Methodenartikel
Dieses Protokoll stellt einen Aderhautkeim-Assay dar, ein Ex-vivo-Modell der mikrovaskulären Proliferation. Dieser Test kann verwendet werden, um Wege zu bewerten, die an sich vermehrenden aderatorischen Mikrogefäßen beteiligt sind, und medikamentöse Behandlungen mit Wildtyp und genetisch verändertem Mausgewebe zu bewerten.
Die pathologische Aderhautangiogenese, ein markantes Merkmal der altersbedingten Makuladegeneration, führt zu Sehstörungen und Erblindung. Endotheliale Zell(E-Zell-Assays mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMECs) oder isolierten primären retinalen ECs sind weit verbreitet in vitro-Modelle zur Untersuchung der retinalen Angiogenese. Die Isolierung reiner muriner retinaler Endothelzellen ist jedoch technisch anspruchsvoll und netzhautförmige ECs können andere Proliferationsreaktionen haben als aderhautförmige Endothelzellen und verschiedene Zell-/Zell-Wechselwirkungen. Es wurde ein hochreproduzierbarer ex vivo aderhautspessender Assay als Modell der choroidalen mikrovaskulären Proliferation entwickelt. Dieses Modell umfasst die Wechselwirkung zwischen Derhautvaskulatur (EC, Makrophagen, Pericyten) und retinalem Pigmentepithel (RPE). Maus-RPE/Choroid/Skleralexplanten werden isoliert und in wachstumsfaktorreduziertem Basalmembranextrakt (BME) (Tag 0) inkubiert. Medium wird jeden zweiten Tag verändert und Die Aderhautsprossen wird an Tag 6 quantifiziert. Die Bilder einzelner Aderhautexplantationen werden mit einem invertierten Phasenmikroskop aufgenommen und der Keimbereich wird mit einem halbautomatischen Makro-Plug-in zur in diesem Labor entwickelten ImageJ-Software quantifiziert. Dieser reproduzierbare Ex-vivo-Chorsponnen-Sprossen-Assay kann verwendet werden, um Verbindungen für eine mögliche Behandlung und für die Forschung an mikrovaskulären Erkrankungen zu bewerten, um Wege zu bewerten, die an der Verbreitung von Aderhautmikrogefäßen mit Wildtyp und genetisch verändertem Mausgewebe beteiligt sind.
Die Dysregulation der Choroidalangiogenese ist mit der neovaskulären altersbedingten Makuladegeneration (AMD)1verbunden. Die Aderhaut ist ein mikrovaskuläres Bett unter dem retinalen Pigmentepithel (RPE). Es hat sich gezeigt, dass ein reduzierter Blutfluss in der Aderhaut mit der Progression von AMD2verbunden ist. Die komplizierte Beziehung zwischen vaskulärem Endothel, RPE, Makrophagen, Pericyten und anderen Zellen ist verantwortlich für die Homöostase des Gewebes3,4,5. Daher ist eine reproduzierbare Assaymodellierung der adera....
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Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Boston Children es Hospital genehmigt (ARCH-ProtokollNummer 19-04-3913R).
1. Vorbereitung
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Vergleich des Aderhautsprießens pro Tag
Wir sezierten die Aderhaut mit Sklera, eingebettet in BME und kultivierten sie für 6 Tage (Abbildung 1). Die Aderhautsprossen in C57BL/6J-Mäusen vom 3. bis 6. Tag wurden mit einem Mikroskop untersucht und mit SWIFT-Choroid, einer halbautomatischen Quantifizierungsmethode in ImageJ, quantifiziert. In einem repräsentativen Fall betrug der Aderhautsprossenbereich (die Gefäße, die sich von der Expflanze aus ausd.......
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Der choroidal sprossende Assay unterstützt die Forschung in neovaskulären AMD9,10,18,19,20. Aderhautexplantationen können sowohl von Mäusen als auch von Ratten und Menschen isoliert werden17,21. Die Aderhautexplantation umfasst ECs, Makrophagen und Pericyten17. In diesem Test hi.......
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Die Autoren haben keine finanziellen Angaben. Die computergestützte Methode steht akademischen Einrichtungen über die Autoren kostenlos zur Verfügung.
Die Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children es Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children es Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship, und Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; to BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| AnaSed (Xylazin) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basalmembranextrakt (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Zellkulturschale | NEST | 704001 | 10cm |
| Komplettes klassisches Medium mit Serum und CultureBoost | Zellsysteme | 4Z0-500 | |
| Ethylalkohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | Verwendung für 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Mikroskop | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/ml |
| Gewebekulturplatte (24-Well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamin) | AKORN | 59399-114-10 |
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