Methodenartikel

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

DOI:

10.3791/61680

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20. September 2020

 ,  ,  ,  , 
1GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Cancer Research, Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University, 4Department of Pharmacology and Chemical Biology, Baylor College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) ist eine Methode zur genauen Quantifizierung der Konzentrationen und Lokalisierung spezifischer RNAs auf Einzelzellebene. Hier berichten wir über unsere validierten Laborprotokolle für die Nasstischverarbeitung, Bildgebung und Bildanalyse zur Einzelzellquantifizierung spezifischer RNAs.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Gentranskription ist ein wesentlicher Prozess in der Zellbiologie und ermöglicht es Zellen, interne und externe Hinweise zu interpretieren und darauf zu reagieren. Herkömmliche Massenpopulationsmethoden (Northern Blot, PCR und RNAseq), die den mRNA-Spiegel messen, sind nicht in der Lage, Informationen über die Variation der Reaktionen zwischen Zellen zu liefern. Eine präzise Einzelzell- und allelische Visualisierung und Quantifizierung ist über die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) möglich. RNA-FISH wird durch Hybridisierung von Ziel-RNAs mit markierten Oligonukleotidsonden durchgeführt. Diese können in Modalitäten mit mittlerem /hohem Durchsatz abgebildet werden und liefern durch Bildanalyse-Pipelines quantitative Daten sowohl zu ausgereiften als auch zu entstehenden RNAs, alles auf Einzelzellenebene. Die Fixierungs-, Permeabilisierungs-, Hybridisierungs- und Bildgebungsschritte wurden im Labor über viele Jahre mit dem hier beschriebenen Modellsystem optimiert, was zu einer erfolgreichen und robusten Einzelzellanalyse der smFISH-Markierung führt. Das Hauptziel bei der Probenvorbereitung und -verarbeitung ist es, qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen, die sich durch ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis auszeichnen, um Fehlalarme zu reduzieren und genauere Daten bereitzustellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die Pipeline von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse in Verbindung mit Vorschlägen und Optimierungsschritten beschreibt, um sie auf bestimmte Proben zuzuschneiden.

Einleitung

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Gentranskription und -translation sind die beiden Hauptprozesse, die am zentralen Dogma der Biologie beteiligt sind und von der DNA-Sequenz über RNA bis hin zu Protein1reichen. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Produktion von Boten-RNA (mRNA) während der Transkription. Das entstehende RNA-Molekül umfasst sowohl nicht-kodierende Introns als auch kodierende Exons. Introns werden co-transkriptionell ausgespleißt, bevor sich die mRNA zur Translation auf die Ribosomen2,3in das Zytoplasma bewegt.

Traditionell wird die Messung von mRNA in Massenpopulationen von Zellen (Hunderte bis Millionen) mit klassischen Assays wie RT-qPCR oder Northern Blotting durchgeführt. Obwohl diese Methoden sehr leistungsfähig sind, sind sie begrenzt, da sie keine Einblicke in die Zell-zu-Zell-Variation (phänotypische Heterogenität), die Identifizierung der Anzahl der transkriptionell aktiven Allele und, was vielleicht noch wichtiger ist, den Mangel an räumlichen Informationen liefern. In jüngerer Zeit begannen genomweite Technologien, die eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung (RNAseq) ermöglichen, die Lücke zwischen bildgebenden Verfahren und Sequenzierung zu schließen4. RNAseq leidet jedoch unter relativ geringen Erkennungseffizienzen und die Verarbeitungsschritte führen zum vollständigen Verlust räumlicher Informationen5. Obwohl Einzelzell-RNAseq Einblicke in die phänotypische Heterogenität einer Population isogener Zellen liefern kann, kann die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) eine vollständigere Untersuchung der Zielgenexpression auf räumlicher Ebene und auf Allel-für-Allel-Basis ermöglichen6,7.

RNA FISH ist eine Technik, die den Nachweis und die Lokalisierung von Ziel-RNA-Molekülen in festen Zellen ermöglicht. Im Gegensatz zu früheren, mühsamen Methoden verwendet das derzeit hochmoderne RNA-FISH kommerziell verfügbare Nukleinsäuresonden, die die Ziel-RNA-Sequenzen ergänzen, und diese Sonden hybridisieren durch Watson-Crick-Basenpaarung8zu ihren Zielen. Die frühen In-situ-Hybridisierungstechniken beinhalteten ein ähnliches Protokoll, das 1969 von Gall und Pardue festgelegt wurde, als eine Probe mit Nukleinsäuresonden verarbeitet wurde, die spezifisch zu einer Ziel-RNA9hybridisiert wurden. Ursprünglich wurde der Assay mittels radioaktiver oder kolorimetrischer Detektion durchgeführt; In den 1980er Jahren eröffnete jedoch die Entwicklung von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsprotokollen (FISH) zu DNA FISH und später RNA FISH den Weg zu empfindlicheren Nachweisen und das Potenzial für multiplexing10,11.

Weiterentwicklungen in RNA FISH haben dazu geführt, dass einzelne RNA-Moleküle (smFISH) nachgewiesen und quantifiziert werdenkönnen 12,13. Der direkte Nachweis ist eine Methode, bei der die Sonden selbst mit Fluorophoren markiert werden. Eine Herausforderung bei smFISH besteht darin, dass genügend hybridisierende Sonden/ Target benötigt werden, um die Detektion von fluoreszierenden Signalen als ausgeprägte, beugungsbegrenzte Flecken zu erleichtern. Um dieses Problem zu lösen, kann man einen Sondensatz von kurzen einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden verwenden, die sich komplementär zu verschiedenen Regionen der Ziel-RNA8,12,14ergänzen. Die Bindung mehrerer Sonden erhöht die lokale Fluorophordichte, wodurch die RNA durch Fluoreszenzmikroskopie als eigenständiger, hochintensiver Spot sichtbar wird. Diese Methode ist vorteilhaft, da die Off-Target-Bindung von Oligonukleotiden im Sondensatzpool vom echten RNA-Spot-Signal unterschieden werden kann, indem die Spotgröße und -intensität quantitativ analysiert wird, um zwischen echter Signal- und falscher Oligonukleotidbindung zu unterscheiden, wodurch eine genauere Analyse durch Reduzierung von Fehlalarmen ermöglicht wird12.

Alternative Methoden zum Nachweis von mRNA sind die klassische BAC-klonbasierte Nick-Translation-Methode und das neu entwickelte verzweigte DNA-System. Bei der BAC-geklonten Nick-Translation-Methode wird die zu kennzeichnende DNA enzymatisch genickt und dem exponierten 3'-Ende wird ein neues Nukleotid hinzugefügt. Die Aktivität der DNA-Polymerase I fügt ein markiertes Nukleotid hinzu, was zu der gewünschtenSonde 15,16führt. Die verzweigte DNA-Technik beinhaltet Oligonukleotidsonden, die paarweise zu RNA-Zielen hybridisieren, und diese Sonden werden unter Verwendung mehrerer Signalverstärkungsmoleküle amplifiziert. Diese Methode kann das Signal-Rausch-Verhältnis erheblich verbessern, aber die Verstärkung kann die genaue Quantifizierung verzerren, da fluoreszierende Flecken in Größe und Intensität stark unterschiedlich sein können17.

Als Modellsystem für dieses Protokoll, das im Rahmen des NIEHS Superfund Research Program voll eingesetzt wird, um die Auswirkungen endokrin wirksamer Chemikalien in Galveston Bay / Houston Ship Channel zu quantifizieren, verwendeten wir die Östrogenrezeptor (ER) positive Brustkrebszelllinie MCF-7, die über Nacht mit einem ER-Agonisten, 17β-Estradiol (E2)7,18,19behandelt wurde. E2 reguliert viele ER-Target-Gene, darunter das prototypische ER-Target-Gen GREB17,20,21,22. Das hier beschriebene smFISH-Protokoll verwendet einen Satz von zwei spektral getrennten Sondensätzen, die auf GREB1 abzielen; eine, die zu Exons und die andere zu Introns hybridisiert, was die Messung sowohl von reifer als auch von naszierender RNA7ermöglicht. Wir verwenden dann Epifluoreszenzmikroskopie in Verbindung mit Dekonvolution, um smFISH-markierte Proben abbilden, und wenden dann Bildanalyseroutinen an, um die Anzahl der aktiven Allele und reifen RNAs pro Zelle zu quantifizieren.

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Protokoll

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Um optimale Ergebnisse zu gewährleisten, erfordert der Nasslaborteil dieses Protokolls standard-RNase-freie Vorsichtsmaßnahmen bei allen Schritten. Zum Beispiel wird die Verwendung von gefilterten Pipettenspitzen, sterilen Gefäßen und RNase-freien Puffern dringend empfohlen. Die Verwendung von RNase-Inhibitoren wie Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexen wird ebenfalls empfohlen, insbesondere für Ziel-RNAs mit geringer Häufigkeit.

1. Zellkultur und Versuchsaufbau

  1. Halten Sie adhärente MCF-7-Brustkrebszellen (ATCC #HTB-22) in einem T75-Gewebekulturkolben mit phenolrotfrei (nur für Hormonstimulationsexperimente erforderlich) Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1 nM Natriumpyruvat, 50 I.E./ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin.
  2. Säuregeätzte, poly-D-lysinbeschichtete runde Decklippen (0,16 bis 0,19 mm dick, 12 mm Durchmesser) in eine 24-Mehrwell-Gewebekulturplatte geben.
    HINWEIS: Verwenden Sie 1 M HCl, um die Deckschichten mit Säure zu ätzen und mit einer 1 mg / ml Lösung von Poly-D-Lysin zu beschichten, die in sterilem PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca++ und Mg++) gemäß Standardprotokollen rekonstituiert ist.
  3. Entfernen Sie die Wachstumsmedien aus den Zellen und waschen Sie sie einmal mit 5 mL sterilem PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohneCa++ undMg++). McF-7-Zellen mit 2-3 ml Trypsin-EDTA 0,25% iger Lösung lösen. Sobald sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie die Trypsin-EDTA 0,25% ige Lösung mit einem gleichen Volumen an Wachstumsmedien.
  4. Die Zellen in der Mediensuspension in ein 15 mL konisches Rohr geben, bei 391 x g für 1 Minute herunterdrehen, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie die Medien vorsichtig aus dem konischen Röhrchen, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen in einer angemessenen Menge an Behandlungsmedien.
    HINWEIS: Das Behandlungsmedium ist phenolrotfreies DMEM, ergänzt mit 5% Holzkohle-Dextran-gestreiften und dialysierten FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 nM Natriumpyruvat, 50 I.E./ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin. Dieses Medium ist für Steroidhormonstimulationsexperimente unerlässlich, da die Serumkomponente durch Holzkohleabisolierung der Medien weitgehend von Steroiden erschöpft ist und wachstumsfaktoren durch Dialyse reduziert hat.
  5. Säen Sie die Zellen auf Coverlips in der 24-Multiwell-Platte bei 60.000 bis 70.000 Zellen pro Vertiefung in 500 μL Behandlungsmedien. Für dieses Experiment sollte die Zellkonfluenz zu Beginn der Behandlung bei etwa 70-80% liegen. Optimieren Sie die Zellaussaatdichte in Abhängigkeit von Zelltyp, Wachstumsrate und Länge des Experiments, um Konfluenz zu vermeiden, was die Bildanalyse erschwert.
    HINWEIS: Für eine optimale Bildgebung und Bildanalyse vermeiden Sie Zellverklumpung. Zu diesem Zweck mischen Sie das Aliquot der Zellen gründlich, indem Sie die Zellen einige Male pipettieren (oder kurz vortexen), bevor Sie sie in die Vertiefungen dosieren. Bevor die plattierten Zellen wieder in den Inkubator gelegt werden, können die Zellen für etwa 20 Minuten in der Gewebekulturhaube absetzen, um die Zellverklumpung zu reduzieren.
  6. Inkubieren Sie die Zellen mindestens zwei Tage vor der Behandlung, um die Synchronisation des Zellzyklus und die Hintergrundreduktion aufgrund von Signalmolekülen, die im gestreiften / dialysierten Serum von Wachstumsmedien verbleiben, sicherzustellen.
  7. Nach einer 48-stündigen Inkubation in Behandlungsmedien behandeln Sie MCF-7-Zellen mit 10 nM 17β-Estradiol (E2) und Vehikelkontrolle (DMSO), die 24 Stunden lang in Behandlungsmedien verdünnt wurden. Diese Behandlung verwendet eine sättigende Dosis von E2, um eine maximale Reaktion zu induzieren. Führen Sie Zeitverlaufs- und Dosis-Wirkungs-Experimente durch, um die Bedingungen für verschiedene Zielgene, Zellmodelle und Behandlungstypen empirisch zu bestimmen. Als Beispiel sehen Sie unsere aktuelle Publikation7.

2. Vorbereitung von Puffern

  1. Zur Herstellung des Fixationspuffers wird gereinigtes, monomeres Formaldehyd (von Elektronenmikroskopie-Lieferanten als 16% Paraformaldehyd verkauft) auf 4% in sterilem PBSCa++/Mg++ (phosphatgepufferte Kochsalzlösung plusCa++ undMg++)verdünnt. Fügen Sie Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe (VRC) zum Fixationspuffer für eine Endkonzentration von 2 mM hinzu, um den RNA-Abbau zu verzögern.
    1. Berechnen Sie die Gesamtmenge des Fixationspuffers basierend auf dem Bedarf von 300-500 μL Fixiermittel pro Vertiefung einer 24-Multiwell-Platte. Lagern Sie das 4% Formaldehyd auf Eis, bis es im Fixierungsschritt erforderlich ist.
      HINWEIS: Machen Sie den Fixierungspuffer für jedes Experiment neu.
      ACHTUNG: Formaldehyd ist ein Teratogen, das über die Haut aufgenommen wird. Verwenden Sie diese Chemikalie in einem Abzug zusammen mit geeigneten PSA gemäß Ihren institutionellen Vorschriften.
  2. Für den Permeabilisierungsschritt bereiten Sie 70% Ethanol in nukleasefreiem Wasser vor. Eine alternative Option ist 0,5% Triton-X100 in sterilem PBS Ca++/ Mg++ plus 2 mM VRC. Berechnen Sie die Gesamtmenge des benötigten Permeabilisierungspuffers, indem Sie 500 μL Puffer pro Bohrstück verwenden.
  3. Um 9 mL des Hybridisierungspuffers vorzubereiten, fügen Sie 2 mL 50% Dextransulfat und 1 ml 20x SSC-Puffer (salzhaltiges Natriumcitrat) zu 6 ml nukleasefreiem Wasser hinzu. Vortex, um den Hybridisierungspuffer gründlich zu mischen. Dieser Puffer kann bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.
  4. Es gibt fünf separate Waschschritte, die einen 2x salzhaltigen Natriumcitratpuffer (SSC) erfordern. Berechnen Sie das endgültige Volumen des benötigten 2x SSC-Puffers, indem Sie 500 μL Puffer pro Abdecklappen und Waschschritt antizipieren. Verdünnen Sie die erforderliche Menge an Füllmaterial 20x SSC-Puffer in nukleasefreiem Wasser. 2 mM VRC kann als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme zu Waschschritten hinzugefügt werden. Dieser Puffer kann für die Dauer der Verarbeitungsschritte bei Raumtemperatur gelagert werden.

3. Fixierung für RNA FISH

  1. Nach der Behandlung das Medium aus den Vertiefungen nehmen und einmal mit sterilem, kaltem PBSCa++/Mg++waschen. Wenn ein Zellmodell mit geringer Adhärenz verwendet wird, verwenden Sie kein Vakuum, um Flüssigkeit anzusaugen. Verwenden Sie manuelles Pipettieren, um Medien vorsichtig von der Seite des Brunnens zu entfernen und den ersten Waschschritt zu unterlassen. Fügen Sie 500 μL Fixationspuffer für 30 Minuten auf Eis hinzu.
    HINWEIS: Wenn die Probe anfällig für RNA-Abbau ist, verwenden Sie steriles PBS mit 2 mM VRC für den Waschschritt an dieser Stelle.
  2. Entfernen Sie Fixiermittel und entsorgen Sie es in chemischen Abfällen gemäß den institutionellen Vorschriften. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem sterilem PBS Ca++/ Mg++ für 3 Minuten.
  3. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 500 μL 70% Ethanol zu jeder Vertiefung hinzu. Versiegeln Sie die 24-Well-Platte mit einer Paraffin-Kunststofffolie. Mindestens vier Stunden lang bei 4 °C auf einen Rotator legen. Es ist am besten, die Proben über Nacht in 70% Ethanol zu lassen. Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden und die Proben können bis zu einer Woche in 70% Ethanol gelagert werden.
    HINWEIS: Alternativ kann ein 0,5% Triton-X100 in PBS mit 2 mM VRC-Lösung verwendet werden. Inkubieren Sie die Proben in 500 μL dieses Permeabilisierungspuffers für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Bei Verwendung dieses Permeabilisierungspuffers kann das Protokoll an dieser Stelle nicht angehalten werden und muss den Hybridisierungsschritt durchlaufen.

4. Hybridisierung für RNA FISH

  1. Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer und waschen Sie ihn einmal in 500 μL 2x SSC-Puffer plus 10% Formamid für 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator.
  2. Bereiten Sie den vollständigen Hybridisierungspuffer vor. Berechnen Sie ca. 30 μL vollständigen Hybridisierungspuffer pro Coverslip. Fügen Sie Formamid zum Hybridisierungspuffer hinzu, um den erforderlichen Prozentsatz zu erreichen. Wenn beispielsweise 500 μL vollständiger Hybridisierungspuffer benötigt werden, dann würde er aus 450 μL des zuvor hergestellten Hybridisierungspuffers plus 50 μL molekularem Formamid bestehen, um 10% vol / vol zu erreichen. Vortex kurz zu mischen.
    ACHTUNG: Formamid ist ein Teratogen, das über die Haut aufgenommen wird. Verwenden Sie diese Chemikalie in einem Abzug zusammen mit geeigneten PSA gemäß den institutionellen Vorschriften.
  3. Verdünnen Sie die SONDEN GREB1 Intron (markiert mit Atto 647N) und GREB1 Exon (markiert mit Quasar 570) 1:300 im Hybridisierungspuffer. Mischen Sie durch Pipettieren. Schützen Sie diesen Puffer vor Licht und verwenden Sie ihn sofort.
    HINWEIS: Die Sonden wurden wie in Stossi et al7 beschriebenentworfen und hergestellt. Die Sonden werden in der Regel als getrockneter Oligonukleotid-Sondenpool bereitgestellt, der gemäß Herstellerprotokoll14in RNAse-freiem TE-Puffer rekonstituiert werden muss. Die Stammlösung für diese Sonden betrug daher 12,5 μM; die Arbeitskonzentration der Sonden beträgt 42 nM.
  4. Bereiten Sie eine Befeuchtungskammer für den Hybridisierungsschritt über Nacht vor. Legen Sie ein Stück Paraffin-Kunststofffolie, unbelichtet, mit der Seite nach oben in eine Glas-Petrischale, die mit einem Oberflächendekontaminationsmittel gereinigt wird, um RNases zu entfernen. Sättigen Sie zwei Papiertücher mit sterilem Wasser und legen Sie sie an den Rändern der Petrischale, um Feuchtigkeit zu spenden, da das Trocknen bestimmte Etiketten zerstören kann.
  5. Aliquotieren Sie die Sonden, indem Sie 30 μL Sonden im Hybridisierungspuffer auf die saubere Seite der Paraffin-Kunststofffolie punktieren. Verteilen Sie die Aliquoten der Sonden so, dass die Abdeckungsrutsche nicht miteinander in Berührung kommen.
  6. Drehen Sie mit einer sterilisierten Zette die Abdeckzellenseite vorsichtig auf die Sonden in der Glas-Petrischale. Vermeiden Sie Luftblasen und drücken Sie die Abdeckfolien nicht aus.
    HINWEIS: Entsorgen Sie die Gewebekulturplatte nicht mit dem 2x SSC-Puffer, da sie für nachfolgende Schritte benötigt wird.
  7. Versiegeln Sie die Glas-Petrischale mit Paraffin-Kunststofffolie und bedecken Sie die Platte mit Folie, um eine Lichteinwirkung gegenüber den Fluorophoren zu verhindern. Über Nacht bis zu 16 Stunden bei 37 °C auf einer flachen, nicht rotierenden Oberfläche inkubieren. Die Inkubationszeit kann empirisch variiert werden, es wird jedoch ein Minimum von 4 Stunden empfohlen.
    HINWEIS: Die Coverlips sind anfällig für das Rutschen beim Inkubieren im Hybridisierungspuffer, was zu trockenen Stellen auf dem Coverslip führen und die Probe beschädigen kann.

5. Proben für die Bildgebung vorbereiten

  1. Am nächsten Tag entfernen Sie die Abdeckungsrlips mit einer Zette aus der Befeuchtungskammer und bringen sie mit der Zellseite nach oben auf die 24-Well-Platte zurück. Fügen Sie 500 μL frischen 2x SSC-Puffer plus 10% Formamid hinzu, um überschüssige Sonde und unspezifische Hybridisierung auszuwaschen.
    HINWEIS: Schützen Sie die Proben ab diesem Zeitpunkt vor Licht.
  2. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 μL 2x SSC-Puffer plus 10% Formamid für jeweils 15 Minuten bei 37°C auf einem beheizten Rotator.
  3. Gegenfärbung von DNA mit DAPI bei 1 μg/ml in 2x SSC-Puffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator.
  4. Einmal mit 2x SSC-Puffer für 5 Minuten bei Raumtemperatur waschen.
  5. Montieren Sie die Abdeckrlips mit nicht härtenden Montagemedien auf Glasträger, nachdem Sie überschüssigen 2x SSC-Puffer mit einem Papiertuch und einem schnellen Waschen in nukleasefreiem Wasser entfernt haben, um überschüssige Salze zu entfernen. Zum Schluss die Abdecklippen mit klarem Nagellack versiegeln.

6. Hochauflösende Mikroskopie und Bildverarbeitung

  1. Stellen Sie die Proben auf einem Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop mit einem 60- oder 100-fachen Ölobjektiv und einer sCMOS-Kamera ab. Siehe die Materialtabelle für das spezifische Mikroskop und objektiv, das für dieses Experiment verwendet wurde.
    1. Vollständige Bildgebung, sobald die Proben vollständig verarbeitet sind, um eine zeitabhängige Verschlechterung des Signals zu vermeiden.
      HINWEIS: In diesem Experiment wird Tauchöl mit einem Brechungsindex (RI) von 1,516 verwendet. Empirische Tests sollten durchgeführt werden, um den Öl-RI bestimmten Proben zuzuordnen, da RI-Diskrepanzen zu Aberrationen der Punktspreizfunktion führen, die sich auf die Bilddekonvolution auswirken.
  2. Die Bilder werden mit einer seitlichen Pixelgröße von 0,10827 μm aufgenommen.
  3. Optimieren Sie die Beleuchtungsstärke der Lichtquelle (d. h. die prozentuale Durchlässigkeit) und die Belichtungszeiten für jeden Kanal (DAPI-, TRITC-, CY5-Filter in diesem speziellen Beispiel) mit der Probe, die voraussichtlich die höchste Intensität aufweist (d. h. positive Kontrollen). In diesem Experiment wird erwartet, dass die E2-behandelte Probe für beide GREB1-Sondensätze eine höhere Intensität aufweist. Im Allgemeinen beträgt die prozentuale Transmission für GREB1-Intron- und Exonsonden 50 – 100% und die Belichtungszeiten liegen zwischen 0,25 und 0,60 Sekunden.
  4. Darüber hinaus können Sie Bilder unter Bedingungen erfassen, die Photobleaching und/oder eine Sättigung der Kamerapixel vermeiden. Unserer Erfahrung nach sollte es einen mindestens zehnfachen Unterschied zwischen dem Hintergrund und der Signalintensität geben. Eine Sättigung von wenigen Pixeln/Feld kann aufgrund unspezifischer Signale in der Probe auftreten (z. B. Schmutz auf dem Coverlip, Sondenaggregate außerhalb der Zelle), was akzeptabel sein kann, aber nur, wenn gesättigte Bereiche nicht in die Quantifizierung einbezogen werden.
  5. Um die Erfassung eines Z-Stacks festzulegen, konzentrieren Sie sich auf das Sample im DAPI-Kanal. Wählen Sie die Ober- und Unterseite des Z-Stapels in den Abständen aus, in denen die DAPI-gefärbten Kerne unsauch werden. Die von uns verwendete z-Stack-Schrittgröße beträgt 0,25 μm pro Slice und der gesamte z-Stack sollte die gesamte Zelle umfassen (ca. 10 μm in MCF-7-Zellen). Die Z-Stack-Schrittgröße ändert sich jedoch je nach verwendetem Objektiv und sollte dem Nyquist-Stichprobenkriterium folgen.
    HINWEIS: Introns sind normalerweise nur im Kern vorhanden; Exons befinden sich jedoch sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma. Wenn Sie den Z-Stack wie oben beschrieben einstellen, erfasst er daher den größten Teil der Intron- und Exon-Markierung, da der Z-Stack die gesamte Zelle umfasst.
  6. Bilden Sie in der Regel mindestens 200 Zellen für die quantitative Analyse in vorläufigen Experimenten ab, um eine Momentaufnahme des Ausmaßes der Reaktion und Variation zwischen den Zellen zu erfassen.
  7. Einige abgebildete Zellen werden von der endgültigen Analyse ausgeschlossen (d. h. die Abbruchrate), da sie von der Analysepipeline herausgefiltert werden (d. h. Zellen, die den Rahmen des Bildes berühren, apoptotische/mitotische Zellen).
    HINWEIS: Bei der Auswahl von Bildbereichen sind einige Faktoren zu beachten. Wählen Sie Bereiche mit gleichmäßig verteilten, nicht überlappenden Zellen, wie sie durch DAPI-markierte Kernfluoreszenz definiert sind. Versuchen Sie außerdem, Bereiche auszuwählen, die die geringste Anzahl von Kernen entlang der Ränder des Bildbereichs aufweisen, um das Zählen von Teilzellen zu vermeiden. Automatisierte, unvoreingenommene Bildgebung wird immer für Experimente bevorzugt, die eine statistische Analyse erfordern.
  8. Devolvieren Sie bilder nach der Aufnahme mit einem aggressiven restaurativen Algorithmus mit 10 Zyklen (d. H. Anzahl der Iterationen). Generieren Sie Projektionen mit maximaler Intensität für die Bildanalyse (lassen Sie diesen Schritt weg, wenn eine spezifische 3D-Analyse erforderlich ist). Speichern Sie alle Projektionsbilder entsprechend der Bittiefe der verwendeten Kamera; in unserem Fall wurden 16-Bit-TIFF-Graustufenbilder gespeichert. RGB-Bilder haben eine reduzierte Bittiefe, was zu einem Informationsverlust führt. DAHER sind RGB-Bilder nicht für die Bildanalyse geeignet.

7. Bildanalyse

  1. Lesen Sie die Anleitung und laden Sie das Jupyter-Notebook von github herunter (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
  2. Installieren Sie die Python anaconda-Distribution (https://www.anaconda.com/distribution/) Version 3.6 oder höher.
  3. Öffnen Sie die Eingabeaufforderung anaconda und geben Sie den Installationsbefehl install simple ITK for anaconda ( https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk )ein.
  4. Öffnen Sie anaconda navigator und starten Sie jupyter notebook. Es öffnet sich ein Webbrowser mit Verzeichnissen und Dateien. Durchsuchen Sie die Verzeichnisstrukturen, um zu dem Verzeichnis zu gelangen, das das heruntergeladene Jupyter-Notebook von github enthält.
  5. Öffnen Sie das Notizbuch und führen Sie jede Zelle aus, indem Sie gleichzeitig die Umschalttaste und die Eingabetaste drücken.
  6. Befolgen Sie die Details der einzelnen Funktionen und Schritte im Notizbuch. Für einen anderen Satz von Bildern muss man möglicherweise einige Parameterwerte ändern.
    HINWEIS: Kurz gesagt, Kerne werden aus dem DAPI-Kanal mit lokalem Schwellenwert mit einer Blockgröße von 251 Pixeln segmentiert, Löcher wurden gefüllt und Objekte kleiner als 100 Pixel entfernt. Berührende Kerne wurden mit einem Wassereinzugsgebietsalgorithmus gespalten. Die Kernmaske wurde dann um 100 Pixel erweitert und die Wasserscheide wurde verwendet, um berührende Objekte mit Kernen als Becken zu trennen. Um Steady-State-RNA (Exons) zu identifizieren, wurde Otsu-Schwellenwerte verwendet; für transkriptionelle aktive Allele (Intron) wurde zunächst eine Gaußsche Unschärfe (Sigma=1) angewendet und dann die maximale Entropieschwelle verwendet.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um hormonelle Reaktionen über smFISH zu analysieren, haben wir beispielsweise das Östrogenrezeptormodell (ER) gewählt, das in Hochdurchsatztests verwendet wird, um das Vorhandensein endokrin wirksamer Chemikalien bei Umweltkatastrophen im Rahmen der Teilnahme am NIEHS Superfund Research Program7zu bestimmen. In diesem Experiment wurden adhärente MCF-7-Brustkrebszellen 24 Stunden lang mit dem ER-Agonisten 17β-Estradiol (E2, 10 nM) oder Vehikel (DMSO) behandelt. Spektral getrennte Sondensätze gegen ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die beschriebene smFISH-Methodik basiert auf den zuvor veröffentlichten Protokollen7,12,14. In diesem Protokoll erklären wir die kritischen Schritte, die vom Nasslabor (einschließlich Seeding-Dichte, Fixierungszeit, Permeabilisierung und Sondenkonzentration) bis hin zur Bildgebung und Bildanalyse optimiert wurden, um eine vollständige experimentelle Pipeline für Labore bereitzustellen, die an der Durchführung von Einzelzellanaly...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MAM, FS und MGM werden von NIEHS gefördert (Project 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM und PKS werden vom CPRIT-finanzierten GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719) unterstützt. Die Bildgebung wird auch vom Integrated Microscopy Core am Baylor College of Medicine mit Mitteln von NIH (DK56338 und CA125123), CPRIT (RP150578), dem Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center und dem John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
17Β EstradiolSigma-AldrichE2257CAS-Nummer 50-28-2
Ambion SSC (20X) Puffer, Rnase-freiThermoFisher ScientificAM9770
Corning DMEM mit L-Glutamin und 4,5 g/L GlukoseFisher ScientificMT10017CVHergestellt von Invitrogen
DAPISigma-AldrichD8417Ohne Natriumpyruvat
Dextran Sulfat, 50% Lösung sterilSigma-Aldrich3730-100ML
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung Ca++/Mg++Corning21030CVHergestellt von Calbiochem
Ethanol, 200 Proof (100%)Fisher Scientific07-678-005
Falcon 24-Well Klarer Flachboden TC-behandelte Multiwell-ZellkulturplatteCorning353047Hergestellt von Decon Laboratories
Fetal Rinderserum (FBS), 500 mLFisher Scientific50-753-2978Hergestellt von Gemini Bio Products
GE Healthcare DeltaVision LIVE Hochauflösendes DekonvolutionsmikroskopGE Healthcare
Hyclone Wasser, Molekularbiologie FisherScientificSH3053802
Immersionsöl 1.516GE Healthcare Life Sciences29162940Hergestellt von GE Gesundheitswesen Bio-Science
L-Glutamin-LösungFisher ScientificMT25005ClHergestellt von Corning
MCF-7 ZellenATCCHTB-22
Formamid in molekularer QualitätPromegaPAH5051
Olympus 60x/1.42 NA ObjektivOlympus
ParafilmBemis Company, Inc.52858-076Vertrieben von VWR
Paraformaldehyd, 16%ige Lösung, EM GradeElectron Microscopy Sciences15710
Penicilin-Streptomycin-LösungFisher ScientificMT3001ClHergestellt von Corning
Ribonukleosid-Vanadyl-KomplexVWR101229-716Hergestellt von New England Biosciences
RNase AwayAmbion9780
Natriumpyruvat, 100 mMFisher Scientific11-360-070Hergestellt von Gibco
Thermo Scientific Glass Deckgläser, #1.5Fisher Scientific12-545-81P
Triton X-100, 100 mLFisher ScientificBP151-100Hergestellt von Fisher BioReagents
Trypsin-EDTA Lösung 0,25%Sigma-AldrichT4049-500ML
Vectashield Antifade Eindeckmedium 10 mLFisher ScientificNC9265087Hergestellt von Vector Laboratories

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Russell, P. J. Gene Expression: Transcription. iGenetics: A Mendelian Approach. , Pearson Education, Inc. 331-352 (2006).
  2. Darnell, J. E. Variety in the level of gene control in eukaryotic cells. Nature. 297, 365-371 (1982).
  3. Köhler, A., Hurt, E. Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).
  4. Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).
  5. Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  6. Halpern, K. B., et al. Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver. Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).
  7. Stossi, F., et al. Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity. Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).
  8. Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).
  9. Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).
  10. Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).
  11. Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).
  12. Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
  13. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5, 877-879 (2008).
  14. Orjalo, A. V., Johansson, H. E. Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells. Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).
  15. Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization. Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).
  16. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future. Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  18. Stossi, F., et al. Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays. Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).
  19. Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis. PLoS One. 12, 1-19 (2017).
  20. Rae, J. M., et al. GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth. Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).
  21. Heldring, N., et al. Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets. Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).
  22. Hah, N., et al. A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells. Cell. 145, 622-634 (2011).
  23. Kadam, P., Bhalerao, S. Sample size calculation. International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).
  24. Kocanova, S., et al. Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization. PLoS Genetics. 6, (2010).
  25. Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH. PLoS One. 8, (2013).
  26. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Convergence. 4, (2017).
  27. Shieh, T. M., et al. Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
  28. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  29. Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. High dynamic range fluorescence imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).
  30. Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture. FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).
  31. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. , (2020).
  32. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).
  33. Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Reports. 46, 65-72 (2013).
  34. Sibarita, J. B. Deconvolution microscopy. Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).
  35. Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH. Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).
  36. Moffitt, J. R., Zhuang, X. RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH). Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).
  37. Shah, S., et al. Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH. Cell. 174, 363-376 (2018).
  38. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).
  39. Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nature Methods. 11, 360-361 (2014).
  40. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8, (2018).
  41. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  42. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).
  43. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59, 209-221 (2015).

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