MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Zusammenfassung

Die MAPS-Technologie wurde entwickelt, um das Targetom einer bestimmten regulatorischen RNA in vivo zu untersuchen. Die sRNA von Interesse ist mit einem MS2-Aptamer gekennzeichnet, das die Co-Reinigung ihrer RNA-Partner und deren Identifizierung durch RNA-Sequenzierung ermöglicht. Dieses modifizierte Protokoll eignet sich besonders für grampositive Bakterien.

Zusammenfassung

Obwohl kleine regulatorische RNAs (sRNAs) im bakteriellen Bereich des Lebens weit verbreitet sind, sind die Funktionen vieler von ihnen nach wie vor schlecht charakterisiert, insbesondere aufgrund der Schwierigkeit, ihre mRNA-Ziele zu identifizieren. Hier beschrieben wir ein modifiziertes Protokoll der MS2-Affinity Purification in Verbindung mit RNA Sequencing (MAPS) Technologie, mit dem Ziel, alle RNA-Partner einer spezifischen sRNA in vivo aufzudecken. Im Großen und Ganzen ist das MS2-Aptamer mit der 5'-Extremität der interessierenden sRNA verschmolzen. Dieses Konstrukt wird dann in vivo exprimiert, so dass die MS2-sRNA mit ihren zellulären Partnern interagieren kann. Nach der Bakterienernte werden die Zellen mechanisch lysiert. Der Rohextrakt wird in eine Amylose-basierte Chromatographiesäule geladen, die zuvor mit dem MS2-Protein beschichtet ist, das mit dem Maltose-bindenden Protein verschmolzen ist. Dies ermöglicht die spezifische Erfassung von MS2-sRNA und interagierenden RNAs. Nach der Elution werden co-gereinigte RNAs durch Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und anschließende bioinformatische Analyse identifiziert. Das folgende Protokoll wurde im grampositiven Humanpathogen Staphylococcus aureus implementiert und ist prinzipiell auf alle grampositiven Bakterien übertragbar. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MAPS-Technologie eine effiziente Methode darstellt, um das regulatorische Netzwerk einer bestimmten sRNA gründlich zu erforschen und eine Momentaufnahme ihres gesamten Targetoms zu bieten. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die von MAPS identifizierten mutmaßlichen Ziele noch durch komplementäre experimentelle Ansätze validiert werden müssen.

Einleitung

Hunderte, vielleicht sogar Tausende von kleinen regulatorischen RNAs (sRNAs) wurden in den meisten bakteriellen Genomen identifiziert, aber die Funktionen der überwiegenden Mehrheit von ihnen bleiben uncharakterisiert. Insgesamt sind sRNAs kurze nicht-kodierende Moleküle, die eine wichtige Rolle in der bakteriellen Physiologie und Anpassung an schwankende Umgebungen spielen^1,2,3. Tatsächlich stehen diese Makromoleküle im Zentrum zahlreicher komplizierter regulatorischer Netzwerke, die Stoffwechselwege, Stressreaktionen, aber auch Virulenz und Antibiotikaresistenz beeinflussen....

Protokoll

1. Puffer und Medien

1. Bereiten Sie für MAPS-Experimente die folgenden Puffer und Medien vor:
   - Puffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ und 1 mM DTT)
   - Puffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM Maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl₂ und 1 mM DTT)
   - RNA-Ladepuffer (0,025% Xylol cyanol und 0,025% Bromphenolblau in 8 M Harnstoff)
   - Brain Heart Infusion (BHI) Medium (12,5 g Kälbergehirn, 10 g Pepton, 5 g Rinderherz, 5 g NaCl, 2,5 g_Na2HPO₄ und 2 g Glukose für 1 L)
   - Lysogeniebrühe (LB) Medium (10 g Pepton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl für 1 L)
2. Bereiten Sie für Nort....

Ergebnisse

Die repräsentativen Ergebnisse stammen aus der Untersuchung des RsaC-Targetoms in S. aureus²⁹. RsaC ist eine unkonventionelle 1.116 nt-lange sRNA. Sein 5'-Ende enthält mehrere sich wiederholende Regionen, während sein 3'-Ende (544 nt) strukturell unabhängig ist und alle vorhergesagten Interaktionsstellen mit seinen mRNA-Zielen enthält. Die Expression dieser sRNA wird induziert, wenn Mangan (Mn) knapp ist, was häufig im Zusammenhang mit der Immunantwort des Wirts auftritt. Mit hilfe der MA.......

Diskussion

Ein modifiziertes Protokoll für grampositive Bakterien
Das ursprüngliche Protokoll von MAPS wurde entwickelt, um das sRNA-Interkotom im Modellorganismus E. coli^20,30zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll, das sich zur Charakterisierung von sRNA-abhängigen regulatorischen Netzwerken im opportunistischen Humanpathogen S. aureus eignet und durchaus auf andere grampositive Bakterien, pathogen oder nicht,.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Sarstedt	72.690.001
15 mL Zentrifugenröhrchen	Falcon	352070
2 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Starstedt	72.691
2100 Bioanalysator Instrument	Agilent	G2939BA	RNA Menge und Qualität
250 mL Kulturkolben	Dominique Dutscher	2515074	Bakteriell Kulturen
50 mL Zentrifugenröhrchen	Falcon	352051	Kulturzentrifugation
Absolutes Ethanol	VWR Chemicals	20821.321	RNA-Extraktion und -Aufreinigung
Allegra X-12R Zentrifuge	Beckman Coulter		Bakterienpelletierung
Ampicilin (amp)	Sigma-Aldrich	A9518-5G	Wachstumsmedium
Amyloseharz	Neu England BioLabs	E8021S	MS2-Affinitätsreinigung
Anti-Dioxigenin AP Fab-Fragment	Sigma Aldrich	11093274910	Northern-Blot-Assays
Autoradiographie-Kassette	ThermoFisher Scientific	50-212-726	Northern-Blot-Assays
BamHI	ThermoFisher Scientific	ER0051	Plasmidaufbau
BHI (Brain Heart Infusion) Bouillon	Sigma-Aldrich	53286	Wachstumsmedium
Blockierungsreagenz	Sigma Aldrich	11096176001	Northern Blot Assays
CDP-Star	Sigma Aldrich	11759051001	Northern Blot Assays (Substrat)
Zentrifuge 5415 R	Eppendorf		RNA Extraktion und Aufreinigung
Chloroform	Dominique Dutscher	508320-CER	RNA Extraktion und Aufreinigung
DIG-RNA-Markierungsmischung	Sigma-Aldrich	11277073910	Northern-Blot-Assays
DNase I	Roche	4716728001	DNase-Behandlung
Erythromycin (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Wachstumsmedium
FastPrep Gerät	MP Biomedicals	116004500	Mechanische Lyse
Guanidiumthiocyanat	Sigma-Aldrich	G9277-250G	Northern-Blot-Assays
Hybridisierung Hoven Hybrigene	Techne	FHB4DD	Northern-Blot-Assays
Hybridisierungsröhrchen	Techne	FHB16	Northern-Blot-Assays
Isoamylalkohol	Fisher Scientific	A/6960/08	RNA-Extraktion und -Reinigung
LB (Lysogenie-Brühe)	Sigma-Aldrich	L3022	Wachstumsmedium
Lysing Matrix B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Mechanische Lyse
MicroPulser Elektroporator	BioRad	1652100	Plasmidaufbau
Milli-Q Wassergerät Millipore		Z00QSV0WW	Reinstwasser
NanoDrop Spektralphotometer	ThermoFisher Scientific		RNA/DNA Quantität und Qualität
Nitrozellulosemembran	Dominique Dutsher	10600002	Northern Blot Assays
Phembact Neutre	PHEM Technologies	BAC03-5-11205	Reinigung und Dekontamination
Phenol	Carl Roth	38.2	RNA-Extraktion und -Reinigung
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs	M0530	Plasmidaufbau
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP Herstellung
Poly-Prep Chromatographiesäule	BioRad	7311550	MS2-Affinitätsaufreinigung
PstI	ThermoFisher Scientific	ER0615	Plasmidaufbau
Qubit 3 Fluorometer	Invitrogen	15387293 RNA-Menge
RNAPro Solution	MP Biomedicals	6055050	Mechanische Lyse
ScriptSeq Complete Kit	Illumina	BB1224	Vorbereitung von cDNA-Bibliotheken
Spektralphotometer Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Bakterienkulturen
SpeedVac Savant Vakuumgerät	ThermoFisher Scientific	DNA120	RNA-Extraktion und -Reinigung
Stratalinker UV Crosslinker 1800	Stratagene	400672	Northern Blot Assays
T4 DNA-Ligase	ThermoFisher Scientific	EL0014	Plasmidaufbau
TBE (Tris-Borat-EDTA)	Euromedex	ET020-C	Northern Blot
Assays ThermalCycler T100	BioRad	1861096	Plasmid Aufbau
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416-100ML	Northern Blot Assays
Röntgenfilmprozessor	hu.q	HQ-350XT	Northern Blot Assays
Röntgenfilme Super RX-N	FujiFilm	4741019318	Northern Blot Assays