Summary
我们提出了一个简单的方法，利用荧光激活细胞分拣从小鼠表皮脂肪垫中分离出高度可行的青春期祖细胞。
Abstract
肥胖症和代谢性疾病，如糖尿病、心脏病和癌症，都与戏剧性的脂肪组织重塑有关。组织驻地脂肪祖细胞（APC）在脂肪组织平衡中起着关键作用，有助于组织病理学。单细胞分析技术（包括单细胞RNA测序和单细胞蛋白组学）的日益使用，通过允许在人口或组织范围内对单个细胞表达变化进行前所未有的解决，正在改变干细胞/祖细胞领域。在本文中，我们提供了详细的协议，以解剖小鼠表皮脂肪脂肪组织，分离单个脂肪组织衍生细胞，并执行荧光激活细胞排序（FACS），以丰富可行的Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs。这些协议将允许调查人员准备适合下游分析的高质量APC，如单细胞RNA测序。
Introduction
脂肪组织在能量代谢中起着关键作用。多余的能量以脂质的形式储存，脂肪组织能够根据营养状况和能量需求显著扩张或缩水。脂肪组织的扩张可能是由于脂肪细胞大小（肥大）和/或脂肪细胞数（增生）的增加造成的：后一过程受脂肪祖细胞1、2的增殖和分化的严格调控。在肥胖期间，脂肪组织过度扩张，组织功能障碍（包括缺氧、炎症和胰岛素抵抗）往往发展为3、4。这些并发症是许多慢性疾病的危险因素，包括高血压、糖尿病、心血管疾病、中风和癌症。因此，限制不受控制的脂肪组织扩张和缓解脂肪组织病理学是生物医学研究的首要任务。在脂肪组织扩张过程中，驻地脂肪组织衍生的干细胞（ASCs）会增殖并按顺序分化成前细胞（承诺的祖细胞），然后发育成成熟的脂肪细胞6。最近的单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究表明，这些脂肪祖细胞（APC）种群（ASC和前细胞）表现出大量的分子和功能异质性7，8，9，10，11，12。例如，与前极细胞7相比，ASC在表现出低致病性分化能力的同时，也表现出更高的增殖和扩张能力。在ASC和前细胞群中报告了进一步的分子差异，尽管这些差异的功能相关性仍不清楚7。这些数据共同突出了脂肪祖细胞库的复杂性，并强调了开发和标准化工具以更好地了解和操纵这些关键细胞群的必要性。
该协议详细说明了高存活率Sca1+脂肪祖细胞群与小鼠表皮脂肪垫的分离，这些脂肪垫适合敏感的下游分析，包括单细胞研究（scRNA测序）和细胞培养。表皮脂肪垫的分离和分离按照先前描述的7，13进行，稍作修改，改善孤立的APC的可行性。简言之，表皮脂肪垫上的分离细胞沾染了对Sca1的抗体，Sca1是ASC和前细胞6、7和其他血统（林）标记的标记：Ter119（红细胞）、CD31（内皮细胞）和CD45（白细胞）。可行的 Sca1+/ Ter119-/CD31-/CD45-/DAPI-细胞然后通过荧光激活细胞排序 （FACS） 进行排序。重要的是，在最近的单细胞RNA测序研究中，成功分离和分析可行的Sca1+/Lin-脂肪祖细胞，确定了ASC和前细胞7中的功能异质亚群，验证了这一协议。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物实验程序均经梅奥诊所机构动物护理和使用委员会批准。
1. 解决方案准备
- 通过溶解拼贴酶 II 2 g 在 100 mL 汉克斯的平衡盐溶液 （HBSS） 中准备拼贴酶 2% （w/v） 溶液。每次使用均报价200μL。
- 混合84毫升F-12介质、15毫升马血清和1毫升青霉素/链霉素，制备中和介质。
- 通过溶解 500 毫克牛血清白蛋白 （BSA） 和 400 μL 的 0.5 M EDTA 在 100 mL 杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中准备流细胞学缓冲。
2. 表皮脂肪垫解剖和组织分离
- 人道安乐死（异体/颈椎错位）一只雄性小鼠。在此协议中，使用了一个四个月大的 FVB 鼠标。
- 在腹部涂抹/喷洒 70% 乙醇，使用干净的剪刀和钳子暴露下腹腔。
- 定位表皮脂肪垫（近似/附着在睾丸上）。用钝力握住睾丸和表皮脂肪垫之间的交界处，轻轻拉动以解放表皮脂肪垫。
- 使用剪刀切割睾丸，在 5 mL 的 HBSS 中孵育表皮脂肪垫，在室温下在 50 mL 圆锥管中补充 3% BSA 15 分钟。
- 离心机在150 x g 7分钟在4°C。
- 从 50 mL 圆锥管中取出漂浮的表皮脂肪垫，用干净的剪刀细碎组织。
- 在 13 mL 培养管中将 200μL 拼贴酶 2% 溶液添加到 3.8 mL 的 HBSS 中。加入切碎的组织，在 5 rpm 旋转孵化器中孵化，在 37 °C 下为 1 小时。 37 °C 的细胞培养孵化器可以偶尔搅拌使用，而不是旋转孵化器。
- 将整个内容传输到 50 mL 圆锥管中，并添加 10 mL 的中和介质。通过倒置管 2-3 次轻轻混合。
- 再准备一个装有70μm细胞过滤器的50mL圆锥管。使用细胞过滤器将消化的组织过滤到新管中。
- 在 4 °C 下将流经传输到 15 mL 圆锥管和离心机，在 350 x g 下传输 10 分钟。
- 小心地删除超纳坦和重新悬浮的细胞颗粒与5 mL的DPBS。离心机在350 x g 10分钟在4°C。
- 小心地删除超纳坦，并添加 50 μL 的流细胞学缓冲区。轻轻吹笛，将细胞放在冰上，混合好。由于细胞颗粒的体积和少量的残余超常剂，流细胞学缓冲区中的细胞总体积将大于 50 μL（约 100 μL）。
3. 抗体标记和荧光激活细胞分拣 （FACS）
- 将细胞与温和的管道混合后，将54μL的细胞悬架转移到1.7 mL微中心管中。加入 6 μL 的 FcR 阻塞试剂，轻轻吹笛混合。在4°C下孵化10分钟。服用 54 μL 后保存任何剩余的细胞，并将它们保存在冰中，作为第 3.5 步和第 3.6 步的未染色控制。
- 在步骤 3.1 的孵化过程中，通过在微中心管中结合 11 μL 的抗 Sca1-APC、抗 Ter119-FITC、抗 CD31-FITC 和抗 CD45-FITC 抗体，制备抗体鸡尾酒。通过温和的管道混合好，并保持在冰上保护免受光线。
- 用 FcR 阻断试剂孵育 10 分钟后，加入 40 μL 的抗体鸡尾酒，通过温和的管道混合。在4°C下孵化10分钟。
- 添加 500 μL 的流细胞学缓冲区，并辅以 1 μg/mL 的 DAPI 进入染色细胞。使用带细胞滤光器扣盖的 5 mL 试管，通过温和的管道和过滤细胞很好地混合。将细胞放在冰上。
- 在步骤 3.1 中将 500μL 的流细胞学缓冲器添加到剩余的细胞中，并通过温和的管道很好地混合。使用带细胞滤光片捕捉帽的 5 mL 试管过滤细胞。将这些细胞保持在冰上，并在下一步用作未染色的控制。
- 将染色细胞和未染色控制带到 FACS 分析或分拣仪器中。
- 识别和隔离 APC+/ FITC-/ DAPI-人口与图 1中显示的量子策略。这些细胞代表可行的Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45-细胞。使用前向 （FSC） 和侧散射 （SSC） 图耗尽碎片和细胞聚合物。然后，DAPI-人口是封闭的，然后是APC+/FITC-人口的门控化。应使用未染色的控件来帮助设置界点参数。
- 在 1.5 mL 微中心管中将细胞收集到 500μL 的流动细胞学缓冲液中。今后，所有程序都应在无菌条件下进行，以尽量减少污染。大约50，000-100，000个细胞从一只小鼠身上收集。
- 使用血细胞计计算细胞以评估细胞存活率。由于细胞聚合可以干扰进一步的下游分析，也评估细胞聚合的存在，以确保这些聚合物的最低存在（+lt;5%的可行细胞数）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这个实验使用了四个月大的雄性FVB小鼠。在排除使用FSC/SSC地块的碎片和双胞胎后，对可行的细胞（DAPI- 人口）进行了封闭，随后选择了APC+/FITC- 人口（图1）。DAPI、APC 和 FITC 门是根据未染色的控制绘制的。在 图 1中显示的量化策略。
经过1小时的排序，通过流细胞学分析（图2，3）对隔离质量进行了定量评价。细胞被碘化铀溶液（1：100）染色，用于生存性染色。使用相同的量子进行分拣，细胞保持了较高的生存能力和纯度：92.6±2.2%的单细胞（图2中的第三面板）、86.4±3.0%的可行性（PI-细胞）和86.0±2.8%的APC+/FITC-细胞（n= 4，平均±标准偏差）。这些百分比被定义为每个封闭人口（单细胞、PI-细胞和 PI-/APC+/FITC-人口百分比，分别在图 2中）相对于总细胞数。
图1：通过FACS分离可行的Sca1+ 脂肪祖细胞单细胞。 在染色细胞和未染色控制下显示盖廷策略。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：代表性流细胞学分析，以评估隔离后细胞的生存能力。 使用碘化铀进行活性染色。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：流细胞学分析中细胞1小时后分离百分比的量化。 单细胞、活细胞和 APC+/FITC- 细胞的百分比被量化，以评估细胞分离后的纯度和可行性。显示的数据表示平均±标准偏差。n=4. 请点击这里查看此数字的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
单细胞RNA测序（scRNA-seq）作为同时研究单细胞水平不同细胞群的有力工具，正迅速获得牵引力。由于样品制备成本高，吞吐量测序高，因此必须优化蜂窝输入（高可行性和纯度），以提高实验成功的可能性。一些细胞制备方案依赖于使用低旋转洗涤和基于柱的分离去除死细胞和碎片，而没有FACS分类14。然而，许多这些方法大大减少了存活的恢复细胞的数量，在许多情况下，死细胞并没有完全被切除14个。该协议概述了一个简单的方法来分离高度可行的Sca1+ 脂肪祖细胞含有最小的细胞碎片，细胞双胞胎和死细胞。虽然使用此协议分离的细胞具有很高的生存能力，但我们仍然建议将细胞分离和进一步下游分析之间的时间最小化，以保持较高的生存能力。此外，成功的抗体标记对于分离具有高纯度的Sca1+脂肪祖细胞至关重要。因此，强烈建议确定每个抗体的最佳浓度，并可以相应地调整第3.2步中的抗体稀释。
此基于流细胞学的协议是适应定制，这取决于个人对特定脂肪祖细胞子群的兴趣。在这里，替代抗体组合可用于识别和隔离感兴趣的人口。事实上，由于广泛的 APC 标记多样性，多个实验室使用 scRNA-seq 报告使用其他表面标记分离细胞来研究 APC。例如，PDGFRA+/CD44+细胞，CD31-/CD45-/Ter119-/CD29+/CD34+/Sca1+细胞，Pdgfrb+细胞已被 FACS 分离，用于下游 APC scRNA-seq 分析8、9、11。CD142+亚人口也已的特点，并显示表现出有限的致波分化能力和抑制脂肪生成10，11的能力。除Sca1外，最近还利用CD55、CD81和CD9的抗体组合，对ASC和前细胞亚群（使用本协议）进行前瞻性分离，研究亚人口分子和功能异质性7。此外，由于其他脂肪垫（包括脂肪垫和棕色脂肪组织）的脂肪祖细胞已经像现行协议15、16、17一样，使用拼贴酶分离分离，本协议可能适用于从其他脂肪组织中分离脂肪祖细胞。
目前方法的一个警告是，它是为孤立不成熟的APC而量身定做的。虽然本协议产生高生存能力的ACC，但其他脂肪组织常驻细胞类型（即免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞等）的分离效果和效率尚不清楚。重要的是，此协议不适合分离成熟的脂肪细胞。由于脂肪细胞的细胞大小大且脆弱，因此很难用FACS分离。最近，FACS的成熟脂肪细胞的分离报告使用大喷嘴大小（150μm）和低护套压力（6 psi）与特定的FSC/SSC门治策略18.未来的研究或许可以将这种脂肪细胞分离协议与此处描述的协议合并，以建立一个更全面的管道来分离和研究脂肪组织内的不同细胞类型。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们确认梅奥诊所显微镜细胞分析核心流细胞学设施，以协助FACS分拣。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | VWR | 87003-294 | |
| 13 mL culture tube | Thermo Fisher Scientific | 50-809-216 | |
| 15 mL conical tube | Greiner Bio-one | 188 271 | |
| 5 mL test tube with cell strainer snap cap | Thermo Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 50 mL conical tube | Greiner Bio-one | 227 261 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Anti-CD31-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-519 | |
| Anti-CD45-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-491 | |
| Anti-Sca1-APC antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-833 | |
| Anti-Ter119-FITC antibody | Miltenyi Biotec | 130-112-908 | |
| BSA | Gold Biotechnology | A-420-500 | |
| Collagenase type II | Thermo Fisher Scientific | 17101-015 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | |
| F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Propidium iodide solution | Miltenyi Biotec | 130-093-233 |
References
- Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution. The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).
- Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).
- Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).
- Halberg, N., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue. Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).
- Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C.
- Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).
- Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling. Life Science Alliance. 2, 201900561 (2019).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. eLife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364, 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559, 103-108 (2018).
- Raajendiran, A., et al. Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues. Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).
- De Matteis, R., et al. In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells. Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).
- Hanamsagar, R., et al. An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples. Scientific Reports. 10, 2219 (2020).
- Marinovic, M. P., et al. Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice. Scientific Reports. 8, 5057 (2018).
- Takahashi, H., et al. Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair. Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).
- Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
- Hagberg, C. E., et al. Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity. Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).
