Methodenartikel

Murine Excisional Wound Healing Model und histologische morphometrische Wundanalyse

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DOI:

10.3791/61616

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21. August 2020

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt, wie bilaterale, volldicke Exzisionswunden bei Mäusen erzeugt werden und wie man anschließend die Wunden für die morphometrische Analyse überwacht, erntet und vorbereitet. Enthalten ist eine ausführliche Beschreibung der Verwendung von seriellen histologischen Abschnitten zur Definition, präzisen Quantifizierung und Erkennung morphometrischer Defekte.

Zusammenfassung

Das murine excisionale Wundmodell wurde ausgiebig verwendet, um jede der sequenziell überlappenden Phasen der Wundheilung zu untersuchen: Entzündung, Proliferation und Umbau. Murine Wunden haben ein histologisch gut definiertes und leicht erkennbares Wundbett, über das diese verschiedenen Phasen des Heilungsprozesses messbar sind. Innerhalb des Feldes ist es üblich, eine willkürlich definierte "Mitte" der Wunde für histologische Analysen zu verwenden. Wunden sind jedoch ein dreidimensionales Gebilde und oft nicht histologisch symmetrisch, was die Notwendigkeit einer klar definierten und robusten Methode der Quantifizierung zur Erkennung morphometrischer Defekte mit geringer Effektgröße unterstützt. In diesem Protokoll beschreiben wir das Verfahren zum Erstellen bilateraler, volldickender Exzisionswunden bei Mäusen sowie eine detaillierte Anleitung zur Messung morphometrischer Parameter mithilfe eines Bildverarbeitungsprogramms auf ausgewählten seriellen Abschnitten. Die zweidimensionigen Messungen von Wundlänge, epidermaler Länge, epidermaler Fläche und Wundfläche werden in Kombination mit dem bekannten Abstand zwischen abschnittsweise verwendet, um den dreidimensionigen epidermalen Bereich zu extrapolieren, der die Wunde, die gesamte Wundfläche, das epidermale Volumen und das Wundvolumen abdeckt. Obwohl diese detaillierte histologische Analyse zeitaufwändiger ist als herkömmliche Analysen, erhöht ihre Strenge die Wahrscheinlichkeit, neuartige Phänotypen in einem inhärent komplexen Wundheilungsprozess zu erkennen.

Einleitung

Die Hautwundheilung ist ein komplexer biologischer Prozess mit sequenziell überlappenden Phasen. Es erfordert die Koordination zellulärer und molekularer Prozesse, die zeitlich und räumlich reguliert werden, um die Barrierefunktion des beschädigten Epithels wiederherzustellen. In der ersten Phase wandern Entzündungen, Neutrophile und Makrophagen in die Wunde und mobilisieren lokale und systemische Abwehrkräfte1. Nach und überlappend ist die Entzündliche Phase das Proliferationsstadium. Fibroblasten beginnen sich schnell auszumehren und in das Granulationsgewebe zu wandern. Keratinozyten weg von der Vorderkante, die sich richtungsweisend zur Wunde ausbreiten, während differenzierte Keratinozyten in der Vorderkante wandern, um die Wunde2wieder zu epithelisieren. Schließlich beginnt die Umbau- und Reifungsphase, in der Fibroblasten im Granulationsgewebe zu synthetisieren und Kollagen ablagern. Der Umbau und die Organisation der neuen Matrix kann bis zu 1 Jahr nach Verletzungdauern 3. Aufgrund der Komplexität überlappender Ereignisse mit Cross-Talk zwischen mehreren Zelltypen und trotz jahrelanger Forschung bleiben viele der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Wundheilung zugrunde liegen, schlecht verstanden.

Das Mausmodell ist das vorherrschende Säugetiermodell zur Untersuchung von Mechanismen der Wundheilung aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, relativ niedrigen Kosten und genetischen Manipulierbarkeit1,4,5. Obwohl verschiedene Arten von Wunden im murinen Modell beschrieben wurden, ist die häufigste eine exzistive Wunde (entweder bilateraler Schlag oder direkte Schlagbiopsie), gefolgt von Inzisionswundmodellen4. Das exzisionale Wundmodell hat einen deutlichen Vorteil gegenüber dem Inzisionsmodell, da es von Natur aus Kontrollgewebe erzeugt, das den Heilungsprozess nicht durchlaufen hat. Das im Rahmen des Operationsprotokolls ausgeschnittene Schlagbiopsiegewebe kann auf die gleiche Weise wie das verwundete Gewebe verarbeitet und zur Ermittlung der otostatischen Bedingungen für ein gewünschtes Kriterium verwendet werden. Verbrauchgesteuertes Kontrollgewebe kann auch nützlich sein, wenn die Auswirkungen einer Hautvorbehandlung beurteilt oder eine erfolgreiche Genveränderung zum Zeitpunkt der Verletzung bestätigt wird4.

Heilparameter können mit vielen verschiedenen Techniken bewertet werden, einschließlich Planimetrie oder Histologie. Die Planimetrie kann jedoch nur sichtbare Eigenschaften der Wunde bewerten und korreliert aufgrund des Vorhandenseins eines Schorfes oft nicht mit Messungen der Heilung, die durch histologische Visualisierung visualisiert werden, wodurch die Histologie zum "Goldstandard" der Analyse4wird. Obwohl die histologische Analyse der Goldstandard ist, wird sie am häufigsten auf einer beliebigen Teilmenge der Wunde6,7durchgeführt. Zum Beispiel ist das Schneiden der Wunde in "halb" vor dem Einbetten und Schneiden der Wunde derzeit gängige Praxis, um den Zeit- und Ressourcenaufwand für das Schneiden von Materialien und die Datenanalyse zu reduzieren. Die in diesem Protokoll beschriebene Methode der morphometrischen Analyse wurde entwickelt, um das gesamte Wundgewebe zu umfassen, die morphologischen Eigenschaften der Wunde genau widerzuspiegeln und die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, Wundheilungsdefekte mit einer geringen Effektgröße zu erkennen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine chirurgische Methode zur Erzeugung der am häufigsten untersuchten murinen Wunde, der bilateralen Volldicke excisionalwunde, sowie eine detaillierte und strenge Methode für die histologische Analyse, die selten auf dem Feld verwendet wird.

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Protokoll

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Bundesbestimmungen und der Politik der University of Iowa und Verfahren abgeschlossen und wurden von der University of Iowa IACUC genehmigt.

1. Tiere und Haltung

  1. Verwenden Sie erwachsene Mäuse der gewünschten Mauslinie im Alter von 8-10 Wochen, wenn das Haarfollikelstadium in Telogen ist.
  2. Trennen Sie am Tag der Operation Mäuse in saubere Käfige und einzeln, um Wundstörungen zu minimieren.

2. Chirurgie

HINWEIS: Es ist nicht notwendig, sterile chirurgische Bedingungen aufrechtzuerhalten. Während darauf geachtet werden sollte, die Sterilität zwischen Tieren aufrechtzuerhalten, erfolgt die Stanzbiopsie selbst auf einer sauberen, aber nicht sterilen Oberfläche. Die Operationsdauer pro Tier liegt zwischen 10 und 15 Minuten.

  1. Anästhesisierung
    1. Anästhesisieren Sie das Tier für 1-2 min in einer Induktionskammer mit dem Isofluran-Verdampfer auf eine Durchflussrate von 4-5% eingestellt und der Sauerstoffdurchflusszähler auf 1 Liter pro Minute eingestellt. Siehe Diskussion für alternative Anästhesieoptionen.
    2. Bestätigen Sie die richtige Anästhesie, bevor Sie mit dem Verfahren beginnen. Die Tiefe der Anästhesie kann durch eine feste Zehenklemme bestätigt werden.
    3. Übertragen Sie die Maus aus dem Induktionsbehälter auf einen Nasenkegel und reduzieren Sie den Isofluran-Durchfluss auf 1,5 % und den Sauerstoffdurchflusszähler auf 0,5 l/min.
    4. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf beide Augen auf, da das Verfahren 5 min überschreitet.
    5. Halten Sie die normale Körpertemperatur mit einem Thermopad aufrecht.
  2. Vorbereitung der Wundstelle
    1. Verwenden Sie einen elektrischen Rasiermesser Clipper in einer kaudalen rostralen Bewegung, um das Fell auf der Rückseite der Maus auf schulterebene zu entfernen. Entfernen Sie das Haar niedriger auf dem Rücken nach Bedarf, wenn mehr als zwei Wunden durchführen.
    2. Entfernen Sie das restliche Haar mit einer Rasierklinge in einer rostralen Kaudalbewegung, die bei 20° von der Rückseite der Maus gehalten wird, um den abgeschnittenen Bereich eng zu rasieren (Abbildung 1A).
    3. Reinigen Sie den rasierten Bereich mit einem Povidon-Jod-Tupfer.
    4. Wischen Sie die Haut mit einem sterilen 70% Isopropylalkohol-Präparat ab, um mögliche hautnahe Reizungen durch den Jodabstrich zu reduzieren.
  3. Verletzt
    1. Kneifen Sie die Haut zwischen den Schulterblättern entlang der dorsalen Mittellinie und ziehen Sie die eingeklemmte Hautfalte vom Körper weg (Abbildung 1B).
    2. Positionieren Sie die Maus auf der Seite mit der Hautfalte auf einer flachen Oberfläche, die mit einem sauberen Handtuch auf Papierbasis oder einem gleichwertigen Tuch drapiert ist. Verwenden Sie ein Blatt Zahnwachs unter dem Handtuch, um die darunter liegende Oberfläche vor Beschädigungen zu schützen (Abbildung 1C).
    3. Legen Sie den Biopsie-Punch der gewünschten Größe so nah wie möglich am Körper und lassen Sie die Haut entspannen. Dehnen Sie die Haut nicht, oder die Wundgröße ist größer als die angegebene Stempelgröße(Abbildung 1D).
    4. Punch die Haut durch Drücken nach unten, kann eine Schaukelbewegung verwendet werden, um sicherzustellen, dass alle Schichten der Haut auf beiden Seiten durchdrungen wurden (Abbildung 1E). Verwenden Sie einen neuen Biopsie-Punch für jedes Tier.
    5. Entfernen Sie die Schlagbiopsien von den Wunden (Abbildung 1F). Wenn es noch Befestigungsstellen gibt, verwenden Sie sterile Schere und Pinzette, um den Schlag von der umgebenden Haut zu befreien. Verarbeiten Sie das Schlagbiopsiekontrollgewebe nach Bedarf auf der Grundlage nachgelagerter Pläne für Wundheilungsanalysen (siehe Diskussion für Vorschläge).
    6. Nehmen Sie makroskopische Fotos aus der gleichen Entfernung zu den Wundstellen oder mit einem Lineal im Rahmen auf, um die anfängliche Wundfläche zu messen und Ausreißer aus der Analyse zu entfernen.
    7. Analgesie für mindestens 24 h gemäß einem zugelassenen Tierprotokoll verabreichen. Zum Beispiel: Buprenorphin SR-LAB, subkutan bei 0,5-2 mg/kg für 48 h Schmerzlinderung injiziert (siehe Diskussion für alternative Vorschläge und Überlegungen).
    8. Überwachen Sie die Maus, wie sie aus der Anästhesie kommt, bis sie eine aufrechte Haltung behält und normal um den Käfig herumläuft.

3. Post-Wund-Überwachung

  1. Überwachen Sie Mäuse täglich auf experimentelle Endpunkte, die vom Prüfer festgelegt werden und in Übereinstimmung mit und Einhaltung institutioneller Protokolle. Beispiele sind: Infektion, sichtbare Gewichtsabnahme, oder eine geknickte Körperhaltung.
  2. Nehmen Sie täglich makroskopische Fotos in kontrollierter Weise auf, wie es nach der ersten Operation getan wurde.

4. Wunden ernten

  1. Euthanisieren Sie Mäuse zum gewünschten Zeitpunkt nach der Wundung gemäß einem zugelassenen Tierprotokoll.
  2. Nehmen Sie makroskopische Fotos der Wundstellen in kontrollierter Weise im Einklang mit früheren Fotoaufnahmen auf (Abbildung 2A,C).
  3. Schneiden Sie ein breites Rechteck um die Wundstellen mit einem Skalpell (Abbildung 2D,E).
  4. Befreien Sie das rechteckige Stück Gewebe mit Schere und Pinzette, um zurück zu schälen und schneiden Sie die Haut weg vom darunter liegenden Gewebe(Abbildung 2F). In eine Petrischale geben (Abbildung 2G).
  5. Ernten Sie die Wunden. Schneiden Sie bis zu 2 mm unverwundetes Gewebe um alle Seiten der Wunde in einer rechteckigen Form(Abbildung 2H,I). Siehe Diskussion für alternative Optionen, um die Wunde zu ernten.
  6. Verarbeiten Sie die Wunden nach Bedarf für nachfolgende Studien. Reservieren Sie mindestens eine Wunde pro Maus für Paraffineinbettung und histologische Analyse.

5. Wundfixierung und Einbettung

  1. Beheben Der Wunde
    1. Fixieren Sie das Wundgewebe in einer frisch zubereiteten 4% Paraformaldehydlösung8 für 3 h bei Raumtemperatur und übertragen Sie es dann über Nacht auf 4 °C. Die Elektronenmikroskopie (EM) ist nicht erforderlich.
    2. Waschen Sie die Wunden zweimal für 30 min in 1x PBS.
    3. PBS durch 70% ETOH ersetzen und bei 4 °C bis zum Einbetten lagern. Verarbeiten Sie Gewebe innerhalb von 24-48 h, um Antigenverlust zu vermeiden oder innerhalb von 1-2 Wochen, wenn nur die Bewertung histologischer Eigenschaften.
  2. Prozess und Einbettung der Wunde
    1. Übertragen Sie jede Wunde auf eine Einbettkassette. Beschriften Sie das Einbetten von Kassetten in Bleistift, während der Vorgang Tinten entfernt.
    2. Verarbeiten Sie das Gewebe entweder manuell oder mit einem automatisierten Prozessor, indem Sie das Gewebe mit steigenden Ethanol-Prozentsätzen dehydrieren, mit Xylol löschen und dann das Gewebe mit Paraffinwachs infiltrieren (Tabelle 1).
    3. Die Wunde 90° ("stehend") von der horizontalen Oberfläche der Einbettform einbetten (Abbildung 3A,B).

6. Tag 0 Wundbereichsanalyse

  1. NIH-Image J oder NIH-Fiji freie Software herunterladen (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
  2. Öffnen Sie eine Datei mit einem Foto von Tag 0 Wunden.
  3. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für "Bereich" unter Analysieren | Messen einstellen.
  4. Wählen Sie "Skalierung festlegen" unter Analysierenaus. Geben Sie den Abstand in Pixel, den bekannten entsprechenden Abstand und die Einheit des Abstands (= Längeneinheit) ein, wenn makroskopische Messungen Teil der Studie sind, oder überspringen Sie diesen Schritt, wenn nur relative Messungen erforderlich sind.
  5. Wählen Sie "Freihandauswahl" auf der Fidschi-Symbolleiste aus.
  6. Umreißen Sie den Umfang der Wunde.
  7. Klicken Sie unter Analysierenauf Measure .
  8. Erstellen Sie eine Tabelle, um die Messungen pro Tier pro Wunde nachzuverfolgen.
  9. Kopieren Sie die Messung des Wundbereichs in der Kalkulationstabelle.
  10. Berechnen Sie die mittlere Fläche und die Standardabweichung aller Wunden für ein bestimmtes Experiment.
  11. Ausgeschlossen eige alle Wunden außerhalb von zwei Standardabweichungen des Mittelwerts von der histologischen Analyse.

7. Serielle Steilierung

  1. Kühlen Sie die paraffin-eingebetteten Wundblöcke über Nacht bei 4 °C.
  2. Setzen Sie den Paraffinblock auf den Blockhalter des Mikrotom und orientieren Sie sich so, dass die Klinge gerade über den Block schneidet. Richten Sie den Block so aus, dass das Gewebe bei 90° "steht", was die gleichzeitige Schnittung der Epidermis und Dermis ermöglicht (Abbildung 3C,D).
  3. Machen Sie 2-4 Bänder mit 20-30 Paraffinabschnitten von je 7 m.
  4. Verwenden Sie einen trockenen Pinsel und eine Seziernadel, um jedes Band auf eine feste, aber mantisierbare Oberfläche wie eine feste schwarze Kunststofffolie zu übertragen.
  5. Lösen Sie den oberen Teil jedes Bandes mit einer Rasierklinge und legen Sie sie auf ein Mikroskopschlitten.
  6. Beobachten Sie die ungefärbten Abschnitte unter einem Hellfeldmikroskop, um festzustellen, welche verwundetes Gewebe enthalten, das durch das Fehlen von Haarfollikel, Veränderungen im Aussehen des Bindegewebes oder der Epidermis und/oder das Vorhandensein eines Schorfes identifiziert werden kann (Abbildung 4A,B).
  7. Entsorgen Sie unverwundete Abschnitte bis zu 20 Abschnitte vor Dem Beginn der Wunde.
  8. Abschnitt durch die Wunde durch die Wiederholung der Schritte 7.3 und 7.4, bis keine Wunde in unbefleckten Abschnitten erkannt wird.

8. Montage von Paraffinabschnitten

  1. Separate Paraffinabschnitte alle 5 Abschnitte mit einer Rasierklinge, beginnend mit dem ersten Band (Abbildung 3E).
  2. Etikettenmikroskopgleitet sowohl mit der Foliennummer als auch mit allen Schnittnummern.
  3. Schnappen Sie sich die Gruppe von 5 Abschnitten mit einem nassen Pinsel und schwimmen Sie sie auf der Wasseroberfläche eines warmen Wasserbades (40-45 °C), um sie abzuflachen.
  4. Wählen Sie die Gruppe von 5 Abschnitten aus dem Wasserbad mit einem der beschrifteten Mikroskopschlitten (Abbildung 3F) und legen Sie auf einem Diawärmer-Set bei 37 °C für bis zu 24 h.
  5. Bewahren Sie die Folien aufrecht in einer Folienbox auf.

9. Histologische Färbung

  1. Übertragen Sie jeden8. Mikroskopschlitten (entspricht jedem40. Paraffinabschnitt) auf ein Färbegestell und färben Sie mit Hämatoxylin und Eosin.

10. Mikroskopische Bildgebung

  1. Erfassen Sie Bilder mit einem Hellfeldmikroskop, das mit einer 4-fachen objektiven und digitalen Erfassungsfähigkeit ausgestattet ist. Zeichnen Sie den Maßstab auf, auf dem das Bild aufgenommen wird.
  2. Stellen Sie die gesamte Wunde des oberen Abschnitts jeder gebeizten Rutsche vor und stellen Sie sicher, dass auf beiden Seiten ein unverwundetes Gewebe enthalten ist. Nehmen Sie mehrere überlappende Bilder auf, wenn die Wunde größer als der Rahmen eines einzelnen Bildes ist.
  3. Speichern Sie die Datei einschließlich der Abschnittsnummer für die morphometrische Analyse. Verwenden Sie die Schnittnummer gefolgt von a, b, c usw. für überlappende Bilder derselben Wunde.

11. Morphometrische Analyse

HINWEIS: Wenn sich die Wunde über mehrere Bilder erstreckt, summieren Sie die Ausdenmesswerte der einzelnen Bilder, um einen Wert pro Metrik pro Gewickeltschnitt zu erhalten, der in der Kalkulationstabelle aufzeichnet.

  1. Öffnen Sie in Bild J eine digitale Datei eines befleckten Wundbildes. Verwenden Sie keine genähten Bilder für die Analyse. Führen Sie Messungen an vergrößerten überlappenden Bildern durch, indem Sie Sehenswürdigkeiten zum Auslassen und Aufnehmen von Messungen von Bild zu Bild finden.
  2. Legen Sie die Skalierungs- und Messeinstellungen fest.
    1. Wählen Sie "Skalierung festlegen" unter Analysierenaus. Geben Sie den Abstand in Pixel, den bekannten entsprechenden Abstand und die Einheit des Abstands (= Längeneinheit) ein. Die Skala sollte im Fenster angezeigt werden und dem Maßstab entsprechen, bei dem das Bild aufgenommen wurde.
    2. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Global", um die Skalierung für jedes geöffnete Bild gleich zu halten.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 11.2.1 bis 11.2.2 jedes Mal, wenn Bild J geschlossen und wieder geöffnet wird.
    4. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für "Bereich" unter Analysieren | Messen einstellen.
  3. Messen Sie die Wundlänge
    1. Wählen Sie "Freihandauswahl" auf der Fidschi-Symbolleiste aus.
    2. Messen Sie vom letzten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf einer Seite der Wunde bis zum ersten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf der anderen Seite der Wunde (Abbildung 4A,B).
    3. Verfolgen Sie entlang der dermo-epidermalen Kreuzung, um diese beiden Sehenswürdigkeiten zu erreichen. Wenn die Epidermis nicht die gesamte Wunde bedeckt, folgen Sie der dermo-epidermalen Kreuzung auf einer Seite der Wunde und wo die wandernde Zunge endet, folgen Sie dem überlegenen Aspekt des Granulationsgewebes oder der Kreuzung zwischen dem Granulationsgewebe und dem Schorf, bis Sie die wandernde Zunge erreichen und schließlich der erste Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf der anderen Seite(Abbildung 4E,F).
    4. Klicken Sie unter Analysierenauf Messen. Die Länge der Messung wird in den gleichen Einheiten angezeigt, die in der Skala festgelegt sind.
    5. Erstellen Sie eine Kalkulationstabelle, um die Messungen nachzuverfolgen (Ergänzende Tabelle 1).
    6. Kopieren Sie die Wundlänge in die Kalkulationstabelle.
  4. Messen sie die epidermale Länge
    1. Wenn die Epidermis die gesamte Wunde bedeckt, ist die epidermale Länge die gleiche wie die Wundlänge.
      1. Kopieren Sie die Messung "Wundlänge" in die Spalte "epidermale Länge" in der Excel-Tabelle, und fahren Sie mit Schritt 11.5 fort.
    2. Wenn die Epidermis nicht die gesamte Wunde abdeckt, wählen Sie die "Freihandauswahl" und messen Sie den Abstand zwischen jeder epidermalen Vorderkante nach dem überlegenen Aspekt des Granulationsgewebes oder der Kreuzung zwischen dem Granulationsgewebe und dem Schorf zum ersten Haarfollikel (Abbildung 4C,D).
      1. Klicken Sie unter Analysierenauf Messen.
      2. Subtrahieren Sie diese Messung von der Wundlänge und notieren Sie die Zahl unter "epidermale Länge" in der Excel-Tabelle.
  5. Messen Sie den Wundbereich
    1. Wählen Sie "Freihandauswahl" auf der Fidschi-Symbolleiste aus.
    2. Messen Sie vom letzten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf einer Seite der Wunde bis zum ersten Haarfollikel des unverletzten Gewebes auf der anderen Seite der Wunde (Abbildung 4A,B,E,F).
    3. Verfolgen Sie entlang des überlegenen Aspekts der Epidermis (nicht den Schorf enthalten) oder den überlegenen Aspekt des Granulationsgewebes, wenn die Wunde nicht vollständig von der Epidermis bedeckt ist.
    4. Fahren Sie fort, vertikal entlang der Haarfollikel in das Granulationsgewebe zu verfolgen, sobald der gegenüberliegende Haarfollikel erreicht ist und bis Fettgewebe oder Muskel erreicht ist. Folgen Sie der unteren Grenze des Granulationsgewebes auf der gegenüberliegenden Seite der Wunde und verbinden Sie den Ausgangspunkt entlang des Haarfollikels, um den Bereich zu schließen (Abbildung 4E,F).
    5. Klicken Sie unter Analysierenauf Messen.
    6. Kopieren Sie den Wundbereich in die Tabelle unter "Wundbereich gemessen".
  6. Messen Sie den epidermalen Bereich
    1. Wählen Sie "Freihandauswahl" auf der Fidschi-Symbolleiste aus.
    2. Wenn die Wunde vollständig epithelialisiert ist:
      1. Verfolgen Sie entlang des überlegenen Aspekts der Epidermis, bis der gegenüberliegende Haarfollikel erreicht ist, und vervollständigen Sie den Bereich, indem Sie zum Ausgangspunkt nach der dermo-epidermalen Kreuzung zwischen Epidermis und Dermis zurückkehren (Abbildung 4D).
      2. Klicken Sie unter Analysierenauf Messen.
      3. Kopieren Sie den epidermalen Bereich in die Excel-Tabelle unter "epidermaler Bereich gemessen" und fahren Sie mit Schritt 11.7 fort.
    3. Wenn die Wunde nicht vollständig epithelialisiert ist:
      1. Verfolgen Sie entlang des überlegenen Aspekts der Epidermis bis zur Vorderkante und kehren Sie zum Ausgangspunkt nach der dermo-epidermalen Kreuzung zurück (Abbildung 4C).
      2. Klicken Sie unter Analysierenauf Messen.
      3. Wiederholen Sie Schritt 11.6.3.1 und 11.6.3.2 auf der gegenüberliegenden Seite der Wunde.
      4. Klicken Sie unter Analysieren auf Messen.
      5. Summieren Sie sich die beiden Zahlen, die in den Schritten 11.6.3.2 und 11.6.3.4 erhalten wurden, und geben Sie das Ergebnis unter "epidermaler Fläche gemessen" in die Tabelle ein.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 11.3 bis 11.6 auf jedem40. Abschnitt (jeder8. Schlitten).
  8. Berechnen Sie den epidermalen Bereich der gesamten Wunde.
    1. Erstellen Sie eine neue Spalte in der Tabelle "epidermaler Bereich berechnet" neben "epidermaler Länge".
    2. Multiplizieren Sie die Zahl für "epidermale Länge" mit 280 für jeden Abschnitt mit Ausnahme des letzten Abschnitts (7 m dicker Abschnitt x 40 Abschnitte).
    3. Multiplizieren Sie die Zahl für "epidermale Länge" mit 7 für den letzten Abschnitt (Dicke des Abschnitts).
    4. Summieren Sie den Wert der "epidermalen Fläche berechnet" für jeden Abschnitt, um die epidermale Fläche der gesamten Wunde zu erhalten.
  9. Berechnen Sie die Wundfläche der gesamten Wunde.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 11.8.1 bis 11.8.4 mit den Wundlängenmessungen.
  10. Berechnen Sie das epidermale Volumen der gesamten Wunde.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 11.8.1 bis 11.8.4 mit den Messungen "epidermaler Fläche".
  11. Berechnen Sie das Wundvolumen der gesamten Wunde.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 11.8.1 bis 11.8.4 mit den Messungen "Wundbereich gemessen".
  12. Berechnen Sie den Prozentsatz des epidermalen Volumens in der Wunde.
    1. Dividieren Sie das gesamte epidermale Volumen durch das gesamte Wundvolumen und multiplizieren Sie es mit 100, um den Prozentsatz zu erhalten (tun Sie dieses Verhältnis nicht für jeden Abschnitt).
  13. Berechnen Sie den Prozentsatz der epidermalen Fläche unter der Wundfläche.
    1. Dividieren Sie die gesamte epidermale Fläche durch die gesamte Wundfläche und multiplizieren Sie sie mit 100, um den Prozentsatz zu erhalten. Wenn eine Wunde vollständig epithelialisiert ist, sollte diese Zahl 100 sein.

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Ergebnisse

Abbildung 5 zeigt den Bereich der gemessenen und berechneten Werte, die durch morphometrische Analysen an Wildtypwunden erzielt wurden, die in verschiedenen Mausstämmen von mehreren Chirurgen erzeugt und von verschiedenen Individuen analysiert wurden. Wildtyp-Mäuse aus verschiedenen Stämmen können statistische Unterschiede aufweisen, wie sie sowohl in unseren Studien als auch in der Literatur9,10beschrieben werden. Basierend auf dies...

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Diskussion

Das bilaterale Exzisions-Wundmodell ist ein hochgradig anpassbares Verfahren, das verwendet werden kann, um viele verschiedene Aspekte der Wundheilung zu studieren. Bevor die Ermittler ein Wundheilungsprojekt beginnen, sollten sie eine Leistungsanalyse durchführen, um die Anzahl der Wunden zu ermitteln, die erforderlich sind, um einen Defekt einer bestimmten Effektgröße zu erkennen. In der Literatur gibt es Ungereimtheiten darüber, ob einzelne Mäuse oder Wunden als biologische Repliken verwendet werden sollten, jedoch ze...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken allen Mitgliedern des Dunnwald Lab, die im Laufe der Jahre zur Optimierung dieses Protokolls beigetragen haben, und Gina Schatteman, deren Beharrlichkeit bei der Förderung des Einsatzes von seriellen Sektionen für die Wundanalyse seine Entstehung ermöglichte. Diese Arbeit wurde durch Fördermittel von NIH/NIAMS an Martine Dunnwald (AR067739) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100% Ethanol
70% Ethanol
80% Ethanol
95% Ethanol
AlkoholvorbereitungNOVAPLUSV910070% Isopropylalkohol, steril
Ammoniumhydroxid
Biopsie-PadsCellpath22-222-012
Schwarze KunststoffplatteEtwas Festes, aber dennoch manipulierbares Blatt, etwa so groß wie ein Blatt Papier
HellfeldmikroskopMit digitalen Aufnahmefunktionen und einem 4-fach-Objektiv
Applikatoren
Deckgläser22 x 60 #1
Zahnwachsblätter
DigitalkameraInklusive Lineal für die Skala, falls zutreffend
Präpariernadel (gerade)
Einbettformen22 x 22 x 12
EinbettungsringeSimport Scientific Inc.M460
Eosin Y
Eisessigsäure
Haarschneider
HeizkissenConairFeuchtes Trockenheizkissen
Hämatoxylin-Mikrotom
Mikrotomklingen
Pinsel
Paraffin Typ 6
Paraformaldehyd
Permount
Phosphatpufferlösung (PBS)
Povidon-JodAplicare82-255
VerarbeitungskassetteSimport Scientific Inc.M490-2
RasierklingenASR.009
Skalpellklingen #10
Skalpellgriff
Scharfe chirurgische Schere, steril für die Chirurgie
HautbiopsiestempelGröße wie vom Forscher bestimmt
Objektträgerboxen
Objektträgerwärmer
Superfrostierte ObjektträgerFisher Scientific22 037 246
Temperaturregelung Wasserbad
EinbettstationMindestens ein Paraffinspender und eine Kühlplatte
TaschentuchprozessorMindestens ein Ofen mit Vakuumpumpe
Dreifaches Antibiotikum
Augensalbenpinzette, gebogene Spitzesteril für die Chirurgie
, Pinzette, konische Spitzesteril für die
Chirurgie WypAll X60Kimberly-Clark34865
mit Baumwollspitze Regular Duty für Gewebeeinbettung , ,

Referenzen

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