Dieses Protokoll bietet Methoden zur Visualisierung von Bakterienzellen und Polysaccharid-Syntheselocus (Psl)-Polysacchariden im Sputum von Mukoviszidose-Patienten.
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Methodenartikel
Visualisierung von Pseudomonas aeruginosa im Sputum von Mukoviszidose-Patienten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die frühzeitige Erkennung und Eradikation von Pseudomonas aeruginosa in der Lunge von Mukoviszidose-Patienten kann das Risiko einer chronischen Infektion verringern. Die Entwicklung chronischer P. aeruginosa-Infektionen ist mit einer Abnahme der Lungenfunktion und einer erhöhten Morbidität verbunden. Daher besteht ein großes Interesse an der Aufklärung der Gründe für das Scheitern der Eradikation von P. aeruginosa mit einer antibiotischen Therapie, die bei etwa 10-40% der pädiatrischen Patienten auftritt. Einer von vielen Faktoren, die die Wirtsclearance von P. aeruginosa und die Antibiotikaempfindlichkeit beeinflussen können, sind Variationen in der räumlichen Organisation (z. B. Aggregation oder Biofilmbildung) und der Polysaccharidproduktion. Daher waren wir daran interessiert, die in situ Charakteristika von P. aeruginosa im Sputum von Mukoviszidose-Patienten sichtbar zu machen. Eine Gewebereinigungstechnik wurde auf Sputumproben angewendet, nachdem die Proben in eine Hydrogelmatrix eingebettet wurden, um die 3D-Strukturen relativ zu den Wirtszellen zu erhalten. Nach der Gewebereinigung wurden fluoreszierende Markierungen und Farbstoffe hinzugefügt, um eine Visualisierung zu ermöglichen. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Visualisierung von Bakterienzellen, Bindung von fluoreszenzmarkierten Anti-Psl-Antikörpern zur Visualisierung des Exopolysaccharids und DAPI-Färbung zur Färbung von Wirtszellen, um strukturelle Einblicke zu erhalten. Diese Methoden ermöglichten die hochauflösende Bildgebung von P. aeruginosa im Sputum von Mukoviszidose-Patienten mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie.
Einleitung
In dieser Studie wurden Experimente durchgeführt, um die in vivo Struktur von Pseudomonas aeruginosa im Sputum von pädiatrischen Mukoviszidose-Patienten (CF) sichtbar zu machen. P. aeruginosa-Infektionen werden bei 30-40% der pädiatrischen Mukoviszidose-Bevölkerung chronisch; Wenn sich chronische Infektionen erst einmal etabliert haben, sind sie fast unmöglich zu beseitigen1. P. aeruginosa-Isolate von Patienten mit früher Infektion sind im Allgemeinen anfälliger für antimikrobielle Mittel, daher werden diese mit anti-pseudomonalen Antibiotika behandelt, um die Etablierung einer chronischen Infektion zu verhindern
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Protokoll
Für die Entnahme und Lagerung von Sputumproben von menschlichen Probanden ist die Genehmigung des Research Ethics Board (REB) erforderlich. Die hier vorgestellten Studien wurden vom Krankenhaus für kranke Kinder REB#1000058579 genehmigt.
1. Sputum-Entnahme
- Auswurf in einem sterilen Auffangbecher aufbewahren und sofort vor der Fixierung maximal 24 h bei 4 °C lagern.
HINWEIS: Wenn das Sputum zu lange bei 4 °C ohne Fixierung belassen wird, kann dies zu einem Zellabbau führen, insbesondere zum Abbau der weißen Blutkörperchen. Eine Fixierung so schnell wie möglich wird bevorzugt. - Überführen Sie die Sputumproben in ein ster....
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Ergebnisse
Das Gesamtdesign des Experiments ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 zusammengefasst. Abbildung 1 enthält eine Zusammenfassung der Protokolle für die Sputumverarbeitung und die Sputumreinigung. Die Sputumbearbeitung und -reinigung kann bis zu 17 Tage dauern. Das Protokoll kann jedoch gestoppt werden, und die Proben können nach der Fixierung mit PFA (Tag 2) oder nach der Gewebereinigung (Tage 5-17 je nach Reinigungszeit) gelagert werd.......
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Diskussion
Der Zweck dieses Protokolls ist es, einen Einblick in die in-situ Organisation von P. aeruginosa-Zellen im Sputum von Mukoviszidose-Patienten zu ermöglichen. Sputumproben sollten bis zur Verarbeitung bei 4 °C gelagert werden, wenn sie nicht sofort fixiert werden können. Es wurde gezeigt, dass sich die Zellzahlen von P. aeruginosa im Sputum nicht signifikant ändern, wenn sie bei 1 h, 24 h oder 48 h verarbeitet werden, wenn sie bei 4 °C gelagert werden, obwohl die Bakterienzellzahl bei 25 °C für 24 oder 4.......
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Danksagungen
Die Autoren danken der Cystic Fibrosis Foundation, die diese Forschung finanziert hat, und MedImmune für die großzügige Spende von Anti-Psl0096-Antikörpern. Für diese Studie wurde die Bildgebung an der CAMiLoD-Bildgebungseinrichtung der University of Toronto durchgeführt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 29:1 Acrylamid Bisacrylamid, 30 % Lösung | BioRad | 161-0146 | |
| 8-Kammer-Deckglas Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| Coverwell-Perfusionskammern | Elektronenmikroskopie | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase Inhibitor | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | Bestelldetails: Produkt: Modifiziertes DNA-Oligo; Name: PseaerA; Sequenz: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; Synthese: 50 nmol; Reinigung: HPLC; Zustand des Schiffes: Volle Ausbeute (trocken) | |
| Psl0096-Texas Red | Medimmune | Die Psl0096-Texas Red Antikörper waren ein Geschenk von Medimmune und das Unternehmen sollte für Bestellanfragen kontaktiert werden. | |
| VA-044 Härter | Wako | 27776-21-21 |
Referenzen
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L.
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Nachdrucke und Genehmigungen
