geschätzte Konzentration von Bakterien in der Bestandskultur (Bestand), um das Volumen der Bakterien aus dem Stockrohr (VS) zu erhalten.
    2. Multiplizieren Sie VS mit der Anzahl der Mäuse (NM), die infiziert werden müssen, zusammen mit genug für 5-10 Extras für die Gesamtmenge der Bakterien, die für die Infektion benötigt werden, plus 5-10 zusätzliche Dosen. Entfernen Sie dieses Volumen aus dem Lagerrohr und fügen Sie es einem neuen Zentrifugenrohr hinzu.
    3. Verwenden Sie die folgende Gleichung:
      DosisT/Stock = VS x NM = Gesamtvolumen (VT) von Bakterien, die aus dem Stockrohr entfernt werden sollen.
  1. Zentrifugieren Sie die Bakterien bei 2.000 x g für 5 min bei 4 °C und setzen Sie das bakterielle Pellet in 50 l PBS (pH 7,2-7,6) pro zu befallender Maus wieder auf (z. B. für 10 Dosen von 2 x 106 Bakterien pro Dosis würde das Pellet von 2 x 107 Bakterien in 500 l PBS resuspendiert werden). Auch hier wird empfohlen, mehr Inokulum als erforderlich vorzubereiten. Bereiten Sie ein gleiches PBS-Volumen nur für Steuerelementimpfungen vor. Halten Sie die infektiöse Inokulum- und PBS-Kontrolle auf Eis bis zur Infektion aufrecht.
  2. Führen Sie sieben zehnfache serielle Verdünnungen in PBS in einer 96 gut Kunststoffbodenverdünnungsplatte und Platte 25 l der Verdünnungen in doppelter Aufweise auf Quadranten-TSA-Platten, ergänzt mit Kanamycin (30 g/ml), um die tatsächliche Menge der verabreichten Bakterien aufzuzählen. Bei 37 °C über Nacht für die Koloniebildung vor der Aufzählung inkubieren.

2. Tieridentifikation

  1. Ordnen Sie eine ausreichende Anzahl von Brutpaaren so an, dass Würfe für altersgerechte Welpen synchronisiert werden können. Altersvariabilität von ± 1 Tag ist akzeptabel.
  2. Identifizieren Sie eine schwangere C57BL/6 weibliche Maus und überwachen Sie die Geburt des Wurfs vor dem geplanten Experiment, um das Alter genau zu bestimmen.
  3. Um zwischen Kontrolliert und infizierten 3- oder 4-Tage-Welpen zu unterscheiden, verwenden Sie ein Paar kleine, feingekippte Irisschere, um die Enden der Schwänze der Kontrollwelpen nur zu schnippen. Die infizierten Welpen erhalten keine Schwanzschnipsen. Vor dem Schneiden des Schwanzes, desinfizieren Sie die Haut mit einer Baumwollkugel in 70% Ethanol doused. Wenden Sie druck auf das Ende des Schwanzes mit einer Wattekugel oder Gaze nach Bedarf.
    HINWEIS: Dieses Verfahren wird unter einer Biosicherheits-Schrankhaube durchgeführt. Ein Schwanzschnipsel von ca. 1/8 Zoll genügt.
  4. Um Welpen innerhalb der Kontroll- und infizierten Gruppen zu identifizieren, verwenden Sie eine 1 ml Insulinspritze mit einer 28 G x 1/2'' permanenten Nadel, um die Schwänze der Welpen zu tätowieren. Vor dem Tätowieren die Haut mit einer Indizierten Baumwollkugel mit 70% Ethanol desinfizieren. Dieses Verfahren wird unter einer Biosicherheits-Schrankhaube durchgeführt.
  5. Um den Schwanz zu tätowieren, tragen Sie Tier-Tattoo-Tinte auf die Spitze der Nadel auf. Als nächstes, vorsichtig halten Sie den Welpen mit einer Hand, mit ihrem Schwanz vollständig ausgesetzt. Setzen Sie die Nadel vorsichtig unter die Haut, wobei sie eine oberflächliche Tiefe beibehält, und bewegen Sie die Nadel parallel zur Haut ein paar Millimeter, bis eine kleine Markierung oder ein Punkt erstellt wurde. Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel langsam unter der Haut entfernen, um zu vermeiden, dass überschüssige Tinte unter der Haut freigesetzt wird.
  6. Drücken Sie bei Bedarf mit einer Watteoder Gaze auf die Wunde. Entfernen Sie überschüssige Tätowierfarbe auf der Hautoberfläche mit 70% Ethanol.
  7. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit nachfolgenden Mäusen in den infizierten und Kontrollgruppen, während Sie einen zusätzlichen Punkt mit jedem aufeinanderfolgenden Welpen tätowiert hinzufügen (z.B. hat Der Pup 1 1 Punkt auf dem Schwanz, Der Pup 2 hat zwei Punkte auf dem Schwanz usw.).
    HINWEIS: Für eine zusätzliche Identifikationsschicht wird empfohlen, separate Farben der Tier-Tattoo-Tinte für die Kontrolle und infizierte Gruppen zu verwenden.

3. Subkapitulare Impfung

HINWEIS: Für diese Studie wurden 2 Experimente mit einer für jedes Experiment bestimmten Niedrig- und Hochdosisgruppe durchgeführt. Im ersten Experiment erhielten 7 Welpen das niedrig dosierte Inokulum (4 Welpen wurden als Kontrollen verwendet), und 5 Welpen aus einem separaten Wurf erhielten die hohe Dosis (3 Welpen wurden als Kontrollen verwendet). Die Welpen aus Experiment 1 lieferten Daten nur für den 24-Stunden-Zeitpunkt. Im zweiten Experiment erhielten 8 Welpen das niedrig dosierte Inokulum (2 Welpen wurden als Kontrollen verwendet), und 6 Welpen erhielten das hochdosierte Inokulum (2 Welpen wurden als Kontrollen verwendet). Welpen aus Experiment 2 lieferten Daten für die 0-, 10- und 24-Stunden-Zeitpunkte.

  1. Alter Match Welpen ≤ 1 Tag. Weisen Sie jeden Wurf entweder als niedrige Dosis oder als hochdosierten Wurf zu. Innerhalb eines Wurfs nach dem Zufalls zuordnen Welpen als Kontrolle oder infizierten Welpen.
  2. Am Tag 3 oder 4 postnatal, Rekordgewichte aller Welpen vor der Impfung mit E. coli-lux oder der PBS-Kontrolle. Trennen Sie den Damm von den Welpen während dieser Zeit, um sicherzustellen, dass sie während der Infektion nicht bewegt werden.
  3. In einem Biosicherheitsschrank mit einer Insulinnadel entweder PBS oder das E. coli-lux Inoculum aspirieren. Für diese Arbeit wurden Inokulume von 2 x 106 und 7 x 106 KBE pro Maus verwendet. Halten Sie sowohl infektiöse inoculum und PBS auf Eis bis zur Verabreichung über subscapulare Injektion.
  4. Legen Sie das Neugeborene auf eine saubere Oberfläche in der Biosicherheits-Schrankhaube und heben Sie die Haut am Nacken, als ob sie den Welpen zerschwirre.
  5. In dem Raum, der jetzt zwischen der Haut und dem Muskel des Tieres geschaffen wird, legen Sie die Nadel ein, verschrägen Sie sich direkt unter der Haut und injizieren Sie 50 l PBS oder E. coli-lux. Geben Sie gleichzeitig den eingeklemmten Teil der Haut frei, um einen Injektionsrückfluss zu verhindern.
  6. Entfernen Sie die Nadel langsam und mit Sorgfalt. Legen Sie Welpen zurück mit Dämmen, nachdem die Injektionen abgeschlossen sind.
    HINWEIS: Aufgrund ihres anatomischen Entwicklungsstadiums ist es technisch schwierig, an Tag 3-4 eine Schwanzvene oder intraperitoneale Injektion an neonatale Welpen zu verabreichen. So wurde der subscapuläre Infektionsweg für diese Studie aufgrund der einfachen Ausführung gewählt.

4. Bewertung von Krankheits- und Endpunktkriterien

  1. Überwachen Sie die Welpen zweimal täglich während der Dauer der Infektion. Beachten Sie alle Anomalien im Aussehen.
  2. Erfassen Sie Gewichte als objektive Messung der Morbidität.
  3. Zusätzlich zu Gewichtsänderungen, testen Sie die Fähigkeit der Welpen, sich selbst zu recht, indem Sie das Neugeborene auf der dorsalen Seite positionieren. Kranke Tiere können sich nicht auf die ventrale Seite und auf die Füße umdrehen oder diese Aktion mit Mühe abschließen.
  4. Überprüfen Sie, ob die Tiere den Endpunktkriterien nahe sind: weniger als 85 % des normalen Körpergewichts; verminderte Bewegung und Unfähigkeit, sich selbst zu rechtzumachen; Verfärbung der Haut und ein graueres oder transparenteres Aussehen im Gegensatz zu rosa; sich kühl anfühlend, was auf eine verminderte Körpertemperatur und hämorrhagische Blutergüsse an den Seiten hindeutet, was ebenfalls auf eine Vorerkrankung hindeutet.
    HINWEIS: Wenn die Neonate über zwei Tage nicht an Gewicht zugenommen haben und eine der Beschreibungen in Schritt 4.4 passen, haben sie die Endpunktkriterien erfüllt. Welpen, die die hohe Dosis erhalten, erfüllen oft Endpunktkriterien von 24 h. Kontrollwelpen innerhalb der niedrig- und hochdosierten Würfe werden gleichzeitig eingeschläfert, um eine vergleichende Analyse zwischen der Kontroll- und der Versuchsgruppe zu ermöglichen. Fahren Sie mit dem Abschnitt Euthanasie weiter unten fort.

5. In-vivo-Bildgebung der bakteriellen Belastung

  1. Verwenden Sie einen MicroCT-Imager und eine Software für die Bildgebung und anschließende Analyse.
    HINWEIS: Die Farbe der Haut von Pup hat keinen Einfluss auf die Bildqualität.
  2. Legen Sie den Käfig mit E. coli-lux-infiziertenNeonatalen Mäusen und Mutterin in eine BSL-2-Level laminare Flow Haube. Entfernen Sie die zu bebilderten Mäuse und legen Sie sie in eine transparente Isoflurankammer innerhalb der Kapuze. Es wird empfohlen, mit nicht infizierten Kontrollen zu beginnen, um die Menge an Isofluran zu messen, die benötigt wird.
  3. Öffnen Sie die Software auf dem Computer, der an das microCT angeschlossen ist. Initialisieren Sie das System und warten Sie, bis die CCD-Temperatur bei -90 °C gesperrt ist.
  4. Drehen Sie den Isofluran-Verdampfer ein und stellen Sie das Zifferblatt auf 5% Isofluran-Fluss ein. Halten Sie Mäuse in der Kammer mit dieser Isofluran-Mischung für 20-30 s, bis sie aufhören, sich zu bewegen; für einige Mäuse können längere oder kürzere Anästhesie-Expositionszeiten erforderlich sein. Sobald sich Mäuse nicht mehr bewegen, sind sie ausreichend beästhetisiert und können abgebildet werden.
  5. Bewegen Sie Mäuse in die mikroCT-Bildgebungskammer und legen Sie sie in der anfälligen Position auf die Bildbox, wobei die Nasen senkrecht zu Denasten ausgerichtet sind. Verwenden Sie Zahnwachs, um die Füße auf der Bildbox sanft zurückzuhalten, um jede Bewegung zu begrenzen. Es können bis zu 4 neonatale Mäuse gleichzeitig abgebildet werden.
  6. Drehen Sie den Isofluran-Verdampfer auf 2-4% Durchfluss, um Mäuse während der Bildgebung anästhesiert zu halten. Schließen Sie die MikroCT-Bildkammertür. Überprüfen Sie die Mäuse ein paar Sekunden später. Wenn sie anfangen sich zu bewegen, douse eine Baumwollkugel in Isoflurane und halten Sie es an die Nase des Tieres bewegen für 5 Sekunden zu beästhesieren. Halten Sie die Baumwollkugel während der Bildgebung in der Nähe der Tiere. Achten Sie darauf, die Mäuse nicht zu beästhesieren und zu beenden.
  7. Wählen Sie mit der Software die Luminescent-Option für die Bildgebung aus. Verwenden Sie einen Anregungsfilter, der auf Block und der Emissionsfilter auf Öffnen,500 nm, 520 nm, 560 nm, 580 nm, 600 nm und 620 nm eingestellt ist. Für die Lumineszenz werden insgesamt sieben Emissionsfilter eingesetzt.
  8. Stellen Sie die Mäuse zu jedem Zeitpunkt (0, 10 und 24 h nach der Infektion [hpi]) auf und speichern Sie alle Bilder in einem Ordner für jeden Zeitpunkt. Bringen Sie die Welpen mit dem Damm in den Käfig zurück und überprüfen Sie, ob sich alle Welpen von der Anästhesie erholt haben.
  9. Um 2D-Bilder zu analysieren, öffnen Sie Bilder in der Software. Einheiten in Radiance (Photonen)ändern; dies wird in den Total Flux (Photonen/Sekunde)umschlagen.
  10. Analysieren Sie nur einen Bildsatz mit seinen mehreren Emissionsfiltern gleichzeitig. Beachten Sie in jedem Bildsatz die minimalen und maximalen Strahlungswerte in der unteren rechten Ecke jedes Bildes (z. B. wenn es 7 Emissionsfilter gibt, gibt es 7 Bilder und 7 Minimale und Maximale Werte). Wiederholen Sie dies für jeden Zufall, der verglichen werden soll.
  11. Um einen Maßstab zu bestimmen, der die Werte und Lumineszenz für alle Bilder umfasst, suchen Sie den niedrigsten Minimalwert und den höchsten Maximalwert für jeden Bildsatz. Für diese Studie wurden die Open-Filter-Bilder als repräsentativ verwendet.
    1. Markieren und öffnen Sie das Bild ihrer Wahl, um die Skalierung zu ändern. Klicken Sie in der Werkzeugpaletteauf die Registerkarte Bildanpassung, und ändern Sie die Farbskala auf die niedrigsten minimalen und höchsten maximal identifizierten Werte. Speichern Sie jedes Bildalsset als TIFF. Analysieren Sie jeden Zeitpunkt auf diese Weise individuell, um sicherzustellen, dass die richtige Skala angezeigt wird.
  12. Um den Gesamtfluss (Menge des Leuchtsignals pro Maus) für jede einzelne Maus zu quantifizieren, öffnen Sie ein Bild, wie zuvor in Schritt 5.9-5.10 beschrieben. Öffnen Sie die Registerkarte ROI-Werkzeuge in der Werkzeugpalette, und wählen Sie das Kreiswerkzeug aus. Wählen Sie 1 Kreis, wenn Sie einen Bereich der Lumineszenz analysieren.
  13. Verschieben Sie den ROI nach Overlay auf dem Bereich der Lumineszenz. Passen Sie bei Bedarf die Größe des ROI an.
    HINWEIS: Wenn eine Anpassung erforderlich ist, passen Sie ROIs in anderen Bildern vergleichbar an, um die Konsistenz aufrechtzuerhalten. Wählen Sie Measure ROIs. Das Fenster ROI-Messungen öffnet sich mit Gesamtstrom (p/s), Durchschnittliche Strahlung (p/s/cm2/sr), Standardabweichung der Strahlung, Minimale Strahlung und maximale Strahlung.
  14. Zeichnen Sie die Gesamtflussmessungen für jeden Bildsatz auf. Diese Zahl ist die quantifizierte Lumineszenzmenge in der Maus in 2D-Bildern.
  15. Um 3D-rekonstruierte microCT-Bilder zu erstellen, öffnen Sie das DLIT 3D-Rekonstruktionspanel auf der Werkzeugpalette und überprüfen Sie alle Wellenlängen, die unter der Registerkarte Analysieren enthalten sein sollen. Wählen Sie Reconstructaus.

6. Euthanasie

  1. Rohrrohre für Gewebe/Organe von Interesse für Nekropsie und geeignete nachgelagerte Anwendungen vorbereiten und beschriften.
  2. Trennen Sie die Neonate vom Damm in einem Biosicherheitsschrank.
  3. Eine Baumwollkugel in tierärztlicher Isoflurane einweichen und in eine transparente Rückhaltekammer legen.
  4. Bei der Blutentnahme bereiten Sie eine P200-Mikropipette mit einer Spitze vor und haben ein 1,5 ml-Rohr mit 10 l von 5 ml EDTA als Antikoagulans. Es wird ein Volumen von 50-200 l Blut erwartet.
  5. Legen Sie ein Neugeborenes in die Kammer und überwachen Sie den Welpen, bis er regungslos wird.
  6. Entfernen Sie schnell Neugeborenes und enthaupten Sie mit einer Schere. Wenn es erlaubt ist, über einen längeren Zeitraum frische Luft zu atmen, kann der Welpen das Bewusstsein wiedererlangen. Neonate haben die Lungenkapazität im Vergleich zu erwachsenen Mäusen reduziert und atmen daher nicht tief genug für die Euthanasie durch Isofluran allein.
  7. Sammeln Sie Blut aus dem Rumpf an der Basis des Kopfes mit einer P200 Mikropipette. Um die Menge des gesammelten Blutes zu maximieren, führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich nach der Enthauptung durch. Aufzählbakterien im Blut durch serielle Verdünnung und Standardplattenzählung, wie in Schritt 1.9 beschrieben.
  8. Sterilisieren Sie das gesamte Neugeborene mit 70% Ethanol vor der Exzision von Gewebeproben.

7. Gewebeernte

  1. Verwenden Sie das Neugeborene in einem Biosicherheitsschrank mit 70 % Ethanol, um eine Kontamination zu verhindern. Legen Sie das Tier auf die rechte Seite.
  2. Mit Zangen, greifen Sie die Haut an einem Punkt zwischen dem Bauch und hinteren linken Bein und machen einen Schnitt mit feinspitzen chirurgischen Schere. Schneiden Sie die Haut weiter und bewegen Sie sich nach oben nach hinten. Fortschritt, bis die gesamte Milz freigelegt wird.
  3. Verwenden Sie die Zange, um die Milz zu greifen und entfernen Sie sie aus dem Bauch, mit einer Schere, um das Bindegewebe zu trennen. Legen Sie die Milz in die Lösung, die für die nachgelagerte Anwendung geeignet ist.
  4. Um die Lunge zu erhalten, schälen Sie die Haut der Brust vollständig zurück.
  5. Betreten an der Basis des Brustbeins mit schere vertikal gehalten, nach oben geschnitten, bis der Rippenkäfig geteilt wird.
  6. Verwenden Sie Zangen, um die rechte und linke Lunge einzeln zu erfassen und aus der Brusthöhle zu entfernen. Entfernen Sie das Herz aus dem Lungengewebe, indem Sie mit einer Schere schneiden.
  7. Legen Sie die Lunge in die Lösung, die für ihre nachgelagerte Anwendung geeignet ist. Für die RNA-Isolierung verwenden Sie 500 l Guanidinthiocyanat/Phenol (GTCP). Für die Histopathologie 5 ml von 10% neutral gepuffertem Formalin verwenden.

8. RNA-Isolierung aus Lungengewebe zur Genexpression

  1. Die Mikrozentrifuge auf 4 °C vorkühlen.
  2. Das Lungengewebe in GTCP mit einer Schere zerkleinern. Als nächstes homogenisieren Sie das Gewebe mit einem batteriebetriebenen Homogenisator. Fahren Sie fort, bis die Lösung so einheitlich wie möglich ist. Bei Raumtemperatur für 3-5 min inkubieren.
  3. Fügen Sie mit gefilterten Pipettenspitzen 100 l Chloroform hinzu. Invertieren Sie das Rohr für 15 s und inkubieren 3-5 min bei Raumtemperatur.
  4. Zentrifuge für 15 min bei 12.000 x g.
  5. Während der Drehung 1,5 ml-Rohre mit 500 l 70% Ethanol zubereiten. Montieren und beschriften Sie die Säulen und Sammelrohre aus dem RNA-Isolationskit.
  6. Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Schicht, ohne die Interphasenschicht zu stören, die sich während der Zentrifugation gebildet hat. Legen Sie die wässrige Schicht in die Rohre, die 70% Ethanol enthalten.
  7. Das Ethanol- und Lysatgemisch in die Säule im Sammelrohr verschieben.
  8. Von diesem Zeitpunkt an folgen Sie dem kommerziellen Produktprotokoll des RNA-Isolationskits bis zur endgültigen Elution der RNA.
  9. Analysieren Sie die RNA auf Reinheit und Quantität. Sofort verwenden oder bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung lagern.

9. cDNA-Synthese

  1. PCR-Rohre beschriften und beiseite stellen.
  2. Fügen Sie dem cDNA-Reaktionsgemisch für jede Probe 1 g RNA hinzu.
  3. Fügen Sie die Reagenzien und die Vorlage in die PCR-Röhre, wie im cDNA-Protokoll beschrieben. Fügen Sie das Enzym zuletzt in die Mischung ein.
  4. PCR-Röhren in einen Thermocycler mit folgenden Laufeinstellungen legen: 5 min bei 25 °C, 40 min bei 42 °C, 15 min bei 85 °C und 4 °C Endraum.
  5. PCR-Rohre vom Thermocycler entfernen und sofort verwenden oder bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung aufbewahren.

10. Echtzeit-quantitativer PCR-Zyklus (qPCR)

  1. Bereiten Sie einen Reaktionsmix-Cocktail für jedes der zu analysierenden Gene vor. Jede 15-L-PCR-Reaktion erfordert 7,5 l 2x Reagenzienmischung, 0,75 l 20X 5'-FAM-markierte genspezifische Primer/Sonde und 3,75 l nukleasefreies Wasser. Amplicons reichen in der Regel von 60-120 bp.
  2. Fügen Sie den entsprechenden Brunnen 3 L cDNA-Vorlage für jede Versuchsgruppe hinzu.
  3. 12 L des genspezifischen Reaktionsmixcocktails in die entsprechenden Brunnen geben.
  4. Bedecken Sie die Platte mit optischem Klebefilm und Zentrifuge für 1 min bei 1.000 x g, um blasen zu entfernen, die sich in den Brunnen gebildet haben könnten.
  5. Legen Sie die PCR-Platte in einen Echtzeit-PCR-Thermocycler.
  6. Stellen Sie die Laufmethode wie folgt ein: 3 min bei 95 °C, 40 Zyklen von 95 °C für 15 s, gefolgt von 60 °C für 1 min.
  7. Analysieren Sie Daten, indem Sie das Gen von Interesse für eine interne Kontrolle normalisieren und Daten aus infizierten Proben relativ zu nicht infizierten Kontrollproben mit der2-Ct-Formel und einerLog-2-Transformation der Zahlen ausdrücken.

11. Lungenhistopathologie

  1. Entfernen Sie die Lunge aus dem neugeborenen Welpen wie oben beschrieben.
  2. Legen Sie das Gewebe in ein Volumen von 10% neutral gepuffertem Formalin, so dass das Verhältnis von Lösung zu Gewebe etwa 20:1 für 3-7 Tage beträgt.
  3. Koordinieren Sie sich mit einem geeigneten Histologie-Service für Paraffineinbettung, Schnitt- und Hämatoxylin- und Eosin- (H&E)-Färbung. Für diese Arbeit wurde der West Virginia University Histopathology Core verwendet. Alternativ können Sie zuvor beschriebene Protokolle19befolgen.

12. In-vitro-Bakterien-Tötungstest

  1. Entfernen Sie die Milz aus dem nicht infizierten neonatalen Welpen, wie oben beschrieben, und legen Sie sie in einen 40-mm-Nylonkorb in eine sterile 60 mm Petrischale. Wiederholen Sie dies und Pool Milz in einem Rohr geerntet und homogenisiert zusammen.
  2. Fügen Sie 5 ml PBS hinzu, ergänzt durch 10% FBS.
  3. Disaggregieren Sie das Gewebe mit einem sterilen 3 ml Spritzenkolben, bis eine einzellige Suspension entsteht.
  4. Sammeln Sie die einzellige Suspension außerhalb des Nylonkorbes, übertragen Sie sie in ein 15 ml Zentrifugenrohr und Pelletzellen bei 350 x g für 5 min.
  5. Setzen Sie die Zellen im Lysepuffer der roten Blutkörperchen (2 ml für bis zu 7-8 Milz) aus und lassen Sie sie 5 min bei Raumtemperatur stehen, um Erythrozyten zu beseitigen.
  6. Splenozyten wie oben mit PBS und Pellet waschen.
  7. Setzen Sie die Splenozyten in 0,25 ml PBS aus, ergänzt durch 0,5% BSA und 2 mM EDTA entsprechend der erwarteten Zellausbeute.
  8. Zählen Sie die Splenozyten mit einem Hämozytometer oder einer anderen geeigneten Anwendung.
  9. Isolat Ly6B.2+ (myeloische Population von Granulozyten/entzündlichen Monozyten) Zellen mit immunmagnetischen Perlen nach Herstellerprotokoll.
  10. Seed Ly6B.2+ Zellen mit einer Dichte von 1 x 105 Zellen pro Brunnen in einer schwarzen oder weißen 96-Well-Platte in einem Volumen von 0,1 ml DMEM, das 10% FBS, 2 mM Glutamin und 25 mM HEPES (komplettes Medium) enthält.
  11. Aufzähle biolumineszierende E. coli wie in Abschnitt 1 beschrieben und bereite das bakterielle Inokulum bei der gewünschten Infektionsvielfalt (MOI) in einem Endvolumen von 0,1 ml vor. Dies geschieht am besten, indem man das Notwendige für alle Brunnen an einem gemeinsamen MOI in Chargen macht.
  12. Fügen Sie 0,1 ml bakterielles Inokulum oder komplettes Medium allein als Kontrolle hinzu. Inkubieren Sie die Multi-Well-Platte bei 37 °C und 5%CO2 für 1 h.
  13. Ersetzen Sie das Medium durch 0,2 ml frisches Komplettmedium, das Gentamicin (100 g/ml) enthält, indem Sie die Medien vorsichtig mit einer Pipette entfernen und frische Medien mit einer neuen Pipettenspitze hinzufügen. Bringen Sie die Kultur für weitere 2 h in die Inkubation zurück.
  14. Bei 3 h nach der Infektion, messen Sie die Lumineszenz in jedem Brunnen der Deckelkulturplatte von unten mit einem Plattenleser und dann die Kultur in die Inkubation zurück.
  15. Wiederholen Sie die Messung der Lumineszenz an anderen gewünschten Zeitpunkten.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll induzierte bakterielle Sepsis bei neonatalen Mäusen, und wir verwendeten Längsinalintravital-Bildgebung, Aufzählung von Bakterien im Blut, histologische Bewertungen der Pathologie und entzündliche Zytokin-Expressionsprofile, um den Krankheitsverlauf zu untersuchen. Anzeichen einer Morbidität wurden bei neonatalen Welpen beobachtet, die sowohl mit niedrigen (2 x 106 KBE) als auch mit hohen E.coli-Inokulumen (ca. 7 x 106 KBE) infiziert waren. Welpen, die das größere Inokulum...

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Diskussion

Unser subskapulares Infektionsmodell zur Induktion von bakteriellen Sepsis bei neonatalen Mäusen ist eine neuartige Methode, um die Längsausbreitung bakterieller Krankheitserreger in Echtzeit zu untersuchen. Intravital-Bildgebung bietet die Möglichkeit, die bakterielle Verbreitung in Echtzeit in Neonaten zu erforschen. Dies ist entscheidend, um die Kinetik der bakteriellen Verbreitung zu verstehen und die Reaktion und den Schaden des Wirts in der entsprechenden Krankheitsphase weiter zu untersuchen. Mauswelpen wird eine ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch institutionelle Mittel an C.M.R. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 ml InsulinspritzeCoviden1188128012Inokulum oder PBS
Injektion 10% neutrales gepuffertes FormalinVWR89370-094Histopathologie
ACK Lysis BufferGibcoLSA1049201Bakterieller Clearance-Assay
Tier-Tattoo-Tinte PasteKetchumKI1482039Tierkennzeichnung
Tier-Tattoo-Tinte Grüne PasteKetchumKI1471039Tierkennzeichnung
Anti-Ly-6B.2 MikrokügelchenMiltenyi Biotec130-100-781Zellisolierung
Escherichia coli O1:K1:H7ATCC11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (exprimiert Luciferase)N/AN/AEigens bei WVU konstruiert
E.Z.N.A. HP Total Extraction RNA KitOmega Bio-tekR6812RNA-Extraktion
DPBS, 1XCorning21-031-CV
Difco Tryptic Soja AgarBecton, Dickinson and Company236950Bakterielles Wachstum
IL-1 beta Primer/Sonde (Mm00434228)Thermo FisherScientific 4331182Zytokinexpression qPCR
IL-6 Primer/Sonde (Mm00446190)Thermo Fisher Scientific4331182Zytokinexpression qPCR
iQ SupermixBio-Rad1708860quantitative Echtzeit-PCR
iScript cDNA-SynthesekitBio-Rad1708891cDNA-Synthese
IsolationspufferMiltenyi BiotecN/ABakterieller Clearance-Assay
IVIS Spectrum CT und Living Image 4.5 SoftwarePerkin ElmerN/AIntravitale Bildgebung
LB Brühe, LennoxFisher BioReagentsBP1427-500Bakterienwachstum
EASYstrainer (Nylon Basket)Greiner Bio-one542 040Zellsieb
SpectraMax iD3Molecular DevicesN/APlattenleser
Pellet Stößel MotorGrainger6HAZ6Gewebehomogenisierung
Polypropylen Pellet StößelGrainger6HAY5Gewebehomogenisierung
Prime Thermal CyclerTechne3PRIMEBASE/02cDNA-Synthese
TNF-alpha Primer/Sonde (Mm00443258)Thermo Fisher Scientific4331182Zytokinexpression qPCR
TriReagenz (GTCP)Molekulares ForschungszentrumTR 118RNA-Extraktion

Referenzen

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