Methodenartikel

Untersuchung der Adipose-Gewebestruktur durch Methylsalicylat-Clearing und 3D-Bildgebung

DOI:

10.3791/61640

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19. August 2020

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1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir eine einfache, kostengünstige und schnelle Clearing-Methode, um die 3D-Struktur von Maus- und menschlichem weiß-fettgewebe mithilfe einer Kombination von Markern zu lösen, um Vaskulatur, Kerne, Immunzellen, Neuronen und Lipid-Tröpfchen-Beschichtungsproteine durch fluoreszierende Bildgebung zu visualisieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adipositas ist ein weltweit wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit, das das Risiko erhöht, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes und Lebererkrankungen zu entwickeln. Adipositas ist durch eine Zunahme der Fettgewebemasse (AT) aufgrund von Adipozytenhyperplasie und/oder Hypertrophie gekennzeichnet, was zu einer tiefgreifenden Umgestaltung seiner dreidimensionalen Struktur führt. Tatsächlich ist die maximale Fähigkeit von AT, während Adipositas zu expandieren, von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Adipositas-assoziierten Pathologien. Diese AT-Erweiterung ist ein wichtiger homöostatischer Mechanismus, um die Anpassung an einen Überschuss an Energiezufuhr zu ermöglichen und schädliche Lipid-Spillover auf andere Stoffwechselorgane wie Muskel und Leber zu vermeiden. Daher ist das Verständnis der strukturellen Umgestaltung, die zum Scheitern der AT-Erweiterung führt, eine grundlegende Frage mit hoher klinischer Anwendbarkeit. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache und schnelle Clearing-Methode, die routinemäßig in unserem Labor verwendet wird, um die Morphologie von Maus und menschlichem weiß fettem Gewebe durch fluoreszierende Bildgebung zu erforschen. Diese optimierte AT-Clearing-Methode wird problemlos in jedem Standardlabor durchgeführt, das mit einer chemischen Haube, einem temperaturgeregelten Orbitalshaker und einem Fluoreszenzmikroskop ausgestattet ist. Darüber hinaus sind die verwendeten chemischen Verbindungen leicht verfügbar. Wichtig ist, dass diese Methode es ermöglicht, die 3D-AT-Struktur aufzulösen, indem verschiedene Marker gefärbt werden, um die Adipozyten, die neuronalen und vaskulären Netzwerke sowie die angeborene und adaptive Immunzellenverteilung gezielt zu visualisieren.

Einleitung

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Adipositas ist durch eine Zunahme der Fettgewebemasse gekennzeichnet und hat sich zu einem wichtigen weltweiten Problem der öffentlichen Gesundheit entwickelt, da Menschen mit Adipositas ein erhöhtes Risiko haben, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes, Lebererkrankungen und einige Krebsarten zu entwickeln.

Eine grundlegende physiologische Funktion des Fettgewebes ist es, Ganzkörperglukose und Lipidhomöostase1,2zu modulieren. Während der Fütterungszeit speichern die Adipozyten (d. h. die Hauptzellen des Fettgewebes) den Überschuss an Glukose und Lipiden, die durch eine Mahlzeit in Triglyceride bereitgestellt werden. Während des Fastens brechen die Adipozyten die Triglyceride in nicht veresterte Fettsäuren und Glycerin auf, um den Energiebedarf des Körpers zu decken. Während der Entwicklung von Adipositas, Fettgewebe erweitern, indem sie die Größe (Hypertrophe) und/oder die Anzahl (Hyperplasie) der Adipozyten1, um ihre Speicherkapazität zu erhöhen. Wenn die Ausdehnung des Fettgewebes an seine Grenze stößt, eine konstante, sehr variable unter den Patienten, akkumulieren sich die verbleibenden Lipide in anderen Stoffwechselorganen einschließlich Muskeln und Leber3,4, was zu ihrem funktionellen Versagen führt und adipositasbedingte kardiometabolische Komplikationen einleitet1,5. Daher ist die Identifizierung der Mechanismen, die die Fettgewebeexpansion steuern, eine zentrale klinische Herausforderung.

Die morphologischen Veränderungen, die während der Fettleibigkeit in Fettgewebe dokumentiert werden, sind mit seiner pathologischen Dysfunktion verbunden. Mehrere Färbungsverfahren wurden verwendet, um die Gewebeorganisation des Fettgewebes zu beschreiben, einschließlich Actin6, Gefäßmarker7, Lipid-Tröpfchen-Marker8, und spezifische Immunzellmarker9,10. Aufgrund des enormen Durchmessers von Adipozyten (50 bis 200 m)11ist es jedoch wichtig, einen großen Teil des gesamten Gewebes in drei Dimensionen zu analysieren, um die dramatischen strukturellen AT-Veränderungen, die während Adipositas beobachtet wurden, genau zu analysieren. Da das Licht jedoch nicht in ein undurchsichtiges Gewebe eindringt, ist eine Bildgebung in 3D innerhalb einer großen Gewebeprobe mittels Fluoreszenzmikroskopie nicht möglich. Methoden der Geweberäumung, um sie transparent zu machen, wurden in der Literatur berichtet (für eine Überprüfung, siehe12), die es einem ermöglichen, Gewebe zu löschen und eine gründliche, ganzgewebte Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen. Diese Methoden bieten beispiellose Möglichkeiten, die 3D-Zellorganisation in gesundem und krankem Gewebe zu bewerten. Jede der beschriebenen Methoden hat Vor- und Nachteile und muss daher je nach untersuchtem Gewebe sorgfältig ausgewählt werden (für eine Überprüfung siehe13). In der Tat erfordern einige Ansätze eine lange Inkubationszeit und/oder die Verwendung von Materialien oder Verbindungen, die entweder teuer, toxisch oder schwer zu erhalten sind14,,15,16,17,18,19. Unter Ausnutzung einer der ersten Verbindungen, die Werner Spalteholz vor einem Jahrhundert zur Reinigung von Geweben20verwendet hat, haben wir ein benutzerfreundliches und kostengünstiges Protokoll eingerichtet, das sehr gut für die Räumung aller Maus- und menschlichen Fettgewebedepots in jedem Labor mit typischen Geräten wie einer chemischen Haube, einem temperaturgeregelten Orbitalshaker und einem konfokalen Mikroskop geeignet ist.

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Protokoll

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Dieses Protokoll wurde getestet und ist für alle Maus- und menschlichen weißen Fettgewebedepots validiert. Mensch und Maus fettgewebe wurden entsprechend den europäischen Gesetzen gesammelt und von französischen und schwedischen Ethik-Ausschüssen genehmigt.

1. Fixierung von Maus und menschlichem weißem Fettgewebe

  1. Tauchen Sie die geernteten Maus- oder menschlichen weißen Fettgewebe in mindestens 10 ml PBS ein, die 4% Paraformaldehyd (PFA) in einem 15 ml Kunststoffrohr enthalten.
  2. Schütteln Sie das Kunststoffrohr bei Raumtemperatur auf einer Rollplatte für 1 h.
  3. Lassen Sie das Kunststoffrohr bei 4 °C über Nacht auf einer Rollplatte liegen, um die Fixierung abzuschließen.
    HINWEIS: Dieses Protokoll ist für große Fettgewebeproben geeignet, wie z. B. ganze epididymale Fettpolster, die von Mäusen mit normaler Ernährung gewonnen werden (≈250 mg - ≈0,6 cm3). Bei größeren Proben wie epididymalen Fettpolstern, die von Mäusen mit einer fettreichen Ernährung (≈1,5 g - ≈4 cm3) oder menschlichen Fettgewebeproben gewonnen wurden, obwohl das Clearing-Protokoll für die gesamte Probe (durch Skalieren des PFA und der Antikörpergemische) perfekt funktionieren sollte, schneiden wir im Allgemeinen Gewebestücke um 1 g (≈2,5 cm3), um die restlichen Proben entweder für zusätzliche Färbung oder Anwendungen zu reservieren. Für die PFA (Schritt 1.1.) empfehlen wir die Verwendung des etwa 10-fachen Volumens des Gewebes. Erhöhen Sie bei den Antikörpermischungen (Schritte 3.1. und 3.4.) das Volumen, um das Gewebe vollständig einzutauchen, und verwenden Sie ein 15 ml Kunststoffrohr (siehe Materialtabelle), wenn das Gewebe für ein 1,5 ml Kunststoffmikrorohr zu groß ist (siehe Materialtabelle).

2. Permeabilisierung und Sättigung von Maus und menschlichem weiß fettem Gewebe

  1. Spülen Sie das feste weiße Fettgewebe in 10 ml PBS für 5 min bei Raumtemperatur, um alle Spuren von PFA zu entfernen.
  2. Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml PBS enthält, ergänzt durch 0,3% Glycin (siehe Tabelle der Materialien) und schütteln Sie das Rohr bei Raumtemperatur in einem Orbitalshaker für 1 h bei 100 Umdrehungen pro Minute (Rpm), um die verbleibenden freien Aldehydgruppen zu löschen.
  3. Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml PBS enthält, ergänzt durch 0,2% Triton X-100 (siehe Materialtabelle) und schütteln Sie das Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker für 2 h bei 100 U/min.
  4. Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml PBS enthält, ergänzt durch 0,2% Triton X-100 und 20% DMSO (siehe Materialtabelle)und schütteln Sie das Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker bei 100 U/min über Nacht.
  5. Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS, ergänzt durch 0,1% Tween-20 (siehe Materialtabelle),0,1% Triton X-100, 0,1% Desoxycholat (siehe Materialtabelle)und 20 % DMSO und schütteln Sie das Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker bei 100 U/min für mindestens 24 h.
  6. Spülen Sie das Gewebe in einem 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS, ergänzt durch 0,2% Triton X-100, und schütteln Sie das Rohr bei Raumtemperatur in einem Orbitalshaker bei 100 U/min für 1 h.
  7. Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml PBS enthält, ergänzt durch 0,2% Triton X-100, 10% DMSO und 3% BSA (siehe Materialtabelle)und schütteln Sie das Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker bei 100 U/min für 12 h, um Standorte zu sättigen, die nicht spezifisch gegen Antikörper binden könnten.
    HINWEIS: In Schritt 2.7 kann die BSA durch Blutserum der Art des verwendeten sekundären Antikörpers ersetzt werden.

3. Färbung verfahren für Maus und menschliches weißes Fettgewebe

  1. Übertragen Sie das Gewebe in ein 1,5 ml Kunststoff-Mikrorohr, das 300 l PBS enthält, ergänzt durch 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA und die primären Antikörper (10x konzentrierter als bei Kryosection-Färbung, aber für jeden Antikörper sollte eine optimale Antikörperkonzentration bewertet werden). Schützen Sie das Rohr vor Licht, indem Sie es mit Aluminiumfolie abdecken und das Rohr mindestens zwei Tage lang in einem temperaturgeregelten Orbitalschüttler bei 100 U/min schütteln (siehe Anmerkung in Schritt 1.1 und Schritt 3.7.1).
  2. Spülen Sie das Gewebe in einem 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS, ergänzt mit 0,2% Triton X-100, 10% DMSO und 3% BSA, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker bei 100 U/min für 5 h. Führen Sie diesen Schritt zweimal aus.
  3. Spülen Sie das Gewebe in einem 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS, ergänzt mit 0,2% Triton X-100, 10% DMSO und 3% BSA, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker bei 100 U/min für eine Nacht bis zwei Tage.
  4. Übertragen Sie das Gewebe in ein 1,5 ml Kunststoff-Mikrorohr mit 300 l PBS, ergänzt durch 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA und die sekundären Antikörper (10x konzentrierter als bei Kryosektionsfärbung). Schützen Sie das Rohr vor Licht, indem Sie es mit Aluminiumfolie abdecken und das Rohr mindestens zwei Tage lang in einem temperaturgeregelten Orbitalschüttler bei 100 U/min schütteln (siehe Anmerkung in Schritt 1.1 und Schritt 3.7.1).
  5. Spülen Sie das Gewebe in einem 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS, ergänzt mit 0,2% Triton X-100, 10% DMSO und 3% BSA, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalschüttler bei 100 U/min für 5 h. Führen Sie diesen Schritt zweimal aus.
  6. Spülen Sie das Gewebe in einem 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS, ergänzt mit 0,2% Triton X-100, 10% DMSO und 3% BSA, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalschüttler bei 100 U/min für eine Nacht bis zwei Tage.
  7. Spülen Sie das Gewebe in einem 15 ml Kunststoffrohr mit 10 ml PBS und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei 37 °C in einem temperaturgeregelten Orbitalshaker bei 100 U/min für 2 h.
    HINWEIS: Für die Kennzeichnung spezifischer Strukturen wie Kerne oder Aktin müssen bei Schritt 3.1 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI oder gleichwertig) und/oder das fluoreszierend gekennzeichnete Phalloidin hinzugefügt werden. wenn nur fluoreszierend gekennzeichnete Primärantikörper oder in Schritt 3.4 verwendet werden. wenn sekundäre Antikörper verwendet werden.
    HINWEIS: Für das Färbeverfahren können primäre Antikörper verwendet werden, die bereits mit Fluorchromen konjugiert sind (wie sie für die Durchflusszytometrie verwendet werden), und wir empfehlen sie zur Zeitgewinnen und Spezifität. Selbst wenn primäre Mausantikörper verwendet werden können, gefolgt von sekundären Anti-Maus-Antikörpern, wie wir es hier gezeigt haben, haben wir oft unspezifische Färbungen von Blutgefäßen aufgrund zirkulierendes Immunglobulins beobachtet. Um dieses Problem zu vermeiden, werden primäre Antikörper, die bereits gekennzeichnet sind, dringend empfohlen, und hier liefern wir Beweise dafür, dass die in der Durchflusszytometrie verwendeten Antikörper mit unserem Verfahren kompatibel sind. Im konkreten Fall eines Antigens, das auf niedrigem Niveau exprimiert wird, ist jedoch ein Signalverstärkungsschritt über sekundäre Antikörper obligatorisch; Wenn der einzige verfügbare Primärantikörper in der Maus hergestellt wird, kann eine Herzperfusion der Mäuse mit PBS für mindestens 5 min am Opfer einen großen Teil des zirkulierenden Immunglobulins und damit die unspezifische Färbung entfernen.

4. Clearingverfahren für Maus und menschliches weißes Fettgewebe

  1. Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml 50% Ethanol enthält, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei Raumtemperatur in einem Orbitalshaker bei 100 U/min für 2 h.
  2. Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml 70% Ethanol enthält, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei Raumtemperatur in einem Orbitalshaker bei 100 U/min für 2 h.
  3. Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml 95% Ethanol enthält, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei Raumtemperatur in einem Orbitalshaker bei 100 U/min für 2 h.
  4. Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml 100% Ethanol enthält, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei Raumtemperatur in einem Orbitalshaker bei 100 U/min für 2 h.
  5. Tauchen Sie das Gewebe in ein 15 ml Kunststoffrohr ein, das 10 ml 100% Ethanol enthält, und schütteln Sie das vor Licht geschützte Rohr bei Raumtemperatur bei 100 U/min über Nacht in einem Orbitalshaker.
  6. Tauchen Sie das Gewebe in eine 20 ml Glasflasche mit einer Kunststoffkappe (siehe Materialtabelle) ein, die 5 ml Methylsalicylat (siehe Materialtabelle)unter einer chemischen Haube enthält, und schütteln Sie den vor Licht geschützten Glasbehälter bei Raumtemperatur bei 100 U/min bei 100 U/min für mindestens 2 h.
    HINWEIS: Das Clearingverfahren könnte (falls erforderlich) erheblich beschleunigt werden, indem die Schritte 4.3 vermieden werden. und 4.5., obwohl die endgültige Clearingqualität leicht reduziert würde.

5.3D-konfokale Bildgebung des gereinigten weißen Fettgewebes

  1. Übertragen Sie das Gewebe in eine metallische Bildkammer, die mit einem Glasboden (siehe Materialtabelle)unter einer chemischen Haube ausgestattet ist, und füllen Sie die Kammer mit frischem Methylsalicylat.
    HINWEIS: Um das Gewebe an Ort und Stelle zu sichern und so zu verhindern, dass es in der Kammer schwimmt oder sich seitlich bewegt, tragen Sie bei der Montage in die Kammer mehrere 18 mm runde Glasabdeckungen (siehe Materialtabelle)auf das Gewebe auf.
  2. Platzieren Sie die Bildkammer auf einem invertierten konfokalen Mikroskop.
  3. Stellen Sie das Gewebe mit einem objektiv mit geringer Vergrößerung (z. B. 4x Objektiv) dar, um einige cm3 3D-Karten des gesamten Fettgewebes oder der menschlichen Gewebeprobe zu erzeugen.
  4. Wählen Sie mehrere Bereiche für die Gewebeprobenahme bei höherer Vergrößerung aus. Verwenden Sie in der Regel ein 20-faches Fernluftobjektiv, das ein gutes Verhältnis zwischen Auflösung und Tiefe bietet. Wir erfassen große Mosaikbilder mit Z-Stacks zwischen 600 und 2000 m Tiefe.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein Fernziel, um tiefer in das Gewebe einzutauchen.

6. Extraktion quantitativer Ergebnisse aus den 3D-Fettgewebebildern

HINWEIS: Die Segmentierung der verschiedenen Strukturen und die anschließende Extraktion der quantitativen Informationen aus dem in Punkt 5 generierten 3D-Bildstapel kann mit einer der vielen vorhandenen Softwareoptionen für Bildanalyse, kommerziell oder Freeware, durchgeführt werden. In den folgenden Punkten beschreiben wir eine Strategie, die routinemäßig in unserem Labor verwendet wird, um quantitative Informationen aus 3D-Fettgewebebildern mit kommerzieller Software zu extrahieren (siehe Tabelle der Materialien).

  1. Konvertieren Sie die 3D-Stacks in das Softwareformat in freien Speicherplatz.
  2. Segmentieren Sie die Zellen.
    1. Öffnen Sie das Cell-Modul der Software.
    2. Ändern Sie die Einstellung Zellerkennung in Plasmamembranfärbung.
    3. Wählen Sie den fluoreszierenden Kanal des Markers, der zur Abgrenzung der Zellperipherie verwendet wird (Phalloidin, das kortikale Aktin- oder Plasmamembranmarker wie F4/80 für Makrophagen, TCR-β für T-Zellen oder Cluster von Differenzierungs-CD-Proteinen speziell für Immunzellsubtypen kennzeichnet).
    4. Richten Sie die Schwellenwerte ein, und stellen Sie einen Bereich der erwarteten Zellgröße bereit (d. h. 1 bis 200 m für die Zellerkennung).
    5. Führen Sie die Segmentierung aus. Ein dem Z-Stack entsprechendes Volumen wird mit den segmentierten Zellen generiert, die für jede der benachbarten Zellen mit einer anderen Farbe kodiert sind.
    6. Wenden Sie statistische Filter (Größe, Rundheit, Zirkularität usw.) in der Statistik-Registerkarte an, um Segmentierungsartefakte auszuschließen und/oder die segmentierten Zellen auf die Zelle von Interesse basierend auf ihrer Größe zu verfeinern (d. h. 20-200 m für Adipozyten; 5-25 m für Makrophagen; 1-3 m für Lymphozyten).
    7. Extrahieren Sie Messungen und quantitative Daten (Volumen, Anzahl, Größe, Durchmesser usw.) aus der Registerkarte Statistik.
  3. Segment zelluläre Komponenten (Kerne, Vesikel, etc.) oder Gefäße als Struktur.
    HINWEIS: Obwohl die Filamentsegmentierung sehr nützlich ist, um die Konnektivität der Gefäße zu untersuchen, verwenden wir die Segmentierung des Oberflächenmoduls, um Daten über Größe, Volumen und Durchmesser der Gefäße zu extrahieren. Tatsächlich geht die Quantifizierung der Größe der Gefäße bei Verwendung des Filamentmoduls verloren.
    1. Öffnen Sie das Surface-Modul der Software.
    2. Wählen Sie den Fluoreszenzkanal des Markers aus, der verwendet wird, um die subzelluläre Komponente speziell zu beschriften, um sie in 3D zu rekonstruieren.
    3. Richten Sie die Schwellenwerte ein und bieten Sie einen Bereich der erwarteten Durchmessergröße der Struktur (d. h. 0,5-5 m für Kerne; 0-100 m für Schiffe; usw.).
    4. Führen Sie die Segmentierung aus. Es wird ein Volume mit der segmentierten Zellstruktur generiert. Messungen und quantitative Daten (Volumen, Anzahl, Größe, Durchmesser usw.) können aus der Registerkarte Statistik extrahiert werden.
  4. Segmentieren Sie die Gefäße als Röhrenkontinuum.
    HINWEIS: Obwohl die Filamentsegmentierung sehr nützlich ist, um die Konnektivität der Gefäße zu untersuchen, verwenden wir die Segmentierung des Oberflächenmoduls, um Daten über Größe, Volumen und Durchmesser der Gefäße zu extrahieren. Tatsächlich geht die Quantifizierung der Größe der Gefäße bei Verwendung des Filamentmoduls verloren.
    1. Öffnen Sie das Filamentmodul der Software.
    2. Wählen Sie den Fluoreszenzkanal aus, der der Gefäßfärbung entspricht.
    3. Richten Sie die Schwellenwerte für die Fluoreszenzintensität ein, und wählen Sie die entsprechende Anzahl der erwarteten Verbindungsknoten aus.
    4. Führen Sie die Segmentierung aus. Filamente, die das Schiffsnetz darstellen, werden in 3D erzeugt. Die Messungen können aus der Registerkarte Statistik extrahiert werden, so dass quantitative Daten wie Schiffslänge, Anzahl der Verzweigung stäpohnen usw. erhalten werden können.

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Ergebnisse

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Mit dem hier beschriebenen und in Abbildung 1zusammengefassten Verfahren konnten wir weißes Fettgewebe von Mensch und Maus färben und optisch klarmachen, wie in Abbildung 2A bzw. Abbildung 2Bdargestellt. Das gereinigte Gewebe wurde in die metallische Bildgebungskammer übertragen, um eine konfokale Bildgebung durchzuführen (Abbildung 3A). Die Lichtung hat die Tiefe der Gewebebilder, die wir erfassen konn...

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Diskussion

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Die Veränderungen, die im Verlauf des pathologischen Verlaufs des Fettgewebes auftreten, wie die von Adipositas, sind für das Verständnis der Mechanismen hinter der Pathologie von grundlegender Bedeutung. Wegweisende Studien, die solche Mechanismen im Fettgewebe aufdeckten, basierten auf globalen Ansätzen wie der gesamten Fettgewebeproteomik21, der Durchflusszytometrie22,23und der Transkriptomik24,

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt von INSERM, Université Céte d'Azur, und durch Stipendien der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) über die Investitionen für die Zukunft Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), das Programm UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) über Academy 2 "Systémes Complexes" und Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Equipe FRM DEQ20180839587) und das Young Investigator Program to J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON ). Wir danken auch der Imaging Core Facility von C3M, die vom Conseil Départemental des Alpes-Maritimes und der Région PACA finanziert wird und die auch von der IBISA-Plattform für Mikroskopie und Bildgebungsplattform Céte d'Azur (MICA) unterstützt wird. Wir danken Marion Dussot für die technische Hilfe bei der Gewebeaufbereitung. Wir danken Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, für die beweissichere Lektüre des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,5 mL MikroröhrchenEppendorff Röhrchen - Dutscher33528
15 mL KunststoffröhrchenFalcon Röhrchen - Dutscher352096
18 mm Rundglas DeckglasMariendfeld0117580
20 mL GlasflascheWheaton986546
Anti-Maus-Alexa647-konjugierterAntikörper Jackson ImmunoResearch715-605-150Verdünnung: 1/100
anti-rabbit-alexa647-konjugierter AntikörperJackson ImmunoResearch711-605-152Verdünnung: 1/100
BSA Sigma-aldrichA6003
CD301-PE AntikörperBiolegendBLE145703Verdünnung: 1/100
CD31 AntikörperAbCamab215912Verdünnung: 1/50
Kommerzielle 3D-Analysesoftware - IMARISOxford Instrumentmit Zellmodul
Konfokales Mikroskop - Nikon A1RNikon
DapiThermoFisherD1306Stammkonzentration: 5 mg/mL; Verdünnung 1/1000
DesoxycholatSigma-aldrichD6750
DMSOSigma-aldrichD8418
Glut4 AntikörperSanta Cruzsc-53566Verdünnung: 1/50
GlycinSigma-aldrichG7126
Lectin-DyLight649Vector LabDL-1178-1Stammkonzentration : 2 µ g/µ L; IV-Injektion: 50 &Mikro; L/Mäuse
Metallische Bildgebungskammer mit Glasboden - AttoFluor KammerThermofisherA7816
MethylsalicylatSigma-aldrichM6752
Perilipin AntikörperProgen651156Verdünnung: 1/50
Phalloidin-alexa488ThermoFisherA12379Verdünnung: 1/100
TCR-β-PB AntikörperBiolegendBLE109225Verdünnung: 1/100
TH AntikörperAbCamab112Verdünnung: 1/50
Triton X100Sigma-aldrichX100
Tween-20Sigma-aldrichP416

Referenzen

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