Methodenartikel

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle

DOI:

10.3791/61693

⸱

2. November 2020

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte in vivo CRISPR/Cas9 Screening-Methodik mit Ultraschall-geführten in utero embryonalen lentiviralen Injektionen, um gleichzeitig die Funktionen mehrerer Gene in der Haut und Mundhöhle von immunkompetenten Mäusen zu bewerten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetisch veränderte Mausmodelle (GEMM) waren maßgeblich an der Beurteilung der Genfunktion, der Modellierung menschlicher Krankheiten und als präklinisches Modell zur Bewertung therapeutischer Wege beteiligt. Ihre zeit-, arbeits- und kostenintensive Natur schränkt jedoch ihren Nutzen für die systematische Analyse der Genfunktion ein. Jüngste Fortschritte in den Genom-Editing-Technologien überwinden diese Einschränkungen und ermöglichen die schnelle Generierung spezifischer Genstörungen direkt in bestimmten Mausorganen in multiplexierter und schneller Weise. Hier beschreiben wir eine CRISPR/Cas9-basierte Methode (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), um Tausende von Gen-Knock-out-Klonen innerhalb des Epithels der Haut und der Mundhöhle von Mäusen zu erzeugen, und liefern ein Protokoll, das die Schritte beschreibt, die notwendig sind, um einen direkten in vivo   CRISPR-Bildschirm für Tumorsuppressorgene durchzuführen. Dieser Ansatz kann auf andere Organe oder andere CRISPR/Cas9-Technologien wie CRISPR-Aktivierung oder CRISPR-Inaktivierung angewendet werden, um die biologische Funktion von Genen während der Gewebehomöostase oder in verschiedenen Krankheitssituationen zu untersuchen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine der Herausforderungen für die Krebsforschung in der postgenomischen Ära besteht darin, die riesige Menge an Genomdaten für kausale Genmutationen zu abbauen und Knoten im Gennetzwerk zu identifizieren, die therapeutisch anvisiert werden können. Während bioinformatische Analysen enorm dazu beigetragen haben, diese Ziele zu erreichen, ist die Etablierung effizienter In-vitro- und In-vivo-Modelle eine Voraussetzung, um die Komplexität biologischer Systeme und Krankheitszustände zu entschlüsseln und die Entwicklung von Arzneimitteln zu ermöglichen. Während herkömmliche transgene Mausmodelle ausgiebig für in vivo Krebsgenetik-Studien verwendet wurden, hat ihre kosten-, zeit- und arbeitsintensive Natur die systematische Analyse der Hunderte von vermeintlichen Krebsgenen, die durch die moderne Genomik entwirrt wurden, weitgehend verboten. Um diesen Engpass zu überwinden, kombinierten wir eine zuvor etablierte Ultraschall-geführte in der Utero-Injektionsmethodik1,2 mit einer CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Gen-Editing-Technologie3, um gleichzeitig Funktionsverlustmutationen von Hunderten von Genen in Haut und Mundhöhle einer einzelnen Maus zu induzieren und zu untersuchen.

Die hier beschriebene Methodik nutzt Ultraschall-geführte Injektionen von technisch hergestellten Lentiviren in die Fruchtwasserhöhle lebender Mausembryonen am Embryonaltag E9.5. Die lentivirale Ladung, die CRISPR/Cas9-Komponenten enthält, transduciert das einschichtige Oberflächenektoderm, das später das Epithel der Haut und der Mundhöhle hervorruft. Die Haut besteht aus einer äußeren Epidermis, gefolgt von Kellermembran und Dermis. Epidermis ist ein geschichtetes Epithel, das aus einer inneren Basalschicht besteht, die den Kontakt mit der Kellermembran aufrechterhält und eine proliferative und Stammzellkapazität hat. Die Basalschicht führt zu den differenzierten Schichten oben wie z.B. stachelförmigen, körnigen und stratum corneum Schichten2,4. Lineage-Tracing-Studien zeigen, dass diese direkte in vivo CRISPR/Cas9-Methode geweberesidente Stammzellen innerhalb der Basalschicht genetisch manipuliert, die während des gesamten Erwachsenenalters fortbestehen. Da lentivirus titriert werden kann, um das E9.5-Oberflächenektoderm bei klonaler Dichte zu transduzieren, kann diese Methode verwendet werden, um Mosaikmäuse zu erzeugen, die Tausende von diskreten Gen-Knock-out-Klonen beherbergen. Die Sequenzierung der nächsten Generation kann dann verwendet werden, um die Wirkung der CRISPR/Cas9-vermittelten Genablation innerhalb dieser Klone in multiplexisierter Weise zu analysieren5.

Wir haben diese Methode vor kurzem verwendet, um die Funktion von 484 Genen zu bewerten, die wiederkehrende Mutationen im menschlichen Kopf- und Hals-Squamous-Zell-Karzinom (HNSCC)5zeigen. HNSCC ist eine verheerende Krebserkrankung mit einer hohen Sterblichkeitsrate von 40–50% und sie ist die6. häufigste Krebsart weltweit6. HNSCC entstehen in Schleimhautauskleidungen der oberen Atemwege oder Mundhöhle und sind mit Tabak- und Alkoholkonsum oder einer Infektion mit dem humanen Papillomavirus (HPV) in Verbindung gebracht. Kutanes Plattenepithelkarzinom (SCC) sind Hauttumoren und stellen die zweithäufigste Krebsart beim Menschendar 7. Kutane SCC und HNSCC sind histologisch und molekular sehr ähnlich, mit einem hohen Prozentsatz von Fällen, die Veränderungen in TP53, PIK3CA, NOTCH1 und HRAS8aufweisen. Während es nur eine Handvoll Gene gibt, die mit hoher Frequenz mutiert sind, gibt es Hunderte von Genen, die mit niedriger Frequenz mutiert sind (< 5%), ein Phänomen, das gemeinhin als Long-tail-Verteilung bezeichnet wird. Da die Mehrheit der Longtail-Gene keine biologische oder klinische Validierung haben, haben wir diese in vivo CRISPR-Screening-Technologie verwendet, um Funktionsverlust dieser Gene bei tumorgefährdeten Mäusen mit sensibilisierenden Mutationen in p53, Pik3ca oder Hras zu modellieren und identifizierten mehrere neuartige Tumorsuppressorgene, die mit p53, Pik3ca oder Hras zusammenarbeiten, um die Tumorentwicklung auszulösen5.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Generierung von multiplexed sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA Bibliotheken und führen CRISPR/Cas9 Gen Knock-out-Screens in der MausOberfläche Ektoderm. Bemerkenswert ist, dass diese Methode angepasst werden kann, um andere Genmanipulationstechnologien wie CRISPR-Aktivierung (CRISPRa) und CRISPR-Inaktivierung (CRISPRi) zu integrieren oder modifiziert werden, um andere Organsysteme in der Maus zu zielen, um Genfunktionen zu untersuchen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der IACUC der University of Toronto genehmigt und durchgeführt.

1. Entwerfen und Klonen von gepoolten CRISPR-Bibliotheken

  1. Wählen Sie 4-5 sgRNAs aus, die auf Mausgene von Interesse aus Ressourcen wie dem Broad Institute sgRNA Designer (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) oder dem CHOPCHOP-Server (https://chopchop.cbu.uib.no) abzielen. Wählen Sie eine gleiche Anzahl von nicht-zielgerichteten sgRNAs aus z.B. Sanjana et al.9 aus, um eine gleich große gRNA-Bibliothek für nicht-zielgerichtete Steuerelemente zu generieren.
  2. Stellen Sie beim Aufbau der sgRNA-Bibliotheken sicher, dass für jede sgRNA im Zielorgansystem genügend Abdeckung vorhanden ist. Für die Maushaut ist die Epidermis bei E9.5 eine einzelne Schicht, die 150.000 Zellen enthält, von denen die meisten eine Stammzellkapazität haben4. Wenn die lenti-virale Transduktion zu einer Infektiosität von 15-20% führt, werden nur 18.000-24.000 Zellen bei E9.5 transduziert. Skalieren Sie das Experiment entsprechend.
  3. Zum Klonen und Verstärken dieser sgRNA-Bibliotheken fügen Sie BsmBI-Enzymrestriktionsstellen sowie Grundbindungs-DNA-Sequenzen an 5' und 3' Ende der sgRNA hinzu und ordnen die resultierenden Oligos in voller Länge als gepoolten Oligonukleotidchip an (Abbildung 1A).
    1. Um verschiedene Bibliotheken auf einem Chip zu multiplexen, fügen Sie bibliotheksspezifische Primersequenzen hinzu.
    2. Mit den entsprechenden Primer-Paaren, verstärken Sie jede Bibliothek separat vom gepoolten Oligo-Chip. Mischen Sie in einem PCR-Rohr 25 l 2x Polymerase-Master-Mix, 20 l DNase/RNase-freies Wasser, 5 ng Oligo-Chip-DNA, 2,5 l geeignete Vorwärtsgrundierung und 2,5 l geeignete Reverse-Primer. Verwenden Sie 12-15 Zyklen und verstärken Sie mit 98 °C Denaturierung, 63-67 °C Glühen, 72 °C Erweiterungsparameter für jeden Zyklus in der PCR-Maschine.
    3. Führen Sie PCR-Produkt auf einem 2,5% Agarose-Gel aus und reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem Gel-DNA-Reinigungskit.
  4. Bereiten Sie das Backbone-Plasmid vor.
    1. Verdauen Sie 5 g der Cre-recombinase mit pLKO-Cre Stuffer v3-Plasmid mit 2 l BsmBI in 50 l Reaktionsmischung für 1 h bei 55 °C, gefolgt von 1 l alkalischer Phosphatase-Inkubation für 45 min bei 37 °C gemäß Herstelleranleitung.
      HINWEIS: Cre-recombinase enthält pLKO-Cre Stuffer v3 Plasmid ist ein lenti-virales Plasmid, das Cre-Recombinase-Enzym enthält, um Lox-Stop-Lox-Kassette in Mauszellen zu entfernen und hat auch einen U6-Promotor, um die Expression von sgRNA und tracrRNA zu fördern. Eine Version mit Cas9 und ohne Cas9 kann verwendet werden und ist auf Addgene #158030 und #158031 verfügbar.
    2. Führen Sie die verdaute DNA auf einem 1% Agarose-Gel aus und reinigen Sie das 7 kb linearisierte Vektorband mit einem Gel-DNA-Reinigungskit. Bemerkenswert ist, dass auch ein 2 kb Stuffer-Band sichtbar sein sollte, was auf einen erfolgreichen Digest hinweist.
  5. Richten Sie die Ligationsreaktion ein, um eine sgRNA-Plasmidbibliothek zu erzeugen.
    1. Mischen Sie 1 g gereinigten Vektor und 30 ng gereinigten PCR-Einsatz mit 2 l BsmBI, 5 l T4-DNA-Ligase, 10 -M ATP und 1x Puffer spezifisch für BsmBI. Inkubieren Sie den Ligationsmix über Nacht bei 37 °C. Verwenden Sie ein zusätzliches Rohr, das alle oben genannten Materialien außer dem PCR-Einsatz als Negativkontrolle enthält.
    2. Am nächsten Tag morgen, reinigen Sie die Ligationsmischung mit dem Oligo-Reinigungskit und elute in 7 l RNase/DNase freies Wasser.
  6. Elektroporate die Bibliothek in kompetente Zellen.
    1. Fügen Sie 2 l eluierte sgRNA-Bibliothek oder negative Kontrollligationsmischung zu 25 l aufgetauten elektrokompetenten Zellen in vorgekühlten Küvetten (1,0 mm) auf Eis hinzu. Elektroporate nach dem Herstellerprotokoll (10 F, 600 Ohm, 1800 Volt). Zur Küvette 975 l Erholungsmedium (oder SOC-Medium) innerhalb von 10 s des Pulses hinzufügen.
    2. Elektroporated Zellen in ein Kulturrohr übertragen und eine Stunde bei 37 °C in einem bakteriellen Schüttelinkubator bei 300 U/min brüten.
  7. Schätzen Sie die Transformationseffizienz und die Bibliotheksabdeckung pro sgRNA.
    1. Bereiten Sie eine 100-fache Verdünnung vor, indem Sie 10 l der Transformationsreaktion, die Zellen enthält, die mit der sgRNA-Bibliothek oder negativer Kontrollligation elektropoiert sind, auf 990 l Erholungsmedium übertragen und gut mischen.
    2. Platte 10 l der verdünnten Transformationsmischung auf eine vorgewärmte 10 cm LB + Ampicillin (100 g/l) Agarplatte. Dies führt zu einer 10.000-fachen Verdünnung der Transformationsmittel und verwendet diese Platte, um die Transformationseffizienz zu berechnen. Inkubation der Platten bei 30 °C für 14–16 h durchführen.
  8. Den Rest der Transformationsreaktion durch Dies pro Platte von insgesamt 10 vorgewärmten 15 cm LB + Ampicillin-Agarplatten 100 l der wiedergewonnenen Zellen zu verfestigen. Inkubieren Sie die Platten für 14–16 h bei 30 °C. Bemerkenswert ist, dass das Wachstum bei 30 °C die Rekombination zwischen den beiden langterminalen Wiederholungen innerhalb des viralen Plasmids minimiert.
  9. Um den Klonerfolg zu bewerten, berechnen Sie die Transformationseffizienz. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien auf der Verdünnungsplatte, die Transformanten aus der sgRNA-Bibliothek oder Negativkontrollligation (10 cm Platten, Schritt 1.8.2) enthält. Negative Kontrollmischung sollte keine oder nur sehr wenige Kolonien haben. Um die Gesamtzahl der Kolonien zu erhalten, multiplizieren Sie die Anzahl der Kolonien mit 10.000.
    HINWEIS: Die gezählte Gesamtzahl der Kolonien stellt eine Bibliotheksabdeckung dar, die mindestens 200x Kolonien pro sgRNA betragen sollte.
    1. Stellen Sie sicher, dass eine Bibliothek mit 2000 sgRNAs mindestens 400.000 Kolonien hat. Falls es nicht genügend Kolonien gibt, wiederholen und mehr Elektroporation einrichten.
  10. Qualitätskontrolle: Von der Verdünnungsplatte 20 Kolonien pflücken und jede Kolonie zu einem individuellen Kulturrohr hinzufügen, das 3 ml LB-Medien + Ampicillin enthält. Alle 20 Röhren über Nacht bei 30 °C schütteln bei 250 U/min inkubieren. Reinigen Sie die Plasmid-DNA mit Mini-Prep-Kit nach Herstelleranweisungen und Sanger Sequenz alle 20 Plasmid-DNA-Proben, um zu überprüfen, dass jede Probe eine andere sgRNA-Sequenz mit dem U6-Primer (5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3') hat.
  11. Ernten Sie die Kolonien von jedem 15 cm Teller.
    1. Fügen Sie 7 ml LB Medium, dann kratzen Sie die Kolonien von der LB Agar Platte mit einem Zellstreuer. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette, um die Zellen in einen 2 L sterilen konischen Kolben zu übertragen. Wiederholen Sie dies für alle Platten und Poolbakterien im 2 L-Kolben. Den Kolben für 2-3 h Schütteln bei 30 °C inkubieren. Zentrifugieren Sie die Kultur und sammeln Sie das Pellet.
    2. Reinigen Sie Plasmid-DNA mit einem Maxi-Plasmid-Reinigungskit.
  12. Zusätzliche Qualitätskontrolle: Verwenden Sie 1 ng maxi-prep sgRNA Bibliothek Plasmid-DNA und führen Sie eine PCR-Reaktion mit Next-Generation-Sequenzierungsprimer nach Herstelleranweisungen aus. Die Darstellung aller sgRNAs in der Bibliothek kann durch eine tiefe Sequenzierungsplattform überprüft werden.

2. Herstellung von High Titer lentivirus geeignet für In-vivo-Transduktion

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in diesem Abschnitt des Protokolls in einer BSL2+-Anlage in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II, Typ A2, aus. 293FT und vor allem die 293NT Verpackungszellen ermöglichen eine höhere Virusproduktion. Verwenden Sie niedrige Durchgangszellen (

  1. Bereiten Sie virale Verpackungszellen vor.
    1. Am 1. Tag, Platte HEK293T Zellen auf 6 Poly-L-Lysin beschichtet 15 cm Platten bei 35% Konfluenz in Wachstumsmedien (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin Antibiotikum-Lösung (w/v)). Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 °C, 5%CO2.
    2. Sobald die plattierten Zellen 70-80% konfluent sind und gleichmäßig verteilt sind, ersetzen Sie Wachstumsmedien durch 25 ml Serum und antibiotikafreie DMEM-Medien.
    3. Fügen Sie Medien langsam zu den Seiten der Kolben bei der Fütterung, wie HEK293T und 293NT Zellen können leicht von Gewebekultur Kunststoff lösen
  2. Bereiten Sie transfektionsmix vor.
    1. Fügen Sie 65 g lentivirale Verpackungsplasmide psPAX2, 43 g VSV-G,-Exzessiumplasmid pMD2.G, 65 g sgRNA-Bibliotheksplasmid und 240 g 1 mg/ml Polyethyleneimin (PEI) bis 6 ml DMEM und Wirbel hinzu.
      HINWEIS: Verwenden Sie immer eine ungeöffnete oder erst kürzlich geöffnete Flasche DMEM für die Transfektion, da der pH-Wert in diesem Schritt entscheidend ist und DMEM mit der Zeit nach dem Öffnen einfacher wird.
    2. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Diese Transfektionsmischung reicht für Zellen, die auf 6 x 15 cm Platten mit 870 cm2 Oberfläche plattiert sind. Skalieren Sie den Transfektionsmix entsprechend den Anforderungen des Experiments.
  3. Transfektion viraler Verpackungszellen.
    1. Nach 15 min Inkubation jede der 15 cm Platten durch Zugabe von 1 ml des Transfektionsgemisches tropfenweise durch die Platte transfezieren. Bei 37 °C inkubieren, 5%CO2 für 8 h.
    2. Nach der Inkubation die serumfreien Medien, die den Transfektionsmix enthalten, entfernen und 30 ml reguläre Kulturmedien zu den 15 cm Platten und Kultur für 48 h bei 37 °C, 5%CO2hinzufügen.
  4. Nach 48 h den viralen Überstand sammeln und durch 0,45 m PVDF-Filter filtern. Halten Sie 1 ml des viralen Überstandes auf und lagern Sie bei -80 °C für die Qualitätskontrolle und virale Titering.
  5. Konzentrieren Sie den viralen Überstand durch Saccharose-Gradientenzentrifugation in Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit SW28 Rotorkopf.
    1. Prime Ultrazentrifugenrohre durch Waschen mit 70% Ethanol, gefolgt von 3 Spülungen mit PBS. Gleichmäßig etwa 30 ml des viralen Überstandes in jedes der 6-Ultrazentrifugenröhre verteilen.
    2. Sanft Pipette an der Unterseite jedes Rohres 4 ml der 20% Saccharoselösung (20 g Saccharose in 100 ml PBS). Legen Sie die sechs Ultrazentrifugenrohre in die sechs SW28-Schwenkeimer und balancieren Sie jedes gegnerische Eimerpaar präzise aus, indem Sie viralen Überstand hinzufügen oder entfernen.
    3. Zentrifugen-Virusüberstand bei 4 °C für mindestens 2 h und bis zu 4 h bei 80.000 x g und 4 °C. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, den Überstand sorgfältig entsorgen.
    4. Entleeren Sie den verbleibenden Überstand, indem Sie Ultrazentrifugenrohre auf dem Kopf auf ein steriles weiches Papiertuch für mindestens 2 min legen und alle Tröpfchen von Überstand in der Röhre mit einem weichen Papiertuch abwischen, um jedes Restmedium loszuwerden. Ein kleines gräulisches weißes Pellet könnte an der Unterseite des Rohres sichtbar sein.
    5. Fügen Sie jedem Rohr 20-25 l kalte, frische PBS hinzu. Versiegeln Sie Rohre mit Paraffinfolie und inkubieren Sie Röhren aufrecht auf Eis mit sanftem Schütteln auf einem Orbitalplattform-Shaker für 2 stunden.
    6. Mit einer 20-L-Pipette das Pellet des ersten Rohres vorsichtig lösen und wieder aufhängen, wobei darauf geachtet wird, keine Blasen zu bilden. Übertragen Sie das Medium auf die nächste Röhre und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Viruspellets entfernt und in einer Röhre mit einem Volumen von ca. 120-150 l kombiniert wurden. Inkubieren Sie diese hochtiter virale Suspension für weitere 2 Stunden auf Eis mit sanftem Schütteln.
    7. Übertragen Sie die virusische Suspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und drehen Sie das Rohr bei 4 °C in einer gekühlten und vorgekühlten Tischzentrifuge bei 12.000 x g für 2 min. Aliquot den klaren viralen Überstand sorgfältig als 10 l Aliquots in separaten 0,2 ml-Röhren und lagern bei -80 °C. Entsorgen Sie das Pellet an der Unterseite des Rohres, da dies die Nadel während embryonaler Injektionen verstopfen wird.
  6. Titration der gepoolten CRISPR lentivirus Bibliothek
    HINWEIS: Die resultierende virusische Suspension sollte eine ca. 2.000-fache Konzentration und die resultierende Viruslösung ergeben und einen viralen Titer von 107-109aufweisen, was gut genug für mehr als 100 e9,5 operationen ist, die unten beschrieben werden.
    1. Samen R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato Maus embryonale Fibroblasten (MEFs) oder R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato primäre Keratinozyten oder jede andere Cre-Reporter-Zelllinie in eine 2 x 6-Well-Platte.
    2. Sobald die Zelle die Koninfluenza erreicht hat, sind die Zellen für die Transduktion bereit. Zu diesem Zeitpunkt, bestimmen Sie die Anzahl der Zellen in einem Brunnen, um die Berechnung des viralen Titers später zu ermöglichen. Ändern Sie die Medien der Cre-Reporter-Zellen in Wachstumsmedien, die mit 10 g/ml Polybren (=Hexadimethrinbromid) ergänzt werden.
    3. Verdünnen Sie 1 l des konzentrierten Virus mit 2 ml Wachstumsmedien. Fügen Sie 0, 10, 50, 200 l verdünnte virussuspension und 50, 200 l des nicht konzentrierten Virus aus Schritt 2.4 und mischen Platten und inkubieren über Nacht bei 37 °C, 5%CO2.
    4. Entfernen Sie Wachstumsmedien, die Viren am nächsten Tag enthalten, waschen Sie Zellen mit PBS und ersetzen Sie sie durch normale Wachstumsmedien. Der Überstand gilt an dieser Stelle noch als viraler Abfall und muss gemäß den institutionellen BSL2-Vorschriften entsorgt werden.
    5. Ungefähr 36-48 h nach der Transduktion, bewerten Cre-vermittelte Rekombination der Lox-STOP-Lox-Kassette und Expression von tdTomato durch FACS. Berechnen Sie viralen Titer. Berechnen Sie koloniebildende Einheiten (cfu)/ml mit der folgenden Formel:
      figure-protocol-1
      HINWEIS: Der Vergleich zwischen der konzentrierten viralen Suspension mit ihrem unkonzentrierten viralen Überstand ermöglicht es, den Erfolg von (1) viraler Produktion sowie (2) virale Konzentration zu schätzen. Alternativ kann der virale Titer mit der qRT-PCR-Methode10geschätzt werden. Die großflächige Produktion und Konzentration des Lentivirus kann auch mit einer zweistufigen Konzentration mit einer Patronenkonzentration gefolgt von einer Ultrazentrifugation durchgeführt werden, wie zuvor beschrieben2.

3. Ultra-Sound geführte Chirurgie und Injektion

HINWEIS: Diese Technologie wurde von4,11angepasst. Mikroinjektionen, die auf die Transduktion des Oberflächenepithels ausgerichtet sind, müssen am Embryonaltag E9.5 durchgeführt werden, wenn das Oberflächenektoderm aus einer einzigen Schicht besteht, und vor der Bildung des Periderms ab E10, was eine Transduktion dieser Basalschicht verhindern würde. Vorzugsweise am Freitag Mäuse aufstellen, so dass der erste mögliche Tag mit E9.5-Embryonen der folgende Montag ist. Verwenden Sie Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP-Mäuse (Jackson Laboratory #024857) für optimale CRISPR/Cas9-Effizienz12.

  1. Richten Sie geeignete männliche und weibliche Mäuse für zeitgefristete Schwangerschaften 10 Tage vor dem gewünschten Operationsdatum ein.
    1. Plug-Check-Mäuse in den folgenden Tagen, um potenziell schwangere Mäuse zu identifizieren. Bestätigen Sie die Schwangerschaft am Tag vor der geplanten Operation (d.h. E8.5) mit Ultraschall.
  2. Bereiten Sie die modifizierte Petrischale vor.
    1. Mit dem doppelseitigen Klebeband kleben Sie die Silikonmembran auf den Boden der Petrischale, die die kreisförmige Öffnung bedeckt. Schneiden Sie mit einer scharfen Schere eine 2 x 10 mm ovale Öffnung in die Silikonmembran.
  3. Vorbereitung des Mikroinjektionssystems
    1. Vorbereiten von Injektionsnadeln aus einer dickwandigen Glaskapillare mit einem Mikropipette-Puller mit den folgenden Einstellungen: Druck = 200; Wärme = 769; Ziehen = 0; Geschwindigkeit = 140; Zeit = 100.
    2. Mit einer feinen Schere, um die Nadelspitze auf der Ebene abzuschneiden, wo ihr Durchmesser 30 m beträgt. Die Nadel mit Nadelspitze randlassen auf 20° auf einer feinfeiner Schleifplatte mit regelmäßiger Benetzung für 20 min.
    3. Sterilisieren Sie die Mikroinjektionsnadel, indem Sie 70% Ethanol mit einer 10 ml Spritze mit einer 26 G1/2-Nadel schieben. Mit einer 10 ml Spritze und 26 G1/2 Nadel mit Mineralöl beladen, füllen Sie die Mikroinjektionsnadel. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in der Mikroinjektionsnadel befinden.
    4. Montieren Sie die Mikroinjektornadel gemäß den Herstelleranweisungen am Mikromanipulator.
  4. Laden Sie die Nadel mit viraler sgRNA-Bibliothek.
    1. Pipette 10 l virusvirale Suspension auf einen Parafilm, der auf einer ebenen Oberfläche befestigt ist.
    2. Mit Mikromanipulator, vertreiben Sie das Mineralöl. Das Vorhandensein eines kleinen Ölvolumens in der Nadel verhindert, dass das Lentivirus den Kolben kontaktiert. Laden Sie ca. 4-5 l virale Suspension durch langsame Aspiration ohne Luftblasen.
  5. Anästhetisieren Schwangere Maus mit Isofluran-Induktionskammer. Stellen Sie den Sauerstoffregler auf 1 L/min und den Isofluran-Verdampfer auf 2%. Um festzustellen, ob das Tier anästhesiert ist, überprüfen Sie durch Zehenprise nach 3-5 min in der Isofluran-Induktionskammer.
  6. Legen Sie die anästhesierte tiersandische Ventralseite auf die beheizte Operationsstufe (40 °C) und tragen Sie Operationsbänder auf, um die Pfoten mit dem Nasen-Kegel-Anästhesierohr für eine konstante Versorgung mit Isofluran und Sauerstoff zu halten, bis die Operation abgeschlossen ist.
  7. Bestätigen Sie die E9.5-Schwangerschaft, wenn sie nicht bei E8.5 durchgeführt wurde.
    1. Tragen Sie eine kleine Menge (ca. 1/2 TL) einer Haarentfernungscreme auf den Bauch auf und verteilen Sie sie über einen Bereich von 3 x 3 cm mit einem mit Baumwolle umgaben Applikator.
    2. Nach 2-3 min die Creme vorsichtig mit Gaze oder Gewebe entfernen und den Bereich mit PBS und 70% Ethanol reinigen.
    3. Überprüfen Sie mit der Ultraschallsonde und dem Gel die trächtige Maus auf den embryonalen Tag E9.5. Bemerkenswert ist, dass dies auch am Vortag bei E8.5 erfolgen kann, um Zeit am eigentlichen Opetag zu sparen.
    4. Entfernen Sie Ultraschallgel und wischen Sie den Bereich mit BPS und dann 70% Ethanol zu desinfizieren.
  8. Injizieren Sie 0,02 ccm Buprenorphin-Analgetika subkutan in den Mausdamm.
  9. Chirurgische Belichten der Gebärmutter
    1. Mit sterilen Zangen und Scheren, machen Sie einen vertikalen Schnitt von 2 cm in die Haut der Maus.
    2. Mit stumpfen Zangen trennen die Haut um den Schnitt vom Peritoneum.
    3. Mit sterilen Zangen und Schere, durch schneiden Sie das Peritoneum.
    4. Mit stumpfer Zange ziehen Sie das linke und rechte Gebärmutterhorn vorsichtig heraus und zählen Sie die Embryonen.
    5. Setzen Sie die meisten Uterushörner wieder ein, lassen Sie aber das distale Ende eines Gebärmutterhorns mit 3 Embryonen exponiert.
    6. Mit stumpfer Zange die Gebärmutter mit den 3 Embryonen vorsichtig durch die Öffnung in der Silikonmembran der modifizierten Petrischale schieben und ziehen.
    7. Stabilisieren Sie die Petrischale mit Würfeln aus Modellton.
  10. Stabilisieren Sie die Gebärmutter mit den drei Embryonen in der Petrischale mit einer Silikonform. Den Silikonstecker an der Seite der Embryonen mit einem scharfen Messer abflachen.
  11. Füllen Sie die Petrischale mit sterilem PBS. Spülen Sie die Siliziummembran auf dem Boden der Petrischale mit dem Bauch der schwangeren Mutter, wodurch ein Leck verhindert wird.
  12. Bewegen Sie den Ultraschallkopf in die Petrischale 0,5 cm über dem oberen Embryo und passen Sie die Bühne so an, dass die Fruchtwasserhöhle in der Ultraschallansicht deutlich sichtbar wird.
  13. Richten Sie die Injektornadel sorgfältig in die modifizierte Petrischale aus. Platzieren Sie mit dem Mikromanipulator die Spitze der Nadel innerhalb von 5 mm des oberen Embryos. Dann schalten Sie die Nadel hin und her und bewegen Sie sich in die Ebene, wo ihre Spitze am hellsten im Ultraschallbild erscheint.
  14. Mit dem Mikromanipulator drücken Sie die Nadel durch die Gebärmutterwand in die Fruchtwasserhöhle.
  15. Injektion lentivirus enthält sgRNA Bibliothek.
    1. Vorprogrammieren Sie den Injektor auf 62 nL und langsame Injektionsgeschwindigkeit. Der Mikroinjektor kann so programmiert werden, dass er bestimmte Volumina mit einer langsamen oder schnellen Geschwindigkeit injiziert.
    2. Drücken Sie die Inject-Taste 8 Mal für insgesamt 496 nL pro Embryo. Passen Sie die Lautstärke an die erforderlichen Bedürfnisse und den viralen Titer an. Ein viraler Titer von 1 x 108 pfu/ml und 496 nL Injektionsvolumen führt zu einer Infektion von ca. 30%.
    3. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren für andere zwei Embryonen.
    4. Heben Sie den Ultraschallkopf an und entfernen Sie den Silikonstecker.
    5. Drücken Sie die 3 Embryonen vorsichtig in den Bauch der Maus mit einem sterilen Baumwolltausch.
    6. Ziehen Sie die nächsten 3 Embryonen vorsichtig heraus und wiederholen Sie den Injektionsvorgang, bis die gewünschte Anzahl von Embryonen injiziert wird.
      HINWEIS: Überschreiten Sie nicht 30 min Anästhesie, da schwangere Muttern ihre Embryonen über diese Zeit hinaus abtreiben. Ein erfahrener Chirurg kann innerhalb von 30 min eine Operation von bis zu 12 Embryonen injizieren.
  16. Heben Sie den Ultraschallkopf an, entfernen Sie den Mikromanipulator mit der Nadel, aspirieren Sie das PBS und entfernen Sie die Petrischale. Mit sterilen Tüchern, absorbieren Sie alle PBS, die in der Bauchhöhle angesammelt haben könnte.
  17. Schließen Sie den peritonealen Schnitt mit resorbierbaren Nähten. Verwenden Sie zwei Heftklammern, um den Schnitt in der Bauchhaut zu schließen.
    HINWEIS: Bei der Durchführung von Ultraschall, der in Gebärmutteroperationen geführt wird, sollte äußerste Sorgfalt darauf geachtet werden, eine saubere Umgebung zu erhalten, die Sterilität so weit wie möglich zu erhalten und mögliche Verunreinigungen zu vermeiden. Wenn mehr als eine Operation am selben Tag durchgeführt werden muss, ist es wichtig, die Sezierinstrumente mit einem Perlensterilisator zu sterilisieren und andere Geräte zu reinigen, die auf mit Ethanol gereinigtes Mausgewebe treffen. Dies erhöht das höhere Überleben der Embryonen nach der Operation erheblich. Die Überlebensrate für die hier beschriebene Operationsmethode liegt konstant zwischen 80-100%.
  18. Post-Chirurgie-Pflege.
    1. Lassen Sie das schwangere Weibchen in einem beheizten Käfig erholen und beobachten Sie für 15-30 min.
    2. Überprüfen Sie den vaginalen Kanal auf Blut, was ein frühes Anzeichen von Abtreibung und Komplikationen ist. Zur postoperativen Schmerzlinderung das Schmerzmittel zweimal täglich für zwei Tage nach der Operation zu verabreichen.
  19. Identifizieren Sie transduzierte Embryonen/Neugeborene Rosa26-Lox-STOP-Lox-Cas9-GFP-Mäuse mit einem fluoreszierenden Sesektierungsmikroskop, einer fluoreszierenden Protein-Taschenlampe und Filtergläser oder durch Genotypisierung für integrierte Viruspartikel in Ohr- oder Schwanzclips.
    HINWEIS: Mäuse werden am besten mit dem Fluoreszenzmikroskop bis zum postnatalen Tag 3 identifiziert, bevor das Haar zu wachsen beginnt.
  20. Um eine ausreichende Abdeckung für die CRISPR-Bibliothek zu gewährleisten, berechnen Sie die Abdeckung basierend auf den folgenden Parametern: E9.5 Mausoberflächen-Ektoderm besteht aus 150.000 Zellen; Transduktion von 20 % führt zu einer minimalen doppelten Infektionsrate (ca. 1/10 doppelt infizierte Zellen)4,5,11; bei einer Infektiosität von 20 % hat jeder Embryo 30.000 infizierte Zellen. Stellen Sie sicher, dass mindestens 100 einzelne Zellen mit einer bestimmten sgRNA transduziert werden. Ein Pool von 2000 sgRNAs benötigt beispielsweise 2 x 105 Zellen oder 6-7 Tiere.

4. Tiefe Sequenzierung

  1. Bei experimentellem Endpunkt wie Tumorbildung oder einem anderen Phänotyp, opfern Sie die Maus und ernten Sie das Gewebe von Interesse. Verwenden Sie das Extraktionskit für Blut- und Gewebe-DNA, um die genomische DNA nach dem Herstellerprotokoll zu reinigen. Bevor Sie mit der DNA-Extraktion aus Tumoren beginnen, reinigen Sie den Arbeitsplatz mit DNA-Erase und arbeiten Sie weg vom Laborbereich, in dem Plasmide behandelt werden.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine Referenzstichprobe zu generieren, um sgRNA-Faltenänderungen im Laufe der Zeit zu berechnen. Transduced embryos 3 Tage nach der Infektion oder transduced cells (siehe Schritt 2. 6) kann als Referenzprobe dienen, um die sgRNA-Darstellung in der ursprünglichen Bibliothek zu bestimmen.
  2. Verwenden Sie 100 ng – 1,5 g genomische DNA als Vorlage in einer 50-L-VorverstärkungpcR 1-Reaktion mit den in Tabelle 1 aufgeführten äußeren Primern und dem in Tabelle 2beschriebenen PCR-Programm. Richten Sie genügend Reaktion ein, um die gewünschte Abdeckung zu erzielen.
    HINWEIS: Richten Sie die Barkodierung pcR-Reaktion in einem separaten dedizierten Bereich des Labors oder in einer Gewebekulturhaube ein, die gründlich durch DNA-Löschen gereinigt wird, um eine Kontamination zu vermeiden. Führen Sie eine negative Kontrolle für jede PCR-Platte mit Wasser als Vorlage aus, um sicherzustellen, dass keine Kontamination vorliegt.
  3. Bündeln Sie alle PCR 1-Reaktionen und führen Sie 20 l auf einem 1,5%-Kontroll-Agarose-Gel aus, um eine erfolgreiche Amplifikation eines 600 bp-Bandes zu überprüfen.
  4. Verwenden Sie die in Tabelle 3 aufgeführten und dem in Tabelle 4 beschriebenen PCR-Programm als Vorlage in einer 50-L-PCR 2-Reaktion mit einer eindeutigen Barcode-Primer-Kombination, die in Tabelle 3 aufgeführt ist, und dem PCR-Programm, das in Tabelle 4beschrieben ist. Führen Sie die PCR 2-Reaktion mit einem 2% Agarose-Gel aus und reinigen Sie das 200bp-Band mit einem Gel-Extraktionskit gemäß herstellerspezifischen Anweisungen.
    HINWEIS: Der Vorverstärkungsschritt ist nur für die Verstärkung eines komplexen Transduced Gewebes erforderlich. Wenn man einen einzelnen Tumor verstärkt, der vermutlich eine Klonzelle bildet und somit nur eine einzige sgRNA enthält, kann man die Vorverstärkung PCR1 überspringen und sofort mit PCR2 fortfahren.
  5. Quantifizierung der DNA-Konzentration mithilfe der fluorometrischen Quantifizierung und zur tiefen Sequenzierung an die Sequenzierungseinrichtung (z. B. 1 Million Lesevorgänge pro Tumor).
  6. Verwenden Sie Bowtie v1.2.3, das nur ungeapped Ausrichtungen zulässt, sequenzierte Lesevorgänge auf sgRNA-Bibliothek13ausrichten. Erstellen Sie einen Bowtie-Index mit bowtie-build-Befehl, der die sgRNA-Sequenzen im Fasta-Format eingibt. Ordnen Sie die Lesevorgänge mit dem Bowtie-Befehl mit den Optionen -m 2 -v 1zu, wodurch maximal zwei Nichtübereinstimmungen während der Leseausrichtung möglich sind, und verwirft Lesevorgänge, die mehr als eine Bibliothek sgRNA-Sequenz ausrichten. In der Regel richten sich mehr als 80 % der Lesevorgänge unter diesen Parametern aus.
  7. Verwenden Sie den Befehl MAGeCK count, um die Lesezähltabelle mithilfe der ausgerichteten Datei als Eingabe14abzubekommen. die sgRNA-Zähltabelle kann für nachgeschaltete Analysen verwendet werden, z. B. zur Bestimmung des Differentials sgRNA es (MAGeCK) und zur Suche nach essentiellen Genen (BAGEL).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbildung 1A zeigt das Design der Oligonukleotide zum Multiplexieren mehrerer benutzerdefinierter CRISPR-Bibliotheken auf kostengünstige Weise in einem einzigen 12k- oder 92k-Oligochip. Sobald die sgRNAs (blaue Farbe kodiert) ausgewählt sind, werden die Oligonukleotide mit Restriktionsstellen (orange farbene BsmBI) und bibliotheksspezifischen PCR-Primer-Paaren (grüne Farbe codiert) entworfen. Mehrere Bibliotheken können mit einer einzigartigen Kombination von Primerpaaren für Multiplexing in...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die CRISPR/Cas9-Genombearbeitung wurde in In-vitro- und In-vivo-Studien häufig zur Untersuchung von Genfunktionen und zellulären Prozessen eingesetzt. Die meisten In-vivo-Studien verwenden CRISPR/Cas9-Gen-editierte Zellen, die in ein Tiermodell (Allograft oder Xenograft) eingepfropft wurden. Während dies ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um Krebsgenetik und zelluläre Funktionen zu studieren, fehlt es immer noch an der einheimischen Gewebemikroumgebung und könnte Wund- und/oder Immunreaktionen hervorrufen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch ein Projektstipendium des Canadian Institute of Health Research (CIHR 365252), der Krembil Foundation und des Ontario Research Fund Research Excellence Round 8 (RE08-065) unterstützt. Sampath Kumar Loganathan ist Träger eines Stipendiums der Canadian Cancer Society (BC-F-16-31919).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,45 Mikron FilterSigmaS2HVU02RE
12k oder 92kOligo Chip Customarray Inc. (Genscript)
15 cm ZellkulturplattenCorning
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
Alkalische PhosphataseNEBM0290L
AmplicillinFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
BsmBINEBR0580L
Chromische DarmnahtCovidien
Tiefensequenzierung (Next-Seq oder Hi-Seq)Illumina
DNA-AufreinigungskitZymo ResearchD4008
DNAesy Blut und Gewebe DNA-ExtraktionskitQiagen69506
Endura elektrokompetente ZellenLucigen60242-1
GlaskapillarenDrummond3-000-203-G/X
HEK293T ZellenATCCCRL-3216
HochgeschwindigkeitszentrifugeBeckman CoulterMLS-50
LB AgarWisent Technologies800-011-LG
MikropipettenabzieherSutter InstrumentP97
MineralölSigmaM5904
Mini-Prep Plasmid KitFrogga BioPDH300
Maus SauerstoffanästhesiesystemVisual Sonics
Nanoject II MikromanipulatorDrummond
NEBuffer 3.1 ( Puffer für BsmBI)NEBR0580L
NadelschärferSutter InstrumentBV-10
Oligo Cleanup KitZymo researchD4060
PAGE gereinigte illumina SequenzierungsgrundierungIDT DNA
PEI (Polyethylenimin)Sigma408727-100ML
Permoplast Modelliermasse
Petrischale mit zentraler ÖffnungVisual Sonics
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
Q5 Polymerase 2x MastermixNEBM0494L
Qubit Fluorometrische QuantifizierungInvitrogenQ33327
Halbkreisförmiger SilikonstopfenCorning
SilikonmembranVisual Sonics
T4 DNA-LigaseNEBM0202L
Ultra-ZentrifugenröhrchenBeckman Coulter344058
Vevo2000 UltraschallsystemVisual Sonics

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beronja, S., Fuchs, E. RNAi-mediated gene function analysis in skin. Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).
  2. Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos. Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).
  3. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343, 84-87 (2014).
  4. Beronja, S., et al. RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth. Nature. 501, 185-190 (2013).
  5. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367, 1264-1269 (2020).
  6. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).
  7. Green, A. C., Olsen, C. M. Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review. British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).
  8. Campbell, J. D., et al. pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas. Cell Reports. 23, 194-212 (2018).
  9. Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11, 783-784 (2014).
  10. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34(2006).
  11. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343, 309-313 (2014).
  12. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
  13. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25(2009).
  14. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biology. 15, 554(2014).
  15. Winters, I. P., Murray, C. W., Winslow, M. M. Towards quantitative and multiplexed in vivo functional cancer genomics. Nature Reviews Genetics. 19, 741-755 (2018).
  16. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nature Genetics. 50, 483-486 (2018).
  17. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).
  18. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Science Advances. 4, 5508(2018).
  19. Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (151), e59780(2019).
  20. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163, 1515-1526 (2015).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

In Vivo CRISPR ScreenCRISPR Cas9 KnockoutMouse Skin EpitheliumOral Cavity TissueTumor Suppressor GenesUltrasound Guided InjectionLentiviral sgRNA LibraryEmbryonic Day 9 5Single Cell RNA SequencingHead and Neck Cancer

Verwandte Artikel