Isolierung von Histon von Sorghum Blattgewebe für Top Down Mass Spektrometrie Profilierung von potenziellen epigenetischen Markern

Mowei Zhou; Shadan  H. Abdali; David Dilworth; Lifeng Liu; Benjamin Cole; Neha Malhan; Amir H. Ahkami; Tanya  E. Winkler; Joy Hollingsworth; Julie Sievert; Jeff Dahlberg; Robert Hutmacher; Mary Madera; Judith  A. Owiti; Kim K. Hixson; Peggy  G. Lemaux; Christer Jansson; Ljiljana Paša-Tolić

doi:10.3791/61707

Methodenartikel

Isolierung von Histon von Sorghum Blattgewebe für Top Down Mass Spektrometrie Profilierung von potenziellen epigenetischen Markern

DOI:

10.3791/61707

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4. März 2021

Mowei Zhou¹ , Shadan H. Abdali¹ , David Dilworth² , Lifeng Liu² , Benjamin Cole² , Neha Malhan¹ , Amir H. Ahkami¹ , Tanya E. Winkler¹ , Joy Hollingsworth³ , Julie Sievert³ , Jeff Dahlberg³ , Robert Hutmacher⁴^,⁵ , Mary Madera⁶ , Judith A. Owiti⁶ , Kim K. Hixson¹ , Peggy G. Lemaux⁶ , Christer Jansson¹ , Ljiljana Paša-Tolić¹

¹Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, ²DOE-Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley Laboratory, ³Kearney Agricultural Research and Extension Center, University of California Agriculture and Natural Resources, ⁴West Side Research and Extension Center, University of California, ⁵Department of Plant Sciences, University of California, Davis, ⁶Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Protokoll wurde entwickelt, um intakte Histone effektiv aus Sorghumblattmaterialien für die Profilierung von histonenposttranslationalen Modifikationen zu extrahieren, die als potenzielle epigenetische Marker dienen können, um die Konstruktion von dürreresistenten Kulturen zu unterstützen.

Zusammenfassung

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Histone gehören zu einer Familie von hochkonservierten Proteinen in Eukaryoten. Sie packen DNA als funktionelle Chromatineinheiten in Nukleosomen ein. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Histonen, die hochdynamisch sind und durch Enzyme hinzugefügt oder entfernt werden können, spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Genexpression. In Pflanzen stehen epigenetische Faktoren, einschließlich Histon-PTMs, im Zusammenhang mit ihren adaptiven Reaktionen auf die Umwelt. Das Verständnis der molekularen Mechanismen der epigenetischen Kontrolle kann beispiellose Chancen für innovative Bioengineering-Lösungen mit sich bringen. Hierin beschreiben wir ein Protokoll, um die Kerne zu isolieren und Histone aus Sorghumblattgewebe zu reinigen. Die extrahierten Histone können in ihren intakten Formen durch Top-Down-Massenspektrometrie (MS) gekoppelt mit der Online-Rektokphase (RP) Flüssigchromatographie (LC) analysiert werden. Kombinationen und Stoichiometrie mehrerer PTMs auf demselben Histonproteoform können leicht identifiziert werden. Darüber hinaus kann Histonschwanzclipping mit dem Top-Down-LC-MS-Workflow erkannt werden, wodurch das globale PTM-Profil von Kernhistonen (H4, H2A, H2B, H3) entsteht. Wir haben dieses Protokoll zuvor angewendet, um Histon-PTMs aus Sorghumblattgewebe zu profilieren, das aus einer groß angelegten Feldstudie gesammelt wurde, um epigenetische Marker der Dürreresistenz zu identifizieren. Das Protokoll könnte möglicherweise für die Chromatin-Immunpräzipationssequenzierung (ChIP-seq) oder für die Untersuchung von Histon-PTMs in ähnlichen Pflanzen angepasst und optimiert werden.

Einleitung

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Die zunehmende Schwere und Häufigkeit der Dürre dürfte sich auf die Produktivität der Getreidepflanzen^{auswirken 1}^,². Sorghum ist eine Getreidenahrungs- und Energiepflanze, die für ihre außergewöhnliche Fähigkeit bekannt ist, wasserbegrenzenden Bedingungen standzuhalten³^,⁴. Wir verfolgen ein mechanistisches Verständnis des Zusammenspiels von Dürrestress, Pflanzenentwicklung und Epigenetik von Sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] Pflanzen. Unsere bisherige Arbeit hat starke Verbindungen zwischen Pflanzen- und Rhizosphärenmikrobiom bei der Dürre....

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Protokoll

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1. Herstellung von Sorghumblattmaterial

HINWEIS: Die Sorghumpflanzen wurden im Boden auf dem Feld in Parlier, CA angebaut.

Sorghumblätter von Pflanzen in 50 ml Zentrifugenrohre sammeln und das Rohr sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren. Sammeln Sie Blattgewebe, indem Sie das dritte und vierte vollständig herausgetretene Blatt aus dem Primärfräser abreißen.
HINWEIS: Weitere Einzelheiten zu Feldzustand, Stichprobenwachstum und Sammlung finden Sie im veröffentlichten Bericht¹⁸.
Blätter mit flüssigem Stickstoff schleifen und sofort in ein Zentrifugenrohr geben.
Lagern Sie das gemahlen....

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Ergebnisse

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Nach dem Protokoll können die Histonen mit der LC-MS-Analyse extrahiert und identifiziert werden. Die Rohdaten und verarbeiteten Ergebnisse sind bei MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) über den Beitritt verfügbar: MSV000085770. Basierend auf den TopPIC-Ergebnissen aus der repräsentativen Stichprobe (auch bei MassIVE erhältlich) identifizierten wir 303 Histonproteoformen (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 und 22 H4 Proteoformen). Auch ko-gereinigte ribosomale Proteoformen wurden nachgewiesen, die typischerweise früh im LC eluieren........

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Diskussion

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Das vorgestellte Protokoll beschreibt, wie Histonen aus Sorghumblattproben (oder allgemeiner Pflanzenblatt) proben extrahiert werden. Die durchschnittliche Histonausbeute wird voraussichtlich 2–20 g pro 4–5 g Sorghumblattmaterial betragen. Die Materialien sind ausreichend rein für die nachgeschaltete Histonanalyse durch LC-MS (meist Histone mit einer ribosomalen Proteinkontamination von 20 %). Aufgrund von Stichprobenvariationen oder möglichen Fehlbehandlungen/Fehlern im gesamten Protokoll kann ein geringerer Ertrag erzi.......

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Danksagungen

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Wir danken Ronald Moore und Thomas Fillmore für die Unterstützung bei Massenspektrometrieexperimenten und Matthew Monroe für die Datenabscheidung. Diese Forschung wurde durch Stipendien des US Department of Energy (DOE) Biological and Environmental Research im Rahmen des Epigenetic Control of Drought Response in Sorghum (EPICON) Projekts unter der Nummer DE-SC0014081, vom US Department of Agriculture (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D) und über das Joint BioEnergy Institute (JBEI), eine vom DOE gesponserte Einrichtung (Vertrag DE-AC02-05CH11231) zwischen Lawrence Berkeley National Laboratory und DOE. Die Forschung wurde mit dem Environmental Molecular Sciences Laboratory ....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acetonitril	Fisher Chemical	A955-4L
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	43815-5G
EDTA, 500mM Lösung, pH 8,0	EMD Millipore Corp	324504-500mL
Ameisensäure	Thermo Scientific	28905
Guanidinhydrochlorid	Sigma	G3272-100G
MgCl₂	Sigma	M8266-100G
Kaliumphosphat, zweibasisch	Sigma	P3786-100G
Proteasehemmer Cocktail, cOmplete Tabletten	Roche	5892791001
Natriumbutyrat	Sigma	303410-5G	Verwendet für Histon-Deacetylase-Hemmer
Natriumchlorid (NaCl)	Sigma	S1888
Natrium Fluorid	Sigma	S7020-100G	Verwendet für Phosphatase-Inhibitor
Natriumorthovanadat	Sigma	450243-10G	Verwendet für Phosphatase-Inhibitor
Saccharose		Sigma S7903-5KG
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-500 g
Triton X-100	Sigma	T9284-100ML
Schwaches Kationenaustauscherharz, Netz 100-200 analytisch (BioRex70)	Bio-Rad	142-5842
Disposables
Chromatographiesäule (Bio-Spin)	BIO-RAD	732-6008
Mesh 100 Filtertuch	Millipore Sigma NY1H09000		Dies ist Teil des Sigma Kits (Katalog # CELLYTPN1) für die Extraktion von Pflanzenkernen. Ähnliche Filter mit der gleichen Maschenweite können verwendet werden.
Mikropipettenspitzen (P20, P200, P1000)	Sigma
Röhrchen, 50mL/15mL, Zentrifuge, konisch	Genesee Scientific	28-103
Röhrchen, Mikrozentrifuge, 1,5/2 mL	Sigma
Equipment
Analysenwaage	Fisher Scientific	01-912-401
Becher ( 50 ml – 2L)
Mikrozentrifuge mit Kühlung	Fisher Scientific	13-690-006
Mikropipetten
Schwingschaufelzentrifuge mit Kühlung	Fisher Scientific
Vortex	Fisher Scientific	50-728-002
Wasserbad-Ultraschallgerät	Fisher Scientific	15-336-120

Referenzen

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Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Clim....

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Histonisolation Kernreinigung Ionenaustauschchromatographie posttranslationale Modifikationen Fl ssigkeitschromatographie Proteoformanalyse Proteinentsalzung

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