Visualisierung von Replisom-Begegnungen mit einer Antigen-markierten blockierenden Läsion

Zusammenfassung

Während Replikationsgabelkollisionen mit DNA-Addukten Doppelstrangbrüche induzieren können, ist über die Interaktion zwischen Replisomen und blockierenden Läsionen weniger bekannt. Wir haben den Proximity-Ligations-Assay verwendet, um diese Begegnungen zu visualisieren und die Konsequenzen für die Replisomenzusammensetzung zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Es gibt einen beträchtlichen Einblick in die zelluläre Reaktion auf Doppelstrangbrüche (DSBs), die durch Nukleasen, Strahlung und andere DNA-Brecher induziert werden. Dies spiegelt zum Teil die Verfügbarkeit von Methoden zur Identifizierung von Bruchstellen und zur Charakterisierung von Faktoren wider, die an diesen Sequenzen an DSBs rekrutiert werden. DSBs treten jedoch auch als Zwischenprodukte bei der Verarbeitung von DNA-Addukten auf, die von Verbindungen gebildet werden, die keine direkten Brüche verursachen und nicht an bestimmten Sequenzstellen reagieren. Folglich sind für die meisten dieser Wirkstoffe Technologien, die die Analyse von Bindungsinteraktionen mit Reaktionsfaktoren und Reparaturproteinen ermöglichen, unbekannt. Zum Beispiel können DNA-Interstrangvernetzungen (ICLs) Brüche nach Begegnungen mit Replikationsgabeln hervorrufen. Obwohl sie aus Medikamenten bestehen, die häufig als Chemotherapeutika für Krebs verwendet werden, gibt es bisher keine Methodik zur Überwachung ihrer Wechselwirkungen mit Replikationsproteinen.

In dieser Arbeit beschreiben wir unsere Strategie, um die zelluläre Reaktion auf Gabelkollisionen mit diesen herausfordernden Addukten zu verfolgen. Wir haben ein Steroidantigen mit Psoralen verknüpft, das Photoaktivierungs-abhängige ICLs in Zellkernen lebender Zellen bildet. Die ICLs wurden mittels Immunfluoreszenz gegen den Antigen-Tag sichtbar gemacht. Der Tag kann auch ein Partner im Proximity-Ligation-Assay (PLA) sein, der die enge Assoziation zweier Antigene meldet. Die PLA wurde ausgenutzt, um Proteine, die eng mit den markierten ICLs assoziiert waren, von solchen zu unterscheiden, die dies nicht waren. Es war möglich, Replisome-Proteine zu definieren, die nach Begegnungen mit ICLs zurückblieben, und andere, die verloren gingen, zu identifizieren. Dieser Ansatz ist auf jede Struktur oder jedes DNA-Addukt anwendbar, das immunologisch nachgewiesen werden kann.

Einleitung

Die zelluläre Reaktion auf Doppelstrangbrüche ist dank einer Reihe von immer leistungsfähigeren Methoden zur Lenkung von Brüchen an bestimmte genomische Stellen gut dokumentiert ^1,2,3. Die Lokalisationssicherheit ermöglicht eine eindeutige Charakterisierung von Proteinen und anderen Faktoren, die sich an der Stelle ansammeln und an der DNA-Schadensantwort (DDR) beteiligt sind, wodurch die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) und die homologe Rekombination (HR) angesteuert werden, die Brüche reparieren. Natürlich werden viele Brüche durch Agenzien wie Strahlung und chemische Spezies verursacht, die bestimmte Sequenzen nicht angreifen⁴. Für diese stehen jedoch Verfahren zur Verfügung, mit denen die Enden in Strukturen umgewandelt werden können, die für das Tagging und die Lokalisierung geeignet^{sind 5,6}. Brüche werden auch durch biologische Prozesse, wie z. B. die Umlagerung von Immunglobulinen, eingeführt, und neuere Technologien ermöglichen ihre Lokalisierung sowie⁷. Die Beziehung zwischen den reagierenden Faktoren und diesen Stellen kann dann bestimmt werden.

Brüche treten auch als indirekte Folge von Addukten auf, die von Verbindungen gebildet werden, die keine inhärenten Brecher sind, aber DNA-Transaktionen wie Transkription und Replikation stören. Sie können als Merkmal der zellulären Reaktion auf diese Obstruktionen gebildet werden, vielleicht während der Reparatur oder weil sie eine Struktur provozieren, die anfällig für Nukleaseangriffe ist. Typischerweise ist die physikalische Beziehung zwischen dem Addukt, dem Bruch und der Assoziation mit antwortenden Faktoren inferenzlich. Zum Beispiel werden ICLs durch Chemotherapeutika wie Cisplatin und Mitomycin^C8 und als Reaktionsprodukt von abasischen Stellen⁹ gebildet. ICLs sind als potente Blöcke für Replikationsgabeln¹⁰ bekannt, wodurch Gabeln, die durch Nukleasen¹¹ gespalten werden können, blockiert werden. Die kovalente Bindung zwischen den Strängen wird oft durch Signalwege erleichtert, die obligate Brüche als Zwischenprodukte^{aufweisen 12,13}, was eine homologe Rekombination erfordert^, um die Replikationsgabel ¹⁴ wieder aufzubauen. In den meisten Experimenten verfolgt der Forscher die Reaktion von interessierenden Faktoren auf die Brüche, die stromabwärts der Kollision einer Replikationsgabel mit einer ICL gebildet werden. Da es jedoch keine Technologie zur Lokalisierung einer provokativen Läsion gibt, kann die Nähe des Replisoms und seiner Bestandteile zum ICL nur vermutet werden.

Wir haben eine Strategie entwickelt, die die Analyse von Proteinassoziationen mit nicht-sequenzspezifischen kovalenten Addukten ermöglicht, die hier anhand von ICLs dargestellt werden. In unser System werden diese durch Psoralen eingeführt, ein photoaktives Naturprodukt, das seit Tausenden von Jahren als Therapeutikum bei Hauterkrankungen verwendet^{wird 15}. Unser Ansatz basiert auf zwei wichtigen Merkmalen von Psoralens. Die erste ist ihre hohe Frequenz der Vernetzungsbildung, die 90 % der Addukte überschreiten kann, im Gegensatz zu den weniger als 10 %, die von beliebten Verbindungen wie Cisplatin oder Mitomycin C ^8,16 gebildet werden. Die zweite ist die Zugänglichkeit der Verbindung zur Konjugation ohne Verlust der Vernetzungskapazität. Wir haben Trimethylpsoralen kovalent mit Digoxigenin (Dig), einem seit langem etablierten Immuntag, verknüpft. Dies ermöglicht den Nachweis der Psoralen-Addukte in genomischer DNA durch Immunfärbung des Dig-Tags und die Visualisierung durch konventionelle Immunfluoreszenz¹⁷.

Dieses Reagenz wurde in unserer früheren Arbeit zur Analyse von Replikationsgabelbegegnungen mit ICLs unter Verwendung eines DNA-Faser-basierten Assays eingesetzt¹⁶. In dieser Arbeit fanden wir heraus, dass die Replikation über eine intakte ICL hinaus fortgesetzt werden kann. Dies war abhängig von der ATR-Kinase, die durch Replikationsstress aktiviert wird. Der Neustart der Replikation war angesichts der Struktur der replikativen CMG-Helikase unerwartet. Dieser besteht aus dem MCM-Hetero-Hexamer (M), das einen versetzten Gap-Ring um den Templat-Strang für die Leitstrangsynthese bildet, der von den Proteinen des GINS-Komplexes (G, bestehend aus PSF1, 2, 3 und SLD5) und CDC45 (C)¹⁸ eingeschlossen wird. Der Vorschlag, dass die Replikation auf der Seite der ICL distal zur Seite der Replisomkollision neu gestartet werden könnte, sprach für eine Änderung der Struktur des Replisoms. Um der Frage nachzugehen, welche Komponenten zum Zeitpunkt der Begegnung mit einer ICL im Replikom waren, haben wir den hier beschriebenen Ansatz entwickelt. Wir nutzten den Dig-Tag als Partner in Proximity-Ligation-Assays (PLA)¹⁹ , um die enge Assoziation der ICL mit Proteinen des Replisoms²⁰ zu untersuchen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen

1. Tag 1
   1. 35-mm-Kulturschalen mit Glasboden mit einer Zellkleberlösung vorbehandeln.
   2. Legen Sie die Zellen einen Tag vor der Behandlung in die vorbehandelten Schalen. Die Zelle sollte sich am Tag des Experiments aktiv teilen und zu 50–70 % konfluent sein.
      HINWEIS: HeLa-Zellen wurden in diesem Experiment mit Dulbecco Modified Eagle Medium DMEM verwendet, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 1x Penicillin / Streptomycin. Es gibt keine Beschränkung für adhärente Zelllinien. Nicht-adhärente Zellen müssen jedoch vor der Analyse mittels PLA auf Objektträger zentrifugiert und fixiert werden.
2. Tag 2
   1. Herstellen einer Stammlösung von Digoxigenintrimethylpsoralen (Dig-TMP) durch Resuspendierung eines gefrorenen Aliquots von zuvor synthetisiertem Dig-TMP in 1:1 EtOH:_H2O. Bestimmung der Konzentration durch Messung von OD bei 250 nm einer 100-fachen Verdünnung (in_H2O) des gelösten Dig-TMP. Der Extinktionskoeffizient von Dig-TMP beträgt 25.000. Überprüfen Sie die Konzentration, indem Sie vor jedem Gebrauch OD bei 250 nm messen und die Stammkonzentration berechnen: Abs x 100 x 10⁶/25.000 = Konzentration (in μM). Im Allgemeinen beträgt die Stammlösung etwa 3 mM. Die Lösung kann bei –20 °C etwa einen Monat gelagert werden.
      HINWEIS: Dig-TMP muss im Voraus chemisch synthetisiert werden, wobei das hier beschriebene Verfahren befolgt wird. Rückfluss 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen mit 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amin in Toluol unter Stickstoff für 12 h. Entfernen Sie das Lösungsmittel und gewinnen Sie das 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)]aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen-Produkt durch Kieselgelchromatographie zurück. Das Produkt wird mit Digoxigenin-NHS-Ester in Dimethylformamid und Triethylamin bei 50 °C für 18 h konjugiert. Entfernen Sie das Lösungsmittel und reinigen Sie den Rückstand durch präparative Dünnschicht-Kieselgelchromatographie. Elute die Produktbande Chloroform: Methanol: 28%iges Ammoniumhydroxid (8:1:0,1)-Gemisch. Verdampfen Sie die Lösungsmittel und lösen Sie das Pellet in 50% EtOH:_H2Oauf.
   2. Dig-TMP-Stamm in 50 % EtOH:_H2Obis zu einer Endkonzentration von 5 μM in das Zellkulturmedium geben und das Medium auf 37 °C bringen. Saugen Sie das Medium von den Platten ab, fügen Sie das vorgewärmte Dig-TMP-haltige Medium hinzu und legen Sie die Platten für 30 Minuten in einen Inkubator (37 °C, 5 %_{CO 2}), damit das Dig-TMP ausgleichen kann.
   3. Während der Inkubation der Zellen wird die UV-Box (siehe Materialtabelle) auf 37 °C vorgewärmt.
   4. Legen Sie die Platten in die vorgewärmte UV-Box und setzen Sie die Zellen für dieses Experiment 5 Minuten lang einer Dosis von 3 J/^cm2 UVA-Licht aus. Die Platten wurden während der Bestrahlung auf einen Thermoblock gelegt, der bei 37 °C gehalten wurde. Berechnen Sie die Zeit mit der Formel:
      
   5. Saugen Sie das Medium mit einer Pipette an, geben Sie frisches, vorgewärmtes Medium hinzu und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator bei 37 °C, 5% CO₂ für 1 h.
   6. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie das Geschirr einmal vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
   7. Entfernen Sie PBS und fügen Sie 0,1 % Formaldehyd (FA) für 5 Minuten bei Raumtemperatur (RT) in PBS hinzu. Dadurch wird verhindert, dass sich die Zellen während der Vorbehandlung mit CSK-R (Cytoskeleton extraction buffer containing RNase, beschrieben in 1.2.9) ablösen, die zur Extraktion der zytoplasmatischen Elemente und zur Reduzierung des PLA-Hintergrunds erforderlich ist.
   8. FA absaugen und einmal mit PBS spülen.
   9. CSK-R-Puffer zugeben und 5 min bei RT inkubieren, um Zytoplasma zu entfernen [CSK-R-Puffer: 10 mM PIPES, pH 7,0, 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 3 mM MgCl₂, 0,5%Triton X-100, 300 μg/mL RNase A]. Den Puffer absaugen, frisches CSK-R hinzufügen und 5 Minuten bei RT inkubieren.
      HINWEIS: Ein Vorrat an CSK-Puffer kann bei 4 °C gelagert und Triton X und RNaseA direkt vor der Verwendung hinzugefügt werden.
   10. Dreimal mit PBS waschen.
   11. Zellen mit 4% Formaldehyd in PBS für 10 min bei RT fixieren.
   12. Waschen Sie die Zellen mit PBS. Führen Sie diesen Schritt dreimal aus.
   13. 100%iges Methanol kalt zugeben und 20 min bei -20 °C inkubieren.
   14. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen in PBS in einer feuchten Kammer bei 4 °C bis zu einer Woche gelagert werden.
   15. Die Zellen werden in 80 μl 5 mM TritonX-100 für 10 min bei 4 °C inkubiert.
   16. Inkubieren Sie Zellen mit 100 μl 5 mM EDTA in PBS, ergänzt mit 1 μl 100 mg/ml RNase A, für 30 min bei 37 °C.
   17. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
   18. Lagern Sie die Zellen in Blockierpuffer (5 % BSA und 10 % Ziegenserum in PBS) über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer.

2. Proximity-Ligations-Assay

HINWEIS: Führen Sie an Tag 3 einen Proximity-Ligationstest durch.

1. Antikörper-Färbung
   1. Bereiten Sie 40 μl der primären Antikörperlösung pro Platte vor: Geben Sie das entsprechende Volumen der primären Antikörper hinzu, um die gewünschte Verdünnung zu erreichen (Maus-Anti-Digoxigenin und Kaninchen-Antikörper gegen eine Replisomkomponente wie MCM5, CDC45, PSF1 oder pMCM2, Verdünnungen, die in der Materialtabelle angegeben sind) in den Blockierungspuffer (um ein Endvolumen von 24 μl zu erreichen). Mischen Sie durch Klopfen und lassen Sie es 20 Minuten bei RT stehen. Bereiten Sie eine Mastermischung für mehrere Proben vor und mischen Sie durch Klopfen, bevor Sie sie auf die Vertiefungen auftragen.
   2. Geben Sie 40 μl primäre Antikörperlösung in die Mitte der Vertiefung und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C in einer feuchten Kammer. Lassen Sie die PLA-Sonden und den Blockierpuffer während des Färbens auf Raumtemperatur erwärmen.
   3. Waschen Sie die Zellen mit PBS-T [PBS-T: 0,05% Tween-20 in 1X PBS] bei RT. Führen Sie diesen Schritt dreimal durch.
   4. Bereiten Sie während des Waschens 40 μl PLA-Sondenlösung pro Schale vor (PLA-Sonden bestehen aus einem sekundären Antikörper, der entweder Kaninchen- oder Maus-IgG erkennt und kovalent mit einem PLUS- oder MINUS-Oligonukleotid verknüpft ist): 8 μl PLA-Sonde Anti-Maus-PLUS + 8 μl PLA-Sonden-Anti-Kaninchen-MINUS-Antikörper + 24 μl Blockierungspuffer. Mischen Sie es und lassen Sie es 20 Minuten bei RT stehen. Bereiten Sie eine Mastermischung für mehrere Proben vor und mischen Sie sie gut, bevor Sie sie auf die Vertiefungen auftragen. Legen Sie die Lösung in die Mitte der Vertiefung in den Teller.
   5. Entfernen Sie die letzte Wäsche, geben Sie 40 μl PLA-Sondenlösung in die Mitte der Vertiefung und inkubieren Sie sie 1 h lang bei 37 °C in einer feuchten Kammer.
   6. Im Puffer A dreimal für jeweils 10 min auf einer Kippplattform bei RT waschen. Bringen Sie die Ligaturmischung während des Waschens auf RT.
2. Ligation und Amplifikation
   1. Bereiten Sie 40 μl Ligationsmischung pro Platte vor: 8 μl (5x) Ligationsmaterial + 31 μl destilliertes Wasser + 1 μl Ligase. Bereiten Sie die Mastermischung für mehrere Platten vor und mischen Sie sie gut, bevor Sie sie auf die Vertiefungen auftragen.
   2. Geben Sie 40 μl Ligationslösung in jede Platte und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in einer feuchten Kammer bei 37 °C.
   3. Zellen 3x mit Puffer A für je 2 min auf einer Kippplattform bei RT waschen.
   4. Bereiten Sie 40 μl Amplifikationslösung pro Schale vor: 8 μl (5x) Amplifikationsmaterial + 31,5 μl destilliertes Wasser + 0,5 μl DNA-Polymerase. Bereiten Sie eine Mastermischung für mehrere Proben vor und mischen Sie sie gut, bevor Sie sie auf die Vertiefungen auftragen.
   5. Geben Sie 40 μl Amplifikationslösung in jede Platte und inkubieren Sie sie 100 Minuten lang in einer feuchten Kammer bei 37 °C.
   6. Die Amplifikationslösung absaugen und mit Puffer B waschen. Führen Sie 6 Waschgänge für jeweils 10 Minuten auf einer kippbaren Plattform bei RT durch.
   7. Einmal mit 0,01x Puffer B für 1 min bei RT waschen.
   8. Aspirieren Sie Puffer B und inkubieren Sie Platten mit sekundären Antikörpern, Alexa Fluor 488 Anti-Maus-IgG und Alexa Fluor 568 Anti-Kaninchen-IgG in Blockierlösung bei geeigneten Verdünnungen im Blockierungspuffer in einer feuchten Kammer für 30 min bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C.
   9. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS-T, jeweils 10 Minuten lang auf einer Kippplattform bei RT.
   10. PBS-T ansaugen und mit DAPI in Eindeckmedium einbauen. Die gemounteten Platten können sofort abgebildet oder vor der Bildgebung bei 4 °C im Dunkeln für nicht länger als 4 Tage gelagert werden.

3. Bildgebung und Quantifizierung

1. Führen Sie die Bildgebung in einem epifluoreszierenden oder konfokalen Mikroskop durch (wenn eine 3D-Bildgebung wünschenswert ist, decken Sie mindestens 3 μm in 15 Stapeln ab). Führen Sie Experimente in dreifacher Ausführung durch und bilden Sie eine ausreichende Anzahl von Feldern ab, um mindestens 100 Beobachtungen pro Probe oder Bedingung durchzuführen. Bilde alle Halbbilder und Proben, einschließlich der Bedienelemente, mit den gleichen Belichtungseinstellungen.
2. Quantifizieren Sie mit einer geeigneten Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle für Open-Source- und kommerzielle Software, die diese Analyse in einzelnen oder mehreren ebenen Bildern durchführen kann).
   1. Segmentieren Sie Zellkerne basierend auf der DAPI-Färbung. Führen Sie die Detektion von nuklearen PLA-Punkten durch. Ordnen Sie die PLA-Punkte dem entsprechenden Kern zu. Exportieren Sie PLA-Punkte pro Kernergebnisse als csv-Datei (siehe Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2).
3. Statistische Analyse (siehe Materialtabelle für vorgeschlagene Open-Source- und kommerzielle Software).
   1. Überprüfen Sie mit einem Shapiro-Wilk-Test, ob die Stichproben einer Normalverteilung folgen.
   2. Bestimmen Sie, ob es einen signifikanten Unterschied zwischen zwei Stichproben gibt, indem Sie einen Student-t-Test (wenn die Normalverteilungsannahme erfüllt ist) oder einen Wilcoxon-Rangsummentest (wenn die Normalverteilungsannahme für eine Stichprobe verletzt wird) verwenden.
4. Datenvisualisierung: Generieren Sie Punktdiagramme in Kombination mit Boxplots, um die Datenverteilung, den Median (Q₂),^{das 25.} (Q₁) und das 75. Perzentil für die verschiedenen Stichproben zu visualisieren (siehe Materialtabelle für vorgeschlagene Open-Source- und kommerzielle Software).

4.3D Darstellung von pMCM2: ICL-Wechselwirkungen

1. Bildgeben Sie PLA-Platten auf einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop mit einem Plan Fluor 60x/1,25 Ölobjektiv mit numerischer Apertur. Erfassen Sie 16 Stapel mit einer Fläche von 1,6 mm und erstellen Sie die 3D-Rekonstruktion mit der entsprechenden Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

PLA von Dig-TMP mit Replisomproteinen
Der Aufbau des Dig-TMP ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Details der Synthese, bei der Trimethylpsoralen durch einen Glykollinker an Digoxigenin konjugiert wurde, wurden bereits diskutiert^17,21. Die Inkubation von Zellen mit der Verbindung und anschließende Bestrahlung mit 365 nm Licht (UVA) photoaktiviert die Verbindung und treibt die Vernetzungsreaktion an. Etwas mehr als ...

Diskussion

Obwohl die PLA eine sehr leistungsfähige Technik ist, gibt es technische Bedenken, die gelöst werden müssen, um klare und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Die Antikörper müssen eine hohe Affinität und Spezifität aufweisen. Darüber hinaus ist es wichtig, die unspezifischen Hintergrundsignale so weit wie möglich zu reduzieren. Wir haben festgestellt, dass Membranen und Zelltrümmer zum Hintergrund beitragen, und wir haben sie so weit wie möglich entfernt. Das Waschen mit Waschmittel, das Puffer enthält, vor dem Fixie...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alexa Fluor 568, Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper	Invitrogen	A-10011	1 von 1000
35 mm Platten mit Glas 1,5 Deckglas	MatTek	P35-1.5-14-C	Mikrotiterschalen mit Glasboden 35mm Petrischale-Mikrotiterplatte
Alexa Fluor 488, Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper	Invitrogen	A-10001	1 zu 1000
Rinderserum Albumin (BSA)	SeraCare	1900-0012	Blockierungslösung, Reagenzien müssen bei 4 & Grad gelagert werden; C
CDC45 Antikörper (Kaninchen)	Abcam	ab126762	1 zu 200
Zellklebstoff	Life Science	354240	für Zell-TAK-Lösung
Konfokales Mikroskop	Nikkon	Nikon TE2000 Spinning-Disk-Mikroskop	ausgestattet mit Volocity-Software
Digoxigenin (Dig) Antikörper (Maus)	Abcam	ab420	1 zu 200
Dig-TMP	synthetisiert in der Seidman Lab
Duolink Amplifikationsreagenzien (5&fach;)	Sigma-Aldrich	DUO82010	Reagenzien müssen bei -20 & Grad gelagert werden; C
Duolink In-situ-Detektionsreagenzien	Sigma-Aldrich	DUO92007	Reagenzien müssen bei -20 & Grad gelagert werden; C
Duolink in situ Oligonukleotid-PLA-Sonde MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004	Anti-Maus-MINUS, Reagenzien müssen bei 4 & deg gelagert werden; C
Duolink in situ Oligonukleotid-PLA-Sonde PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	Anti-Kaninchen-PLUS, Reagenzien müssen bei 4 & deg gelagert werden; C
Duolink In-situ-Waschpuffer A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink Waschpuffer, Reagenzien müssen bei 4 Grad gelagert werden; C
Duolink In-situ-Waschpuffer B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink Waschpuffer, Reagenzien müssen bei 4 Grad gelagert werden; C
Epifluoreszenzmikroskop	Zeiss	Axiovert 200M Mikroskop	Ausgestattet mit den Axio Vision Softwarepaketen (Zeiss, Deutschland)
Formaldehyd 16%	Fisher Scientific	PI28906	für Fixlösung
Ziegenserum	Thermo	31873	Blockierungslösung, Reagenzien müssen bei 4 & Grad gelagert werden; C
Bildanalysesoftware	Open Source	Cell Profiler	funktioniert für die Analyse von Einzelebenenbildern
Bildanalyse-Softwarelizenz erforderlich	Bitplane	Imaris	Cell Biology Modul erforderlich. Kann PLA-Punkte/-Kerne in Bildstapeln (3D) quantifizieren und 3D-Rekonstruktionen durchführen
Ligase (1 Einheit/μ l)	Sigma-Aldrich	DUO82029	Reagenzien müssen bei -20 μg gelagert werden; C
Ligationsreagenz (5&fach;)	Sigma-Aldrich	DUO82009	Reagenzien müssen bei -20 & Grad gelagert werden; C
MCM2 Antikörper (Kaninchen)	Abcam	ab4461	1 von 200
MCM5 Antikörper (Kaninchen monoklonal)	Abcam	Ab75975	1 von 1000
Methanol	Lab ALLEY	A2076	vorkalt bei -20°; C vor der Anwendung
phosphoMCM2S108 Antikörper (Kaninchen)	Abcam	ab109271	1 zu 200
Polymerase (10 Einheit/μ l)	Sigma-Aldrich	DUO82030	Reagenzien müssen bei -20 & Grad gelagert werden; C
Verlängern Sie Goldeinbettmedien mit DAPI	ThermoFisher Scientific	P36935
PSF1 Antikörper (Kaninchen)	Abcam	ab181112	1 von 200
RNAse A 100 mg/ml	Qiagen	19101	Reagenzien müssen bei 4 & Grad gelagert werden; C
Open-Source-Software für statistische Analyse und Datenvisualisierung		R studio	ggplot2 Paket zur Erstellung von Punktdiagrammen und Boxplots
Softwarelizenz für statistische Analyse und Datenvisualisierung erforderlich	Systat Software	Sigmaplot V13
TMP (Trioxalen)	Sigma-Aldrich	T6137_1G
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787_250ML
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416_100ML
UV-Box	Southern New England Ultraviolet		Eingestellt. Sehen Sie sich Opsytec UV-Prüfkammer als möglichen Ersatz
an UV-Prüfkammer	Opsytec	UV-PRÜFKAMMER BS-04
VE-821	Selleckchem	S8007	Endkonzentration ist 1µ M