Summary
通过循环排泄和补充 （CDR） 技术与免疫增异剂一起改进抗原抗体结合的动能，开发出一种超高速西方印迹技术。
Abstract
西方的污点（也称为免疫虫）是生物医学研究的规范方法。它通常用于确定特定蛋白质的相对大小和丰度以及转化后蛋白质的修饰。这种技术具有丰富的历史，由于其简单性，仍然被广泛使用。然而，西方的印迹程序著名的需要几个小时，甚至几天，完成，一个关键的瓶颈是长期的潜伏时间，限制其吞吐量。由于抗体从散装溶液缓慢扩散到膜上的固定抗原，因此需要这些培养步骤：膜附近的抗体浓度远远低于散装浓度。在这里，我们提出了一项创新，通过循环排空和补充抗体溶液 （CDR） 来改善抗原结合，从而显著缩短这些潜伏间隔。我们还利用了增强免疫力的技术来保持检测的灵敏度。CDR方法与商业免疫增强剂相结合，提高了输出信号，大大缩短了抗体潜伏时间。由此产生的超高速西部污点可以在20分钟内完成，而不会失去任何灵敏度。该方法可同时使用化学发光和荧光检测方法应用于西方污点。这种简单的协议使研究人员能够更好地探索许多样本中蛋白质表达的分析。
Introduction
西方的污点（也称为免疫虫）是一种强大而基本的技术，跨越广泛的科学和临床学科。该技术用于检查蛋白质1的存在、相对丰度、相对分子质量和转化后修饰。结合数字图像分析，该方法可以可靠地分析蛋白质的丰度和蛋白质的修饰2。虽然西方的污点是例行公事，但它是一种耗时和劳动密集型的方法。需要用膜长期培养抗体。在这里，我们描述了对孵化方法的修改，该方法克服了这一限制，而不会牺牲灵敏度。
在膜的孵化过程中，抗体漂浮在溶液中，而抗原则固定在膜上。由于其亲和力高，抗体与抗原结合的速度比抗体从散装溶液扩散到膜的速度要快。这会产生低浓度的"消耗层"（图 1）。较远的抗体可能需要数小时才能通过被动扩散到达膜，而被动扩散是导致该技术长期潜伏的主要因素。此效果称为大众运输限制 （MTL）3。有人提出，重复排空和补充含抗体溶液可能会破坏耗竭层，克服MTL4。在这里，我们设计了一种独特的技术，实现这种循环排水和补充 （CDR） 概念，以减少 MTL 在传统的西方印迹协议中的影响，并显著缩短所需的潜伏期。
为了在短的潜伏时间内保持检测灵敏度，我们采用了提高免疫力增强技术，加速抗原抗体反应，从而提高了信号噪声比5。许多市售的免疫增强剂 （IRE） 由 2 个组件组成（解决方案 1 和 2，见 材料表）。IRE的专有成分或作用机制尚未披露，但我们先前发现，IRE在固体相绑定检测中减少了抗原和抗体之间的分离常数，表明亲和力的增强至少部分地对IRE6的增强作用负有责任。CDR 与 IRE 的结合产生了一种超高速的西方印迹处理方案，可在不牺牲灵敏度的情况下缩短整个过程时间。
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Protocol
1. SDS-PAGE 并传输到 PVDF 膜
- 执行 SDS-PAGE，根据相对大小分离蛋白质。
注意：任何商业或自制凝胶系统都没问题。请遵守制造商的协议。 - 将分离的蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上。
注意：常见的转移方法（半干或湿转移）是合适的。请遵守制造商的协议。
2. 阻塞PVDF膜
- 在室温下搅拌时，将膜浸泡在适当的阻塞缓冲区中1小时。
注：根据主要抗体和检测系统，应选择适当的阻塞缓冲区。例如，最典型的阻滞剂是 BSA、脱脂干牛奶、箱蛋白和商用合成聚合物。PBS 和/或 TBS 与 0.1% Tween20 是最常用的缓冲区。此阻塞步骤可在 4 °C 下过夜完成。
3. 原发性抗体孵化
- 用蒸馏水准备10%的免疫反应增强剂-1溶液（IRE-1）。漩涡很好。
- 用 10% IRE-1 准备稀释的原发抗体。轻轻地和彻底地混合。
- 如果使用较大的膜（4 厘米 x 8 厘米 - 8 厘米 x 8 厘米），将 8 mL 的抗体溶液添加到 50 mL 圆锥形离心管中。如果使用较小的膜（2 厘米 x 8 厘米 - 4 厘米 x 8 厘米），将 3 mL 的抗体溶液添加到 14 mL 圆底聚丙烯管（材料表）中。
- 用钳子拾取PVDF膜，并短暂地排出阻塞溶液。用戴手套的手指将PVDF膜插入此管中，并确保整个膜粘附在管壁上。当PVDF膜插入管子时，面对最初与凝胶内侧接触的膜的"蛋白质侧"。紧紧地关上帽子。
- 将 50 mL 管插入混合烤箱的玻璃瓶中。
注：当 14 mL 管用于此孵化时，将 14 mL 管插入 50 mL 管中，使用一对塑料环架将内管保持在 50 mL 管的中心。 - 打开混合烤箱。
- 用 6 rpm 旋转孵化膜至少 5 分钟。
注意：确保膜始终粘附在墙壁上，并且（内部）管水平覆盖膜，均匀地覆盖抗体溶液。在实际实验之前校准抗体的稀释和潜伏时间。
4. 膜洗涤
- 停止旋转。
- 小心地用钳子从管子中取出PVDF膜，并将膜放入一个装有50 mL PBS-T的容器中。
- 用 PBS-T 短暂地冲洗膜。
- 用蒸馏水冲洗容器中的膜，直到没有气泡出现。这是为了去除大部分抗体。
- 将PVDF膜从容器转移到含有250 mL PBS-T的沙拉微调器。
- 将过滤器篮放入微调器中。确保盖子安全放置。
- 激活微调器并运行大约 20-30 s。
- 丢弃溶液，用蒸馏水短暂冲洗微调器内部。
- 再次将 250 mL 的 PBS-T 添加到微调器中。
- 重复步骤 4.6 和 4.7。
5. 与二次抗体一起孵育
- 用蒸馏水准备10%的免疫反应增强剂-2溶液（IRE-2）。漩涡很好。
- 用 10% IRE-2 准备稀释的次要抗体。轻轻地和彻底地混合。
- 选择第 3.3 步中注述的抗体溶液和管的体积。
- 用钳子拾取PVDF膜，并短暂地排干溶液。将 PVDF 膜插入第 3.4 步所述的管子中。
- 将 50 mL 管插入混合烤箱的玻璃瓶中。
- 打开混合烤箱。
- 用 6 rpm 旋转孵化膜至少 5 分钟。确保膜始终粘附在墙壁上，并且（内部）管水平，以便用抗体溶液均匀地覆盖膜。
注：在实际实验之前校准孵化时间。当次要抗体被荧光结合时，在黑暗中进行孵化。
6. 膜洗涤
- 按照步骤 4.1 到 4.10。
7. 图像采集
- 化学发光检测
- 将一块半移植柔性薄膜（10厘米×15厘米）放在平坦的表面上。
- 在 5 mL 管中混合化疗基板的 2 个组件。
- 立即将混合基板的1.5 mL转移到半移植柔性薄膜上，并将PVDF膜放在它身上。然后，将基板溶液的其余部分转移到膜上。
- 在半透明柔性薄膜上用混合基板孵化PVDF膜1分钟。
- 用钳子拾取PVDF膜，并短暂地排出基板溶液。
- 将膜夹在一对透明胶片之间。
- 在化学发光模式下获取图像。
- 荧光检测
- 用钳子拾取PVDF膜，并短暂地排干溶液。
- 将膜夹在一对透明胶片之间。
- 在荧光模式下获取图像。
注：步骤 7.1 和 7.2 应在成像机附近执行，以确保最大灵敏度。 - 当背景信号高时，在装有 80-100 mL PBS-T 的容器中执行洗涤步骤：10 分钟冲洗 3 次用于原发抗体，5 分钟冲洗 6 次用于次要抗体。
注：用10%IRE溶液稀释的原辅抗体可使用8-10次，而不会失去灵敏度6。解决方案应保持在4°C长达1个月。
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Representative Results
这个例子说明了CDR方法以及免疫增强技术对西方污点的有效性。静态孵化是在半透明的柔性薄膜上进行的，其中PVDF膜与抗体溶液一起孵育，而CDR孵化则通过含有膜和抗体溶液（电影）的旋转管在混合烤箱中。 图2 显示的抗原和抗体数量分别为西斑化学发光检测所必需的。在静态和 CDR 孵化中，使用 IRE 溶液提高了灵敏度：IRE 将检测 é actin 所需的最低细胞溶解物 （抗原） 数量从静态条件下的 2.2 μg 降至 1.1 μg，并使用 CDR （图 2A）将检测 é actin 所需的最低数量从 1.1μg 进一步降低到 0.275μg。同样，在静态条件下，抗 6x 他标签抗体的最小浓度从 100 ng/mL 降低到 50 ng/mL，在 CDR 条件下从 100 ng/mL 降低到 12.5 ng/mL（图 2B）。与静态潜伏相比，CDR 潜伏 5 分钟或 10 分钟显著降低了检测限制（60 分钟与初级，30 分钟与二次抗体）。最后，CDR 与 IRE 的结合揭示了即使在这个极短的潜伏期内，对西方污点（0.275 μg 的细胞赖酸用于 é actin 检测和 12.5 ng/mL 的抗 6x 他标签抗体）的超高灵敏度。
第二个例子展示了这种方法在带有荧光检测（图3）的西方污点上的成功应用。与化学发光检测相比，荧光检测具有独特的能力，能够同时检测同一污点上的多个目标，而无需剥离/重新探测抗体。（他的）使用双色荧光同时检测到细胞中标有AP和β-actin的6个。与 IRE 的 CDR 孵化不仅加速了检测速度，还提高了灵敏度，从而揭开了 （His）6 标记 AP （图3A）的降解。
图1：循环排水补充（CDR）方法的示意图。
（A） 当探针对抗原具有很高的亲和力，但通过溶液扩散的能力有限时，膜附近的耗竭层在静态条件下迅速形成。因此，探头到膜的传输成为速度限制步骤，长时间的潜伏时间弥补了大规模转移的限制。（B） CDR 方法通过旋转管，而膜粘附在墙壁上消除耗竭层，并补充相同的探针溶液，以保持膜附近的探头浓度恒定。这个数字已经从平桥等人修改了。请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：（A ）不同数量的293个细胞裂解物（8.8μg/lane的1：2序列稀释）由SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜，在PBS-T中用5%的脱脂牛奶阻断。该污点用小鼠抗*作用素抗体（1：3，000稀释）进行探测。（B） 从与 pAPTAG5 （GenHunter） 的 293 个细胞中提取的条件介质分离后，含有分泌的 （His）6标记碱性磷酸酶 （AP， 8 x 10- 14摩尔/车道）， 蛋白质被转移到 PVDF 膜。每个膜都受到不同浓度的抗 6x 他标签抗体（400 ng/mL 的 1：2 串行稀释）的西方污点。膜被图像为单个图像，虚线表示单个膜的边框。这个数字已经从平桥等人修改了。请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：使用荧光检测和CDR与 IRE 一起同时检测西方污点上的多个目标。
从293个与pAPTAG5转染的细胞中分离出不同数量的利酸盐（10μg/lane的1：2序列稀释），分离并转移到PVDF膜。在用阻断缓冲区进行荧光检测 （BFD） 1 小时后，用抗 6X His 标签和抗 é actin 抗体对污点进行了检测，随后是 IRDye 800CW 山羊反兔 Ig 和 IRDye 680RD 山羊反鼠标 Ig。答：在CDR条件下用10%IRE溶液稀释的抗体B：在静态条件下用含有0.1%Tween20的BFD稀释的抗体。由于 CDR 和 IRE 组合的灵敏度较高，因此看到了 （他的）6标记 AP 的退化。这个数字已经从平桥等人修改了。请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：与传统的静态方法相比，增强型和超高速 CDR 西部污点的示意图。
这个数字已经从平桥等人修改了。请点击这里查看此数字的较大版本。
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Discussion
西方污点是一种广泛使用的分析技术，用于检测40年前7、8年前开发的特定蛋白质。此后，该技术不断发展，随后的创新提高了技术2、9、10、11、12、13的灵敏度、速度和定量。此处介绍的增强型超高速西方印迹协议对现有技术进行了多次实质性改进。我们通过降低与 IRE 的检测阈值，在不牺牲灵敏度的情况下缩短孵化时间。无需特殊或昂贵的设备：在混合烤箱中旋转管子足以克服 MTL。关键创新是 CDR 有效地消除了检测中的耗竭层。虽然通常使用滚筒培养器来减少溶液的体积，但这种方法克服 MTL 和减少潜伏时间的潜力尚未说明。由于整个过程的总时间大幅缩短（图4），当阻塞的膜在一个人手中时，每天可以获得更多的西方污点数据，而传统的西方印迹协议几乎不可能做到这一点。需要注意的是，在摇动平台摇床上孵化膜相当于静态孵化4、6。用大量洗涤液在家庭商业沙拉微调器中冲洗PVDF膜也会缩短手术时间（图4）。
此协议的成功使用依赖于通过 IRE 溶液和潜伏时间优化抗体稀释。在检测开始时建议进行广泛的抗体滴定，因为 CDR 与 IRE 一起显著提高了灵敏度（图 2）。孵化时间是另一个需要考虑的因素。当一个人有良好的西方污点结果与1小时孵育与原抗体在静态条件下，潜伏时间可以减少到5-10分钟，在CDR条件下一般。例如，当需要用原发性抗体进行隔夜孵化时，应评估稍长的 CDR 潜伏时间（30 分钟 - 6 小时）。用次要抗体稀释和潜伏时间也是至关重要的。在 CDR 条件下大于 30 分钟的孵化通常具有较高的背景。因此，在长达30分钟的CDR孵化中，需要仔细滴定二次抗体。当背景信号高后，仔细滴定抗体，广泛的洗涤步骤（10分钟冲洗3次的主要抗体和5分钟冲洗6次，在一个容器与80-100毫秒的洗涤溶液）。
西方污点数据的质量通常取决于所使用的抗体。当我们有一个困难的抗体用于西方污点，蛋白质标记有时显示大量的信号，即使在仔细的抗体滴定和广泛的洗涤。由于我们注意到，与 IRE 的 CDR 方法倾向于增加非特定的绑定，在抗体 diluent 中添加阻塞试剂（如脱脂牛奶和其他）可能会提高信号噪声比14。这是一个耗时的筛选步骤，但值得一试。
西方的污点对于定量应用非常重要。半定量可通过化疗检测进行。这里提出的程序适用于剥离和重新探测到这一目的6。由于动态范围更广，荧光检测是最好的选择。通过此协议，荧光检测为定量分析提供了线性动态范围。值得一提的是，CDR荧光检测的潜伏时间似乎比化疗检测的时间长。
西方污点具有广泛的应用范围，仍然是研究蛋白质丰度、蛋白质-蛋白质相互作用和转化后修饰的通用方法。例如，抗碳水化合物抗体可以很容易地用于西污点与此协议14。由于病毒、细菌和富格斯外表面表达的各种碳水化合物是病原体特异性的，它们是识别和诊断传染病病原体的宝贵目标。因此，这种简单协议的应用可能会影响许多领域的研究，不仅会延长实验的等待时间，还会影响依赖西方印迹技术的临床免疫诊断。
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Disclosures
作者已宣布没有与本文内容直接相关的相互竞争的利益。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究院内脏研究司、国家心脏、肺和血液研究所的支持。S.H.得到日本公私合作学生出国留学计划的支持，H.N.和K.Y.获得Valor和V药物海外培训奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap | Falcon | 352059 | |
| Apollo Transparency Film for Laser Printers | N/A | N/A | Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine. |
| Azure Imaging System 600 | Azure Biosystems | Azure 600 | Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection. |
| Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution | TOYOBO | NKB-101 | |
| CARNATION Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | N/A | |
| ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep | GE Healthcare | NA9310V | |
| ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey | GE Healthcare | NA9340V | |
| HYBAID Micro-4 | N/A | N/A | Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position. |
| Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size | Millipore Sigma | IPVH304F0 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-68070 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LICOR | 926-32211 | |
| KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate | seracare | 5430-0049 | |
| Mouse anti-ß actin antibody | Millipore Sigma | A5316 | |
| Odyssey Blocking Buffer (PBS) | LICOR | 927-40100 | Blocking Buffer for fluorescent detection |
| OXO Salad Spinner | OXO | 32480V2B | Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear. |
| Parafilm Sealing Film | Bemis | Parafilm M PM996 | semi-transparent flexible film |
| Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube | N/A | N/A | Prepared in a machine shop |
| Rabbit anti-6X His tag antibody | Abcam | ab9108 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 |
References
- MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
- Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
- Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
- Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
- Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
- Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
- Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
- Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
- Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852 (2016).
- Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
- Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
- Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).
