Bewertung der regionalen Lungenabscheidung mit patientenspezifischen 3D-gedruckten Lungenmodellen

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein hochdurchlässiges In-vitro-Verfahren zur Quantifizierung der regionalen Lungenabscheidung auf Lappenebene mit CT-Scan-abgeleiteten, 3D-gedruckten Lungenmodellen mit abstimmbaren Luftstromprofilen.

Zusammenfassung

Die Entwicklung gezielter Therapien für Lungenerkrankungen wird durch die Verfügbarkeit präklinischer Testmethoden mit der Fähigkeit, die regionale Aerosolabgabe vorherzusagen, eingeschränkt. Mithilfe des 3D-Drucks zur Generierung patientenspezifischer Lungenmodelle skizzieren wir das Design eines hochdurchsatzigen In-vitro-Experimentalaufbaus zur Quantifizierung der lobularen Lungenablagerung. Dieses System besteht aus einer Kombination aus handelsüblichen und 3D-gedruckten Komponenten und ermöglicht die unabhängige Steuerung des Durchflusses durch jeden Lungenlappen. Die Lieferung von fluoreszierenden Aerosolen an jeden Lappen wird mittels Fluoreszenzmikroskopie gemessen. Dieses Protokoll hat das Potenzial, das Wachstum der personalisierten Medizin für Atemwegserkrankungen durch seine Fähigkeit zu fördern, eine breite Palette von Patienten demografien und Krankheitszuständen zu modellieren. Sowohl die Geometrie des 3D-gedruckten Lungenmodells als auch die Einstellung des Luftstromprofils können einfach moduliert werden, um klinische Daten für Patienten mit unterschiedlichem Alter, Rasse und Geschlecht widerzuspiegeln. Klinisch relevante Arzneimittelabgabegeräte, wie z. B. die hier gezeigte Endotrachealröhre, können in den Testaufbau integriert werden, um die Fähigkeit eines Geräts, die therapeutische Abgabe auf eine erkrankte Region der Lunge zu zielen, genauer vorherzusagen. Die Vielseitigkeit dieses experimentellen Setups ermöglicht es, angepasst zu werden, um eine Vielzahl von Inhalationsbedingungen widerzuspiegeln, was die Strenge der präklinischen therapeutischen Tests verbessert.

Einleitung

Viele Lungenerkrankungen wie Lungenkrebs und chronisch obstruktive Lungenerkrankungen (COPD) weisen regionale Unterschiede in den Krankheitsmerkmalen auf; Es fehlt jedoch an therapeutischen Techniken, um die Medikamentenabgabe nur in erkrankte Regionen der Lunge¹zu zielen. Mehrere Computerfluid-Dynamikmodelle (CFD) haben gezeigt, dass es möglich ist, Arzneimittelabscheidungsprofile zu modulieren, indem spezifische Stromlinien in der Lunge identifiziert werden^2,3. Die Entwicklung von Inhalatoren und Endotracheal (ET) Rohradaptern mit regionalen Targeting-Fähigkeiten ist in unserem Labor im Gange, um die Aerosolverteilung in erkrankte Lungenregionen zu kontrollieren. Die Ausweitung dieser Prinzipien auf die klinische Anwendung wird durch die derzeitige präklinische Testkapazität begrenzt. Der genaue Ort, an dem sich ein Medikament in der Lunge ablagert, ist bekanntlich der beste Prädiktor für die Wirksamkeit; jedoch werden aktuelle pharmazeutische Bewertungen von inhalierbaren Therapeutika am häufigsten mit In-vitro-in-vivo-Korrelationen der Partikelgröße vorhergesagt, um nur ungefähre Ablagerung⁴. Diese Technik erlaubt keine räumliche Analyse, um die Auswirkungen verschiedener Atemwegsgeometrien auf die regionale Verteilung durch die verschiedenen Lungenlappen zu bestimmen. Darüber hinaus fehlt es bei diesem Test an anatomisch genauen Lungengeometrien, die Forscher n. Chr. signifikant auf ablagerungsprofile⁵auswirken können. Es wurden einige Anstrengungen unternommen, um patientenspezifische Lungengeometrien durch Zugabe der oberen Atemwege in Testprotokolle zu integrieren; jedoch, die meisten dieser Ansätze Probe Aerosol-Lieferung an verschiedene Generationen der Lunge anstatt jeder Lungenlappen^6,7,8. Das folgende Protokoll stellt eine Methode mit hohem Durchsatz zur Generierung patientenspezifischer Lungenmodelle dar, mit der fähigkeit, die relative Partikelabscheidung in jedem der fünf Lappen der Lunge⁹zu quantifizieren.

Anatomisch genaue Modelllungen werden durch 3D-Druck-Patienten-Computertomographie (CT)-Scans erzeugt. In Verbindung mit einem leicht zu montierenden Strömungssystem können die relativen Durchflussraten durch die Lappen der Modelllunge unabhängig gesteuert und an die verschiedenen Demografischen und/oder Krankheitszustände des Patienten angepasst werden. Mit dieser Methode können Forscher die Wirksamkeit potenzieller therapeutischer Methoden in einer relevanten Lungengeometrie testen und die Leistung jeder Methode mit dem Fortschreiten der erkrankten Morphologie korrelieren. Hier werden zwei in unserem Labor entwickelte Gerätedesigns auf ihre Fähigkeit getestet, die Ablagerung in einem gewünschten Lungenlappen zu erhöhen, indem sie die Position der Aerosolfreisetzung im Mund oder in der Luftröhre steuern. Dieses Protokoll hat auch das Potenzial, die Entwicklung personalisierter Verfahren für Patienten erheblich zu beeinflussen, indem es die schnelle Vorhersage der Wirksamkeit der Behandlung in einer Modelllunge erleichtert, die für die CT-Scandaten dieses Patienten spezifisch ist.

Protokoll

1. Herstellung von 3D-gedruckten Versuchskomponenten

HINWEIS: Alle im Protokoll verwendeten Software sind in der Tabelle der Materialienangegeben. Darüber hinaus ist die verwendete Schneidesoftware spezifisch für den in der Tabelle der Materialienaufgeführten 3D-Drucker; Dieses Protokoll kann jedoch auf eine Breite von 3D-Druckern (Stereolithographie) erweitert werden.

1. Konvertieren Sie Patienten-CT-Scans in 3D-Objekte (.stl-Dateien).
   HINWEIS: Eine ausführlichere Erläuterung der geometrischen Merkmale des spezifischen Lungenmodells, das in diesen Studien verwendet wird, finden Sie unter Feng et al.⁵.
   1. Render-CT-Scans in ein 3D-Objekt mithilfe der CT-Scansoftware (siehe Tabelle der Materialien). Öffnen Sie den CT-Scan und erstellen Sie eine Maske im Luftraum mit dem Werkzeug Schwellenwert mit einer Einstellung im Bereich von -800 bis -1000. Zeigen Sie mit dem Werkzeug 3D-Vorschau das 3D-Rendering an und exportieren Sie das Objekt (Datei | Exportieren) als .stl-Datei.
   2. Importieren der Dateien in Netzbearbeitungssoftware (siehe Tabelle der Materialien), entfernen Sie alle gezackten Features mit dem Werkzeug Auswählen (Sculpt | Bürsten: "Shrink/Smooth" | Eigenschaften: Stärke (50), Größe (10), Tiefe(0)). Glätten Sie die Oberfläche (Strg+A | Verformung | Glatte | Glättung (0,2), Glättungsskala (1)).
   3. Erweitern Sie in der Mesh-Bearbeitungssoftware die Wand dieser Objekte um 2 mm (Strg+A | Bearbeiten | Offset) und lassen Sie das innere Objekt hohl bleiben, so dass nur die Wand bleibt. Slice des Objekts(wählen Sie | Bearbeiten | Plane Cut) an der Luftröhre, um einen Einlass zu bilden, und bei den Generationen 2 oder 3, wo das Objekt zu jedem Lappen abzweigt, um Auslässe zu erstellen (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Die Dicke von 2 mm wurde auf der Grundlage der vom Hersteller des in der Materialtabelleaufgeführten zulässigen Merkmalsgrößen ausgewählt. Diese Dicke kann auf der Grundlage der Spezifikationen des verfügbaren 3D-Druckers angepasst werden, wenn die Innengeometrie des Modells beibehalten wird.
2. Ändern Sie die In-Blatt-Auslassgeometrien des Patienten, um mit zuvor entworfenen Lappenauslasskappenkomponenten kompatibel zu sein(Abbildung 1B,C), die in der Tabelle der Materialienaufgeführt sind.
   1. Importieren Sie das 3D-Objekt, das den CT-Scan auf der Innenseite repliziert, eine Wandstärke von 2 mm hat und an ein- und auslässen Öffnungen offen ist, in 3D-Modellierungssoftware (siehe Tabelle der Materialien) als Solid Body ( Open| Mesh-Dateien | Optionen | Solid Body).
   2. Erstellen Sie eine Ebene basierend auf einer Fläche an jeder Derener Auslässe(Einfügen | Referenzgeometrie | Flugzeug). Verfolgen Sie mit dem Spleißwerkzeug die Innen- und Außenwand des Auslasses in einer Skizze auf der Ebene(Sketch | Spline).
   3. Loft einen Zylinder (OD 18,5 mm, ID 12,5 mm, H 15,15 mm), um die Innen- und Außenwand des Modells zu verbinden, wodurch der Auslass gleichmäßig an jedem Lappen(Merkmale | Lofted Boss/Base). Fügen Sie eine Kerbe um den Rand des Auslasses hinzu, um mit der Kappe zu entsprechen(Features | Extrudierte schnitt| Offset).
      HINWEIS: Die Kappe (Abbildung 1D) ist ein Hohlzylinder, der den Abmessungen der Auslässe entspricht und über ein Regal verfügt, das sich mit der Kerbe des Modellauslasses verbindet. Ein Ende der Kappe ist so blockiert, dass die ID kleiner als der Rest des Teils ist, dies sorgt für eine enge Passform um den Stachelschlauchanschluss (Abbildung 1E). Die Stachelschlauchverbindung ist eine Stachelkegelform, so dass das Grillen durch die Öffnung der Kappe passt, aber der Rest des Teils nicht, so dass der Schlauchanschluss sicher in die Kappe passen kann. Somit passt die Kappe sowohl um den Stachelschlauchanschluss als auch um das Lungenmodell (Abbildung 1F,G).
   4. Ändern Sie den Einlass des Lungenmodells in Abhängigkeit von den gewünschten experimentellen Bedingungen. Die Hals- und Glottalregionen können einbezogen werden, um einen Patienten nachzuahmen, der alleine atmen kann (Abbildung 1B). Regionen oberhalb der Luftröhre können mit einem extrudierten Schnitt entfernt werden, um einen intubierten Patienten auf Beatmungsunterstützung nachzuahmen(Features | Extrudierter Schnitt) (Abbildung 1C).
3. Orientieren und unterstützen Sie experimentelle Komponenten in der Schneidsoftware des 3D-Druckerherstellers.
   1. Importieren Sie 3D-Teiledateien in die 3D-Drucker-Schneidsoftware und wählen Sie das entsprechende Harz aus. Verwenden Sie ein hartes Harz, um die Lungenmodelle und Stachelschlauchanschlüsse zu drucken, und ein weiches Harz, um die Kappen zu drucken.
      HINWEIS: Das Harz, das zum Drucken der Kappen verwendet wird, muss elastische Eigenschaften aufweisen, damit es sich über den Lappenauslass erstrecken und eine luftdichte Dichtung erzeugen kann.
   2. Legen Sie die Bauteilausrichtung so fest, dass alle "Inseln" und unerfindeten Volumes minimiert werden. Die beste Orientierung für die Lungenmodelle ist mit den Lappenauslässen, die von der Druckplattform weggerichtet sind. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Stachelschlauchanschlüsse als auch die Kappen die breiteren Teile zur Druckplattform weisen.
      HINWEIS: Einzelne Slices können angezeigt werden, um das Erscheinungsbild von "Inseln" zu überprüfen, Abschnitte des Teils, die zuerst in einem Slice angezeigt werden, ohne mit dem Hauptteil des Teils verbunden zu sein. Die Überprüfungsfunktion kann verwendet werden, um nach Scheiben mit unerfindlichen Volumina zu suchen, Bereiche, in denen ungehärtetes Harz während des Drucks im Teil gefangen werden kann. Sowohl "Inseln" als auch unerfindte Volumina verringern die Druckqualität und können zu Druckfehlern führen.
   3. Betrachten Sie jedes Slice einzeln, fügen Sie Unterstützungen zu allen verbleibenden "Inseln" im Teil sowie alle Bereiche mit erheblichen Überhängen hinzu. Exportieren und Anzeigen der Slices für den Druck, um sicherzustellen, dass alle Bereiche ordnungsgemäß unterstützt werden.
4. Drucken Sie experimentelle Komponenten und führen Sie eine nachtränise Nachbearbeitung gemäß den Anweisungen des Herstellers aus.
   HINWEIS: Alle unten beschriebenen Nachbearbeitungsschritte sind spezifisch für den 3D-Drucker, der in der Tabelle der Materialienaufgeführt ist. Wenn Sie alternative Drucker oder Materialien verwenden, passen Sie diese Schritte an die Herstelleranweisungen an.
   1. Für Teile, die in Weichharz gedruckt werden, mit ≥99% Reinheit Isopropylalkohol (IPA) waschen, um überschüssiges ungehärtetes Harz und thermische Aushärtung in einem Konvektionsofen für 8 h gemäß Herstellerspezifikationen zu entfernen.
      HINWEIS: Teile, die in weichem Harz gedruckt werden, können unmittelbar nach dem Druck sehr empfindlich sein, daher sollte bei den Reinigungsschritten besondere Vorsicht geboten sein. Die Exposition gegenüber IPA sollte unter der Lösungsmittelexpositionsgrenze des Materials gehalten werden, um einen Teilabbau zu verhindern.
   2. Für Teile, die in Hartharz gedruckt werden, mit IPA waschen, um überschüssiges ungehärtetes Harz zu entfernen und im UV-Ofen (365 nm Licht bei 5-10 mW/cm²⁾für 1 min pro Seite auszuhärten.
      ANMERKUNG: Um die Genauigkeit des 3D-gedruckten Replikats zu bewerten, wird empfohlen, das gedruckte Teil und die CT-Scansoftware mit dem Scan-Gerät "CT" zu vergleichen, um quantitativ Variationen zwischen dem ursprünglichen 3D-Rendering und dem 3D-gedruckten Replikat zu vergleichen.

2. Montage des Schlauchsystems zur Durchflussregelung

1. Schraube 1/4" Stachelrohrbeschläge in die Seite des Verteilers mit 6 Anschlüssen (Abbildung 2A-6) und einem 3/8" Stachelrohr, das in den verbleibenden Anschluss passt.
2. 1/4" Schläuche auf die gewünschte Länge schneiden und in jedes Ende der Push-to-Connect-Ventile einfügen (Abbildung 2A-5). Befestigen Sie jedes Ventil an einem der 1/4" Armaturen, die in den Verteiler eingesetzt sind.
3. Schließen Sie einen Durchflussmesser(Abbildung 2A-4) an das andere Ende jedes Ventils an.
4. Positionieren Sie das Schlauchsystem auf dem Holzbrett so, dass die einzelne 3/8"-Befestigung des Verteilers am Rand des Brettes vorbeireicht. Um an Ort und Stelle zu sichern, fügen Sie zwei Schrauben an der Seite des Holzbrettes und befestigen Sie den Verteiler an den Schrauben mit Draht.
5. Fügen Sie vier Schrauben um jedes der Ventile und Durchflussmesser positioniert und verwenden Draht, um jede von ihnen auf der Holzplatte zu sichern(Abbildung 2E).
6. Schließen Sie den Verteiler mit ca. 6" 3/8" ID-Schläuchen an einen Inline-Vakuumfilter mit einer Porengröße an. Schließen Sie das andere Ende des Filters mit einem weiteren 6" von 3/8" ID-Schläuchen an den Durchflussregler an.
   HINWEIS: Das Schlauchsystem muss nur einmal montiert werden.

3. Montage von Lappenauslasskappen mit Patienten-Lungenmodell

HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls muss vor jedem Versuchslauf abgeschlossen werden.

1. Legen Sie einen Stachelschlauchanschluss in die Kappe ein, wobei die Düse durch die Öffnung in der Kappenbasis herausragt. Legen Sie zunächst ein Ende der ovalen Stachelschlauchanschlussbasis in die Kappe ein. Dann strecken Sie vorsichtig die flexible Kappe über das andere Ende der ovalen Basis, wobei Sie besonders darauf achten, die dünne Basis nicht zu knacken.
   HINWEIS: Neu gedruckte Kappen können steifer als gewünscht sein und durch Zweifinger entlang des Kappeninnenraums ausgestreckt werden.
2. Schneiden Sie 10 m Filterpapier so ab, dass es etwas größer als die Auslassfläche ist. Falten Sie das Filterpapier über den Lappenauslass und halten Sie es mit einer Hand an Ort und Stelle.
3. Mit der anderen Hand verwenden Pinzette, um die Kappe mit StachelschlauchAnschluss über den Ausgang zu dehnen. Drücken Sie die Kappe nach unten, bis die Kerbe der Kappe mit der entsprechenden Kerbe am Lappenauslass übereinstimmt (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Das Rippen des Filterpapiers in diesem Schritt kann die Ergebnisse ungültig machen, daher sollte besonders darauf geachtet werden, übermäßige Kraft beim Drücken der Kappe auf den Auslass zu vermeiden.
4. Wiederholen Sie dies für alle verbleibenden Lappenauslässe (Abbildung 2D).

4. Erstellung eines klinisch relevanten Luftstromprofils

HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls muss vor jedem Versuchslauf abgeschlossen werden.

1. Schließen Sie jeden Lungenmodell-Lappenauslass an die Schläuche des entsprechenden Durchflussmessers und Ventils an, wobei darauf zu achten ist, dass der Stachelschlauchanschluss nicht zu viel Seitendruck aufgebracht wird. Befestigen Sie den elektronischen Durchflussmesser am Mundeinlass des Lungenmodells, um den Gesamtluftdurchfluss an das Lungenmodell zu messen.
2. Einschalten des Durchflussreglers (Abbildung 2A-7) und der Vakuumpumpe (Abbildung 2A-8). Wählen Sie die Einstellung"Test-Setup" auf dem Durchflussregler aus und erhöhen Sie langsam den Durchfluss, bis der elektronische Durchflussmesser die gewünschte Gesamtdurchflussrate anzeigt.
3. Passen Sie mit den Ventilen (Abbildung 2E-5 )die Durchflussrate durch jeden der fünf Lungenlappen an: Rechts oben (RU), Rechte Mitte (RM), Rechts unten (RL), Links oben (LU) und Links unten (LL). Sobald die auf den Durchflussmessern(Abbildung 2E-4) angezeigten Lappendurchflussraten stabil beim gewünschten Wert sind, überprüfen Sie den Gesamtdurchfluss auf dem elektronischen Durchflussmesser erneut, um sicherzustellen, dass es keine Leckagen im System gibt.
   1. Wenn eine Diskrepanz in der Gesamtdurchflussmenge besteht, senken Sie die Durchflussrate mit dem Durchflussregler, stellen Sie alle Ventile auf die vollständig geöffnete Konfiguration ein, und wiederholen Sie die Schritte 4.2 und 4.3.
      ANMERKUNG: Die hier vorgestellten Ergebnisse wurden anhand von Luftstromprofilen auf der Grundlage von Daten von Sul et al.¹⁰ diese Lobar-Flow-Fraktionen wurden anhand von dünngeschnittenen Computertomographiebildern der Patientenlunge bei voller Inspiration und Ablauf berechnet, wobei die relativen Veränderungen im Volumen jedes Lungenlappens verglichen wurden. Die Ergebnisse werden für zwei unterschiedliche Strömungsbedingungen dargestellt, beide mit einer Gesamtdurchflussrate von 1 l/min. Das gesunde Lungenlappen-Auslaufprofil wird um den folgenden Prozentsatz des Einlassflusses auf jeden Auslass verteilt: LL-23,7%, LU-23,7%, RL-18,7%, RM-14,0%, RU-20,3%. Das COPD-Lappenaustrittsprofil wird zwischen den einzelnen Auslassstellen um den folgenden Prozentsatz des Einlassflusses verteilt: LL-10,0%, LU-29,0%, RL-13,0%, RM-5,0%, RU-43,0%^9,10.
4. Beenden Sie die "Test-Setup"-Funktiondes Durchflussreglers, lassen Sie die Vakuumpumpe jedoch eingeschaltet.
   HINWEIS: Das Ausschalten der Vakuumpumpe zwischen der Einstellung der Durchflussraten und das Durchführen des Abscheidungsexperiments kann zu Ungenauigkeiten im erzeugten Durchflussprofil führen. Es wird empfohlen, die Vakuumpumpe eingeschaltet zu lassen, sobald die gewünschten Durchflussraten eingestellt sind, um die Aerosolabscheidungsprüfung abzuschließen.

5. Lieferung von Aerosol an das Lungenmodell

HINWEIS: Experimente müssen in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden, wobei der Flügel geschlossen ist, um die Exposition gegenüber Aerosolen, die vom Vernebler erzeugt werden, zu minimieren.

1. Füllen Sie den Vernebler mit lösungsweise der gewünschten fluoreszierenden Partikel (Abbildung 2A-1) und verbinden Sie sich mit dem Lungenmodelleinlass ( Abbildung2B).
   ANMERKUNG: Die hier vorgestellten Ergebnisse wurden mit 30 ml einer 1:100 Verdünnung von fluoreszierenden Polystyrolpartikeln in Methanol von 1 m gewonnen.
   1. Um den Versuchsaufbau zu validieren, verbinden Sie den Vernebler direkt mit dem Einlass des Lungenmodells ohne Zielgerät.
   2. Um die Wirksamkeit eines Zielgeräts zu messen, schließen Sie den Vernebler an das Gerät an und legen Sie das Gerät in das Lungenmodell ein.
2. Schließen Sie die Druckluftleitung an den Vernebler an und schließen Sie die Dunstabzugshaube so weit wie möglich.
3. Legen Sie den Flow-Controller so fest, dass er für eine 10-s-Testversion ausgeführt wird. Öffnen Sie vor dem Pressstart das Druckluftventil leicht, um ein Aerosol im Vernebler zu erzeugen.
4. Drücken Sie den Start auf dem Durchflussregler und öffnen Sie das Druckluftventil sofort vollständig. Sobald der Durchflussregler etwa 9 s erreicht, beginnen Sie, das Druckluftventil zu schließen.
5. Sobald das Druckluftventil vollständig geschlossen ist, trennen Sie den Vernebler von der Druckluftleitung, schließen Sie den Dunstabzugshaube vollständig, schließen Sie die Vakuumpumpe ab und lassen Sie Aerosole ca. 10 min von der Dunstabzugshaube räumen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Vakuumpumpe nach Abschluss eines Durchlaufs abzuschalten, um zu verhindern, dass sich ein Vakuum im Rohrsystem aufbaut.
6. Nachdem Sie auf eine ausreichende Zeit gewartet haben, trennen Sie das Lungenmodell vom Schlauchsystem, wobei Sie besonders darauf achten, die Stachelschlauchanschlüsse nicht zu knacken.
7. Entfernen Sie die Lappenauslasskappen, indem Sie eine Pinzette unter den Rand der Kappe laufen lassen und sanft vom Lungenmodell abheben.
8. Entfernen Sie das Filterpapier von der Kappe und legen Sie es in eine 24 Wellplatte mit der Seite, auf der sich Partikel auf der Unterseite der Bohrung der Platte abgelagert. Wiederholen Sie dies für die verbleibenden Auslässe und beschriften Sie den Brunnen, der jedem Lappen entspricht.
   HINWEIS: Um zu verhindern, dass sich restliche Partikelablagerungen auf nachfolgende Experimente auswirken, ist es wichtig, sowohl das Lungenmodell als auch die Kappenkomponenten mit IPA oder geeignetem Lösungsmittel zwischen den Durchläufen zu spülen. Dies kann nach Belieben gesammelt und in die Analyse einbezogen werden. Darüber hinaus wird ein Protokoll geführt, um sicherzustellen, dass alle verwendeten Replikate minimal IPA ausgesetzt wurden, um die Teileintegrität aufrechtzuerhalten, und die Überprüfung visueller Teile wird vor der Verwendung empfohlen.

6. Auslassfilter Papier Bildgebung

1. Legen Sie die Wellplatte in das digitale Fluoreszenzmikroskop und stellen Sie das Mikroskop auf die 4-fache Vergrößerung und den entsprechenden Fluoreszenzkanal ein.
2. Identifizieren Sie visuell, welches Lappenfilterpapier die höchste Menge an Partikelabscheidung hat, und verwenden Sie die Funktion"Auto Expose". Beachten Sie die resultierenden Belichtungs- und Integrationszeitwerte.
3. Wenden Sie diese Belichtung auf alle Filter für den Durchlauf an, und bewerten Sie, ob die Einstellung ein zufriedenstellendes Bild für alle hochabscheidungsbereiche der Filter erzeugt.
   HINWEIS: Fokuseinstellungen können von Filter zu Filter geändert werden; Alle Filter für einen bestimmten Durchlauf müssen jedoch mit den gleichen Belichtungseinstellungen analysiert werden. Es ist nur möglich, jeweils einen Fokusrahmen zu haben, so dass Biegungen oder Risse im Filterpapier verhindern können, dass alle abgelagerten Partikel in der Ansicht im Fokus stehen. Dies kann vermieden werden, indem sichergestellt wird, dass das Filterpapier flach gegenüber der Unterseite der Brunnenplatte ist.
4. Nehmen Sie mindestens drei Bilder des Filterpapiers jedes Lappens an zufälligen Stellen auf und speichern Sie sie als .tiff Dateien.

7. Quantifizierung der Partikelabscheidung

1. Importieren Sie alle Filterpapierbilder für einen bestimmten Lauf in eine ImageJ-Sitzung.
2. Ändern Sie den Typ jedes Bildes in 8-Bit, indem Sie Bild | Typ | 8-Bit.
3. Öffnen Sie das Bild mit der höchsten Fluoreszenz und wählen Sie Bild | Anpassen | Schwellenwert zum Öffnen eines Schwellenwertfensters. Passen Sie die Schwellenwerte an, um das Hintergrundsignal aus dem Filterpapier zu minimieren und die Kanten von Partikeln klar zu definieren. Siehe Abbildung 3 für Darstellungen von Schwellenwerten von guter und schlechter Qualität.
   HINWEIS: Bei Filtern mit hoher Ablagerung kann eine "Corona" der Fluoreszenz, die durch die Beugung des Lichts durch die Filterpapierfasern verursacht wird, um große Gruppen von Partikeln beobachtet werden. Wenn diese Bilder vor gegeben werden, zeigt ein zu großer Bereich kleine Punkte oder "federähnliche" Formen um diese Gruppierungen an, wie in den "armen" Schwellenwertbildern in Abbildung 3beobachtet wird. Dies kann verbessert werden, indem die untere Grenze des Schwellenwerts schrittweise erhöht wird, bis das Signal der Filterpapierfasern minimiert wird, ohne das Signal der Partikel selbst zu verdecken.
4. Propagieren Sie die Schwellenwerteinstellungen für das höchste Fluoreszenzbild an alle anderen Bilder.
5. Quantifizieren Sie die Anzahl der Partikel und die gesamte Fluoreszenzfläche, indem Sie analysieren | Analysieren von Partikeln.
   HINWEIS: Datensätze werden mit Sidaks Multiple Comparisons Test und einer zweiseitig angelegten ANOVA verglichen. Darüber hinaus wird die Ablagerung in nur dem Lappen von Interesse mit einem Student T-Test unter der Annahme gleicher Varianz verglichen.

Ergebnisse

Partikel in diesem Größenbereich (1-5 m) und Strömungsbedingungen (1-10 l/min) folgen den Strömungslinien, die sowohl auf ihrer theoretischen Stokes-Zahl als auch auf in-vivo-Daten basieren; Daher wird erwartet, dass sich in Ermangelung eines gezielten Abgabegeräts freigesetzte Partikel entsprechend dem Prozentsatz des gesamten Luftstroms ablagern, der zu jedem Lappen umgeleitet wird. Die relativen Mengen der Partikelzufuhr zu jedem Lappen können dann mit den Daten der klinischen Lappendurchflussrate verglichen werden, d...

Diskussion

Das aktuelle hochmoderne Gerät zur pulmonalen pharmazeutischen Prüfung einer vollständigen Inhalationsdosis ist der Next Generator Impactor (NGI), der den aerodynamischen Durchmesser eines Aerosols⁴misst. Diese Größendaten werden dann verwendet, um die Lungengeneration vorherzusagen, bei der sich das Aerosol auf der Grundlage einer Korrelation ablagern wird, die für ein gesundes erwachsenes Männchen entwickelt wurde¹¹. Leider ist diese Methode in ihrer Fähigkeit eingeschrän...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1/4" Kunststoff-Stachelrohrverschraubung	McMaster Carr	5372K111
10 um Filterpapier	Fisher	1093-110 1um
fluoreszierende Polystyrolpartikel	Polysciences	15702-10 1um
nicht fluoreszierende Polystyrolpartikel	Polysciences	8226
2-Propanol	Fisher	A516-4	Bezogen im Protokoll als "IPA"
3/8" Kunststoff-Stachelrohrverschraubung	McMaster Carr	5372K117
Luftmassenmesser (1 - 280 mL/min)	McMaster Carr	41695K32	Im Protokoll als "Durchflussmesser" bezeichnetCarbon
M1 3D-Drucker	Carbon 3D		https://www.carbon3d.com/, Zugehörige Software, die im Protokoll als "Slicing-Software" bezeichnet
wirdCollison Jet-Vernebler	CH Technologies	ARGCNB0008 (CN-25)	6 Jet MRE-Stil horizontale Kollision mit Glasgefäß, im Protokoll als "Vernebler" bezeichnet, http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf
Konvektionsofen	Yamato	DKN602
Copley Kritischer Durchflussregler TPK2000 Reve 120V	MSP Corp	0001-01-9810	Im Protokoll als "Durchflussregler" bezeichnet
Copley Hochleistungspumpe Modell HCP5	MSP Corp	0001-01-9982	Im Protokoll als "Vakuumpumpe"
bezeichnetCytation BioTek		CYT5MPV	Multifunktionales Spektralphotometer/Fluoreszenz-Imager, ausgestattet mit 4x/20x/40x-Objektiven und DAPI/GFP/TexasRed Laser/Filterwürfeln
EPU40 Resin	Carbon 3D		https://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/, im Protokoll als "weiches Harz" bezeichnetFilter
für Vakuumpumpe	Whatman	6722-5000
Durchflussmesser Modell DFM 2000	MSP Corp	0001-01-8764	Im Protokoll als "elektronischer Durchflussmesser"
bezeichnetImageJ Software	ImageJ		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Inline-Luftstromregelventil (Push-to-Connect)	McMaster Carr	62005K333	Im Protokoll als "Ventil"
bezeichnetInline-Filtergeräte	Whatman	WHA67225000
Sperrholzplatte in Marinequalität	McMaster Carr	62005K333	Im Protokoll als "Holzplatte"
bezeichnetMaterialise Mimics Software	Materialise		https://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite, im Protokoll als "CT-Scan-Software"
bezeichnetMeshmixer-Software	Autodesk		http://www.meshmixer.com/, im Protokoll als "Mesh-Editing-Software"
bezeichnetMethanol	Fisher	A454-4
Opticure LED Cube	APM Technica 102843		Im Protokoll als "UV-Ofen" bezeichnet
PR25 Resin Carbon	3D		https://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate, /Im Protokoll als "Hartharz"
bezeichnetPVC-Rohr für Chemikalien	McMaster Carr	5231K161	1/4" ID
Schrauben
SolidWorks Software	Dassault Systè mes  SolidWorks Corporation		https://www.solidworks.com/, im Protokoll als "3D-Modellierungssoftware"
bezeichnetRechteckiger Verteiler mit gerader Strömung	McMaster Carr	1125T31
Schlauch zum Durchflussregler	McMaster Carr	5233K65	3/8"
ID Draht