MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Zusammenfassung

Die MAPS-Technologie wurde entwickelt, um das Targetom einer bestimmten regulatorischen RNA in vivo zu untersuchen. Die sRNA von Interesse ist mit einem MS2-Aptamer gekennzeichnet, das die Co-Reinigung ihrer RNA-Partner und deren Identifizierung durch RNA-Sequenzierung ermöglicht. Dieses modifizierte Protokoll eignet sich besonders für grampositive Bakterien.

Zusammenfassung

Obwohl kleine regulatorische RNAs (sRNAs) im bakteriellen Bereich des Lebens weit verbreitet sind, sind die Funktionen vieler von ihnen nach wie vor schlecht charakterisiert, insbesondere aufgrund der Schwierigkeit, ihre mRNA-Ziele zu identifizieren. Hier beschrieben wir ein modifiziertes Protokoll der MS2-Affinity Purification in Verbindung mit RNA Sequencing (MAPS) Technologie, mit dem Ziel, alle RNA-Partner einer spezifischen sRNA in vivo aufzudecken. Im Großen und Ganzen ist das MS2-Aptamer mit der 5'-Extremität der interessierenden sRNA verschmolzen. Dieses Konstrukt wird dann in vivo exprimiert, so dass die MS2-sRNA mit ihren zellulären Partnern interagieren kann. Nach der Bakterienernte werden die Zellen mechanisch lysiert. Der Rohextrakt wird in eine Amylose-basierte Chromatographiesäule geladen, die zuvor mit dem MS2-Protein beschichtet ist, das mit dem Maltose-bindenden Protein verschmolzen ist. Dies ermöglicht die spezifische Erfassung von MS2-sRNA und interagierenden RNAs. Nach der Elution werden co-gereinigte RNAs durch Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung und anschließende bioinformatische Analyse identifiziert. Das folgende Protokoll wurde im grampositiven Humanpathogen Staphylococcus aureus implementiert und ist prinzipiell auf alle grampositiven Bakterien übertragbar. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MAPS-Technologie eine effiziente Methode darstellt, um das regulatorische Netzwerk einer bestimmten sRNA gründlich zu erforschen und eine Momentaufnahme ihres gesamten Targetoms zu bieten. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass die von MAPS identifizierten mutmaßlichen Ziele noch durch komplementäre experimentelle Ansätze validiert werden müssen.

Einleitung

Hunderte, vielleicht sogar Tausende von kleinen regulatorischen RNAs (sRNAs) wurden in den meisten bakteriellen Genomen identifiziert, aber die Funktionen der überwiegenden Mehrheit von ihnen bleiben uncharakterisiert. Insgesamt sind sRNAs kurze nicht-kodierende Moleküle, die eine wichtige Rolle in der bakteriellen Physiologie und Anpassung an schwankende Umgebungen spielen^1,2,3. Tatsächlich stehen diese Makromoleküle im Zentrum zahlreicher komplizierter regulatorischer Netzwerke, die Stoffwechselwege, Stressreaktionen, aber auch Virulenz und Antibiotikaresistenz beeinflussen. Logischerweise wird ihre Synthese durch spezifische Umweltreize (z.B. Nährstoffmangel, oxidativer oder Membranstress) ausgelöst. Die meisten sRNAs regulieren mehrere Ziel-mRNAs auf posttranskriptioneller Ebene durch kurze und nicht zusammenhängende Basenpaarung. Sie verhindern in der Regel die Translationsinitiierung, indem sie mit Ribosomen um Translationsinitiierungsbereiche konkurrieren⁴. Die Bildung von sRNA:mRNA-Duplexen führt häufig auch zum aktiven Abbau der Ziel-mRNA durch Rekrutierung spezifischer RNasen.

Die Charakterisierung eines sRNA-Targetoms (d.h. des gesamten Satzes seiner Ziel-RNAs) ermöglicht die Identifizierung der Stoffwechselwege, in die es eingreift, und des potenziellen Signals, auf das es antwortet. Folglich können die Funktionen einer spezifischen sRNA im Allgemeinen aus ihrem Targetom abgeleitet werden. Zu diesem Zweck wurden mehrere in silico Vorhersagewerkzeuge wie IntaRNA und CopraRNA^5,6,7entwickelt. Sie stützen sich insbesondere auf Sequenz-Komplementarität, Paarungsenergie und Zugänglichkeit der potenziellen Interaktionsstelle, um mutmaßliche sRNA-Partner zu bestimmen. Vorhersagealgorithmen integrieren jedoch nicht alle Faktoren, die die Basenpaarung in vivo beeinflussen, wie die Beteiligung von RNA-Chaperonen^8, die suboptimale Interaktionen begünstigen, oder die Co-Expression beider Partner. Aufgrund ihrer inhärenten Einschränkungen bleibt die Falsch-Positiv-Rate von Vorhersagewerkzeugen hoch. Die meisten experimentellen groß angelegten Ansätze basieren auf der Co-Aufreinigung von sRNA:mRNA-Paaren, die mit einem markierten RNA-bindenden Protein (RBP)^{interagieren 6,9}. Zum Beispiel identifizierte die RIL-seq-Methode (RNA Interaction by Ligation and Sequencing) RNA-Duplexe, die mit RNA-Chaperonen wie Hfq und ProQ in Escherichia coli10^,11co-gereinigt wurden. Eine ähnliche Technologie namens UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) wurde auf RNase E- und Hfq-assoziierte sRNAs in E. coli^12,13angewendet. Trotz der gut beschriebenen Rolle von Hfq und ProQ bei der sRNA-vermittelten Regulation in^mehrerenBakterien⁸,^14,15scheint die sRNA-basierte Regulation in mehreren Organismen wie S. aureus16 , 17^,18RNA-Chaperon-unabhängig zu sein . Auch wenn die Aufreinigung von RNA-Duplexen in Verbindung mit RNasen machbar ist, wie Waters und Mitarbeiter¹³gezeigt haben, bleibt dies schwierig, da RNasen ihren schnellen Abbau auslösen. Daher stellt der MS2-Affinity Purification gekoppelt mit RNA Sequencing (MAPS) Ansatz^19,20 eine solide Alternative in solchen Organismen dar.

Im Gegensatz zu den oben genannten Methoden verwendet MAPS eine spezifische sRNA als Köder, um alle interagierenden RNAs zu erfassen, und ist daher nicht auf die Beteiligung eines RBP angewiesen. Der gesamte Prozess ist in Abbildung 1dargestellt. Kurz gesagt, die sRNA wird an der 5' mit dem MS2-RNA-Aptamer markiert, das spezifisch vom MS2-Mantelprotein erkannt wird. Dieses Protein wird mit dem Maltose-bindenden Protein (MBP) verschmolzen, um auf einem Amyloseharz immobilisiert zu werden. Daher bleiben MS2-sRNA und ihre RNA-Partner auf der Affinitätschromatographiesäule erhalten. Nach der Elution mit Maltose werden co-gereinigte RNAs mittels Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung identifiziert, gefolgt von einer bioinformatischen Analyse (Abbildung 2). Die MAPS-Technologie zeichnet letztendlich eine interagierende Karte aller potenziellen Wechselwirkungen, die in vivo auftreten.

Die MAPS-Technologie wurde ursprünglich im nicht-pathogenen gramnegativen Bakterium E. coli^{21 implementiert.} Bemerkenswerterweise half MAPS dabei, ein tRNA-abgeleitetes Fragment zu identifizieren, das spezifisch mit RyhB- und RybB-sRNAs interagiert und jegliches sRNA-Transkriptionsrauschen verhindert, um mRNA-Ziele unter nicht induzierenden Bedingungen zu regulieren. Danach wurde MAPS erfolgreich auf andere E. coli sRNAs wie DsrA²², RprA²³, CyaR²³ und GcvB²⁴ angewendet (Tabelle 1). Neben der Bestätigung bisher bekannter Ziele erweiterte MAPS das Targetom dieser bekannten sRNAs. Vor kurzem wurde MAPS in Salmonella Typhimurium durchgeführt und zeigte, dass SraL sRNA an Rho mRNA bindet und für einen Transkriptionsabschlussfaktor²⁵kodiert. Durch diese Paarung schützt SraL rho mRNA vor dem vorzeitigen Transkriptionsabschluss, der durch Rho selbst ausgelöst wird. Interessanterweise ist diese Technologie nicht auf sRNAs beschränkt und kann auf jede Art von zellulären RNAs angewendet werden, wie durch die Verwendung eines tRNA-abgeleiteten Fragments²⁶ und einer 5'-unübersetzten Region von mRNA²² veranschaulicht wird (Tabelle 1).

Die MAPS-Methode wurde auch an das pathogene grampositive Bakterium S. aureus¹⁹angepasst. Insbesondere wurde das Lyseprotokoll umfassend modifiziert, um Zellen aufgrund einer dickeren Zellwand als gramnegative Bakterien effizient zu brechen und die RNA-Integrität aufrechtzuerhalten. Dieses angepasste Protokoll entwirrte bereits das Interaktom von RsaA²⁷, RsaI²⁸ und RsaC²⁹. Dieser Ansatz gab Einblicke in die entscheidende Rolle dieser sRNAs bei den Regulationsmechanismen der Zelloberflächeneigenschaften, der Glukoseaufnahme und der oxidativen Stressreaktionen.

Das Protokoll, das 2015 in E. coli entwickelt und implementiert wurde, wurde kürzlich sehr detailliert beschrieben³⁰. Hier stellen wir das modifizierte MAPS-Protokoll zur Verfügung, das sich besonders für die Untersuchung von sRNA-regulatorischen Netzwerken in grampositiven (dickeren Zellwand) Bakterien eignet, ob nicht pathogen oder pathogen (Sicherheitsvorkehrungen).

Protokoll

1. Puffer und Medien

1. Bereiten Sie für MAPS-Experimente die folgenden Puffer und Medien vor:
   - Puffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl₂ und 1 mM DTT)
   - Puffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM Maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl₂ und 1 mM DTT)
   - RNA-Ladepuffer (0,025% Xylol cyanol und 0,025% Bromphenolblau in 8 M Harnstoff)
   - Brain Heart Infusion (BHI) Medium (12,5 g Kälbergehirn, 10 g Pepton, 5 g Rinderherz, 5 g NaCl, 2,5 g_Na2HPO₄ und 2 g Glukose für 1 L)
   - Lysogeniebrühe (LB) Medium (10 g Pepton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl für 1 L)
2. Bereiten Sie für Northern Blot Assays die folgenden Puffer vor:
   - Blockierungslösung (1x Maleinsäure und 1% blockierendes Reagenz)
   - Hybridisierungslösung (50% Formamid, 5x SSC, 7% SDS, 1% blockierende Lösung und 0,2% N-Laurylsarcosin, 50 mM Natriumphosphat). Erhitzen mit Rühren, um sich aufzulösen.
   ACHTUNG: Befolgen Sie sorgfältig die Sicherheitsvorkehrungen für jedes Produkt.
   - 1 M Natriumphosphat (58 mM Natriumphosphat-Dibasis und 42 mM Natriumphosphat-Monobasis)
   - Kochsalzlösung, Natriumcitrat (SSC)-Puffer, 20x Konzentrat (3 M NaCl und 300 mM Trinatriumcitrat)

2. Sicherheitsfragen

1. Führen Sie alle Schritte mit lebensfähigen pathogenen Bakterien in einem Level-2-Containment-Labor durch.
   HINWEIS: Nur Zellextrakte können nach der Lyse nach draußen genommen werden (Schritt 5).
2. Legen Sie einen Laborkittel und Handschuhe an.
3. Stellen Sie sicher, dass die Handgelenke bedeckt sind.
4. Reinigen Sie die biologische Sicherheitswerkbank (Klasse II) mit einer Desinfektionslösung.
5. Entsorgen Sie feste Abfälle, die Bakterien ausgesetzt sind, in der entsprechenden biomedizinischen Tonne.
6. Kolben, die kontaminierte Flüssigkeiten enthalten, mit einer Desinfektionslösung behandeln. Dann entsorgen Sie es in einer Spüle.
7. Hände und Handgelenke vorsichtig mit Seife waschen und den Laborkittel entfernen, bevor Sie das Containment-Labor der Stufe 2 verlassen.

3. Plasmidkonstruktion

HINWEIS: Für Klonzwecke ist es wichtig, zuerst die Grenzen der endogenen sRNA zu identifizieren. Die Plasmide pCN51-P3 und pCN51-P3-MS2 sind in Tomasini et al. (2017)²⁷beschrieben. Der P3-Promotor ermöglicht eine hohe Expression der sRNA in zelldichteabhängiger Weise (d.h. wenn Bakterien in die stationäre Wachstumsphase eintreten). Viele Staphylokokken-sRNAs reichern sich während dieser Wachstumsphase an.

1. Amplifizieren Sie die sRNA-Sequenz mittels PCR mit einer High-Fidelity-DNA-Polymerase und einer PCR-Maschine. Befolgen Sie sorgfältig die Anweisungen des Herstellers und lesen Sie Garibyan und Avashia (2013)³¹ für weitere Details.
2. Verwenden Sie die folgenden Vorlagen, um die spezifischen Primer zu entwerfen:
   
   und 5'-CGCGGATCC(N)-3' für Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer.
   HINWEIS: Diese Oligonukleotide ermöglichen es, die MS2-Sequenz (fett gedruckt) mit dem 5'-Ende der interessierenden sRNA zu verschmelzen. Pst I- und BamHI-Restriktionsstellen (unterstrichen) werden an den 5'- und 3'-Extremitäten des MS2-sRNA-Konstrukts hinzugefügt, um das Amplicon in das pCN51-P3-Plasmid²⁷zu klonen. (N) entspricht der genspezifischen Sequenz (15-20 Nukleotide).
3. Verdauen Sie 1 μg pCN51-P3-Plasmid und 1 μg des MS2-sRNA-PCR-Produkts mit 2 HE PstI und 1 HE BamHI im entsprechenden Puffer gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
4. 1 h bei 37 °C inkubieren und DNA mit einem PCR-Reinigungskit reinigen (siehe Materialtabelle).
5. Mischen Sie das verdaute pCN51-P3-Plasmid (300 ng) und das MS2-sRNA-Amplicon (molares Verhältnis für Vektor:Insert = 1:3) in einem 1,5-ml-Röhrchen. Siehe Revie et al. (1988)³² zur Maximierung der Ligationseffizienz. Fügen Sie 1 μL des Ligase Buffer und 10 U T4 Ligase in jedem Rohr hinzu. Stellen Sie die Lautstärke mit Reinstwasser auf 10 μL ein.
6. Bei 22 °C mindestens 2 h inkubieren.
7. 5 μL Ligationsmischung zu 50 μL gefrorenem DH5α chemisch kompetenten E. coli-Zellen hinzufügen. Lesen Sie Seidman et al. (2001)^33, um mehr über Plasmidtransformation und chemisch kompetente Zellen zu erfahren.
8. Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis.
9. Hitzeschock (45 s bei 42 °C) das Umwandlungsrohr mit einem Wärmeblock oder Wasserbad.
10. 900 μL LB-Medium fügen und bei 37 °C 30 min inkubieren.
11. Platte 100 μL der Bakteriensuspension auf einer lb-Agarplatte ergänzt mit Ampicillin (100 μg/μL).
    HINWEIS: Der pCN51-P3-Vektor kodiert für ein Ampicillin-Resistenzgen, das es ermöglicht, nur E. coli-Klone auszuwählen, die das pCN51-P3-MS2-sRNA-Plasmid tragen.
12. Extrahieren Sie das pCN51-P3-MS2-sRNA-Plasmid aus einer bakterienartigen Kultur über Nacht (5 ml), die in Gegenwart von Ampicillin (100 μg/ μL) unter Verwendung eines Plasmid-DNA-Miniprep-Kits gezüchtet wurde (siehe Materialtabelle).
13. Überprüfen Sie das Konstrukt durch Sanger-Sequenzierung³⁴ mit dem folgenden Primer, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
14. Wandeln Sie das pCN51-P3-MS2-sRNA-Plasmid in CHEMISCH kompetente DC10B E. coli-Zellen um. Wiederholen Sie die Schritte 3.7 bis 3.11.
15. Extrahieren Sie das pCN51-P3-MS2-sRNA-Plasmid (siehe Schritt 3.12) und wandeln Sie 1-5 μg Plasmid-DNA mit einem Elektroporationsapparat in HG001 ΔsRNA-elektrokompetente S. aureus-Zellen um. Befolgen Sie sorgfältig die Anweisungen des Herstellers. Lesen Sie Grosser und Richardson (2016)^35, um mehr über Methoden zur Herstellung von elektrokompetenten S. aureuszuerfahren.
    ACHTUNG: Dieser Schritt beinhaltet den Umgang mit pathogenen Bakterien (siehe Schritt 2).
16. 900 μL BHI-Medium fünden und bei 37 °C für 3 h inkubieren.
17. Zentrifuge 1 min bei 16.000 x g. Verwerfen Sie den Überstand.
18. Das Pellet in 100 μL BHI resuspendieren und die Bakteriensuspension auf BHI-Agarplatten mit Erythromycin (10 μg/μL) plattieren.
    HINWEIS: Der pCN51-P3-Vektor kodiert auch für ein Erythromycin-Resistenzgen, das es ermöglicht, nur S. aureus-Klone auszuwählen, die das pCN51-P3-MS2-sRNA-Plasmid tragen.

4. Bakterienernte

ACHTUNG: Dieser Schritt beinhaltet den Umgang mit pathogenen Bakterien (siehe Schritt 2).

1. Züchten Sie eine Kolonie von Stämmen, die entweder pCN51-P3-MS2-sRNA oder pCN51-P3-MS2²⁷ Plasmide in 3 ml BHI-Medium tragen, ergänzt mit Erythromycin (10 μg / μL) in Duplikaten.
2. Verdünnen Sie jede Nachtkultur in 50 ml (≈1/100) frischem BHI-Medium, ergänzt mit Erythromycin (10 μg/μL), um einen OD_600nm von 0,05 zu erreichen. Verwenden Sie 250 ml sterilisierte Kolben (5:1 Kolben-zu-Medium-Verhältnis).
   HINWEIS: Mediums- und Wachstumsbedingungen sollten entsprechend dem Expressionsmuster der untersuchten sRNA eingestellt werden.
3. Kulturen bei 37 °C mit Schütteln bei 180 U/min für 6 h anbauen.
4. Jede Kultur wird in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen überführen.
5. Zentrifuge bei 2.900 x g während 15 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand.
6. Bewahren Sie Pellets auf Eis auf und führen Sie direkt eine mechanische Zelllyse durch (Schritt 5) oder frieren und lagern Sie Pellets bei -80 °C.

5. Mechanische Zelllyse

ACHTUNG: Folgende Schritte müssen auf Eis durchgeführt werden und puffer müssen bei 4 °C sein. Verwenden Sie Handschuhe und treffen Sie alle Vorsichtsmaßnahmen, um Proben vor RNases zu schützen.

1. Pellets (Schritt 4.6) in 5 ml Puffer A wiederverwenden.
2. Die resuspendierten Zellen in 15 mL Zentrifugenröhrchen mit 3,5 g Kieselsäureperlen (0,1 mm) überführen.
3. Einsetzen von Rohren in ein mechanisches Zelllysegerät (siehe Materialtabelle). Führen Sie einen Zyklus von 40 s bei 4,0 m/s durch.
   HINWEIS: Wenn ein Zyklus nicht ausreicht, um Zellen zu brechen, lassen Sie das Gerät 5 Minuten abkühlen, während Sie die Proben auf Eis halten. Wiederholen Sie dann einen weiteren Zyklus von 40 s bei 4,0 m/s. Die Effizienz der Zelllyse kann durch Beschichtung des Überstands auf BHI-Agarplatte getestet werden.
4. Zentrifuge bei 15.700 x g für 15 min. Stellen Sie den Überstand wieder her und halten Sie ihn auf Eis.

6. Säulenvorbereitung

ACHTUNG: Achten Sie darauf, das Amyloseharz nicht trocknen zu lassen. Versiegeln Sie die Säule bei Bedarf mit einer Endkappe. Bereiten Sie alle Lösungen vor, bevor Sie mit der Affinitätsreinigung beginnen.

1. Legen Sie eine Chromatographiesäule in ein Säulengestell (siehe Materialtabelle).
2. Entfernen Sie die Säulenspitze und waschen Sie die Säule mit Reinstwasser.
3. Fügen Sie 300 μL Amyloseharz hinzu.
4. Waschen Sie die Säule mit 10 ml Puffer A.
5. 1.200 pmol MBP-MS2-Protein in 6 ml Puffer A verdünnen und in die Säule laden.
6. Waschen Sie die Säule mit 10 ml Puffer A.

7. MS2-Affinitätsreinigung (Abbildung1)

1. Laden Sie das Zelllysat in die Spalte.
   HINWEIS: Halten Sie 1 ml des Zelllysats (Rohextrakt, CE) bereit, um die Gesamt-RNA (Schritt 8) zu extrahieren und eine Northern Blot ( Schritt 9) und transkriptomische (Schritt 10) Analyse durchzuführen.
2. Sammeln Sie die Durchflussfraktion (FT) in einem sauberen Sammelrohr.
3. Waschen Sie die Säule 3 mal mit 10 ml Puffer A. Sammeln Sie die Waschfraktion (W).
4. Eluieren Sie die Säule mit 1 ml Puffer E und sammeln Sie die Elutionsfraktion (E) in einem 2 mL Mikroröhrchen.
5. Halten Sie alle gesammelten Fraktionen bis zur RNA-Extraktion (Schritt 8) auf Eis oder frieren Sie sie bei -20 °C für die spätere Verwendung ein.

8. RNA-Extraktion von gesammelten Fraktionen (CE, FT, W und E)

1. Verwenden Sie 1 ml jeder Fraktion (einschließlich FT und W) für die RNA-Extraktion.
2. Fügen Sie 1 Volumen Phenol hinzu. Kräftig mischen.
   ACHTUNG: Phenol ist flüchtig und korrosiv, achten Sie darauf und arbeiten Sie sicher unter einem Abzug.
3. Zentrifuge bei 16.000 x g für 10 min bei 20 °C.
4. Übertragen Sie die obere Phase in ein sauberes 2 ml Mikroröhrchen.
5. Fügen Sie 1 Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) hinzu und wiederholen Sie die Schritte 8.3 bis 8.4.
   ACHTUNG: Arbeiten Sie sicher unter einem Abzug.
6. Fügen Sie 2,5 Volumen kaltes Ethanol 100% und 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (NaOAc) pH 5,2 hinzu.
7. Über Nacht bei -20 °C ausfällungen.
   HINWEIS: Die Ausfällung kann auch in einem Ethanol-/Trockeneisbad während 20 minuten oder bei -80 °C während 2 h durchgeführt werden.
8. Zentrifuge bei 16.000 x g für 15 min bei 4 °C. Ethanol langsam mit einer Pipette entfernen, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören.
   ACHTUNG: Das RNA-Pellet ist nicht immer sichtbar und in Gegenwart von Ethanol manchmal locker.
9. Fügen Sie 500 μL 80% kaltes Ethanol hinzu.
10. Zentrifuge bei 16.000 x g für 5 min bei 4 °C.
11. Entsorgen Sie Ethanol, indem Sie es langsam pipettieren. Trocknen Sie das Pellet mit einem Vakuumkonzentrator, 5 minuten im Laufmodus.
12. Das Pellet wird in einem geeigneten Volumen (15-50 μL) Reinstwasser wieder aufgebraucht. Das Pellet für die spätere Verwendung bei -20 °C einfrieren.
13. Beurteilen Sie die RNA-Quantität (260 nm) und -qualität (Wellenlängenverhältnisse 260/280 und 260/230) mit einem Spektralphotometer/Fluorometer (siehe Materialtabelle). Befolgen Sie sorgfältig die Anweisungen des Herstellers.
    HINWEIS: 3-4 μg werden im Allgemeinen in der Elutionsfraktion (E) erhalten. Dies hängt hauptsächlich von den getesteten Bedingungen ab.

9. Analyse der MS2-Affinitätsreinigung durch Northern Blot³⁶

1. 5 μg RNA aus CE-, FT-, W-Fraktionen und 500 ng E-Fraktion in 10 μL Reinstwasser verdünnen und mit 10 μL RNA-Ladepuffer mischen.
2. 3 min bei 90 °C inkubieren.
3. Laden Sie Proben in Vertiefungen eines 1% igen Agarosegels, das mit 20 mM Guanidiumthiocyanat ergänzt ist, und lassen Sie das Gel mit 100-150 V in TBE 1x Puffer bei 4 °C laufen. Lesen Sie Koontz (2013)³⁷ für weitere Details.
4. Transfer-RNAs auf einer Nitrocellulosemembran durch Vakuumtransfer für 1h oder Kapillaritätstransfer über Nacht.
   HINWEIS: Die Kapillaritätsmethode ist bei großen RNAs effizienter.
5. UV-Vernetzungs-RNAs auf der Membran (120 mJ bei 254 nm) mit einem ULTRAVIOLETT-Vernetzer.
6. Führen Sie die Membran in eine Hybridisierungsflasche mit der RNA-Seite nach oben ein.
7. Fügen Sie 10-20 ml vorgewärmte Hybridisierungslösung hinzu. 30 min bei 68 °C inkubieren.
8. Entsorgen Sie die Lösung und fügen Sie 10-20 ml frische Hybridisierungslösung hinzu, die mit 1 μL der sRNA-spezifischen Sonde ergänzt wird. Über Nacht bei 68 °C inkubieren.
   HINWEIS: Die DIG-markierte RNA-Sonde wird mit einem DIG-RNA-Markierungskit und gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Alternativ kann eine radioaktiv markierte Sonde verwendet werden.
9. Waschen Sie die Membran mit 10-20 mL Waschlösung 1 (2x SSC und 0,1% SDS) für 5 min bei 20 °C. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal.
10. Waschen Sie die Membran mit 10-20 ml Waschlösung 2 (0,2x SSC und 0,1% SDS) für 15 min bei 68 °C. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal.
11. Mit 10-20 ml Blocklösung für mindestens 30 min bei 20 °C inkubieren.
12. Entsorgen Sie die Lösung und fügen Sie 10-20 ml der Blockierungslösung hinzu, ergänzt mit dem polyklonalen Anti-Digoxigenin-Antikörper (1/1000), konjugiert mit alkalischer Phosphatase. 30 min bei 20 °C inkubieren.
13. Waschen Sie die Membran mit 10-20 ml der Waschlösung 3 (1x Maleinsäure und 0,3% Tween 20) für 15 min bei 20 °C. Wiederholen Sie diesen Vorgang einmal.
14. Inkubieren Sie die Membran mit 10-20 mL der Detektionslösung (0,1 M Tris HCl und 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min bei 20 °C.
15. Legen Sie die Membran auf eine Kunststofffolie und tränken Sie sie mit dem Substrat (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie 5 Minuten im Dunkeln.
16. Versiegeln Sie die Membran in einer Kunststofffolie. Legen Sie die Membran in eine Autoradiographiekassette.
17. Setzen Sie die Membran einem Autoradiographiefilm im dafür vorgesehenen dunklen Raum aus.
    HINWEIS: Die Belichtungszeit hängt von der Signalstärke ab, von wenigen Sekunden bis zu Minuten.
18. Zeigen Sie den belichteten Film in einem automatischen Entwicklungsgerät auf.

10. Vorbereitung der Proben für die RNA-Sequenzierung

HINWEIS: Dieser Schritt betrifft nur RNAs, die aus E- und CE-Fraktionen extrahiert wurden.

1. Zu jeder Probe werden 10 μL 10x DNase-Puffer und DNase I (1 U/μg behandelte RNAs) hinzugefügt. Fügen Sie Wasser für ein Endvolumen von 100 μL hinzu.
2. 1 h bei 37 °C inkubieren.
3. Extrahieren und reinigen Sie RNAs wie zuvor beschrieben (Schritte 8.2 bis 8.11).
4. Resuspend das RNA-Pellet in 20 μL Reinstwasser.
   HINWEIS: Das Vorhandensein der verbleibenden DNA kann mit PCR und spezifischen Primern (z. B. 16S-Gen) überprüft werden.
5. Bewerten Sie die RNA-Quantität und -Qualität mit einem mikrofluidikbasierten Elektrophorese-Analysesystem (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: 1 μg wird im Allgemeinen in der Elutionsfraktion (E) nach DNase-Behandlung erhalten.
6. Entfernen Sie ribosomale RNAs mit einem bakteriellen rRNA-Depletion-Kit.
   HINWEIS: Große und reichlich vorhandene RNAs (d. H. rRNAs) neigen dazu, unspezifisch mit der Affinitätsspalte zu interagieren. 500 ng extrahierte RNA sind erforderlich, um diesen Schritt durchzuführen.
7. Bewerten Sie erneut die RNA-Quantität und -Qualität mit einem mikrofluidikbasierten Elektrophorese-Analysesystem.
8. Bereiten Sie cDNA-Bibliotheken mit 10-20 ng ribodepleted RNA mit einem cDNA-Bibliotheksvorbereitungskit und gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
9. Sequenzieren Sie die erhaltenen Bibliotheken mit einem Sequenzierungsinstrument (z. B. Single-End, 150 bp; siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: 5-10 Millionen Lesevorgänge pro Stichprobe sind im Allgemeinen ausreichend.

11. RNAseq-Datenanalyse (Abbildung 2)

1. Laden Sie die FastQ-Sequenzierungsdateien von der Sequenzierungsplattform herunter.
2. Zugriff auf die Galaxy-Instanz der biologischen Station Roscoff (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) und Einloggen.
   HINWEIS: Jeder erwähnte Algorithmus kann leicht über die Suchleiste gefunden werden. Für jedes Tool wird ein Benutzerhandbuch bereitgestellt.
   ACHTUNG: Die Version der erforderlichen Tools kann vom öffentlichen Galaxy Server³⁸abweichen.
3. Klicken Sie auf das Symbol Daten abrufen und dann auf Datei von Ihrem Computer hochladen. Laden Sie die FastQ-Sequenzierungsdatei jeder MS2-Kontroll- und MS2-sRNA-Proben hoch. Laden Sie auch FASTA-Referenzgenomdatei und GFF-Annotationsdatei hoch.
4. Führen Sie FastQC Read Quality Reports (Galaxy Version 0.69) aus.
   HINWEIS: Dieses Tool bietet eine Qualitätsbewertung von Rohsequenzen (z. B. Qualitätsfaktor, Vorhandensein von Adaptersequenzen).
5. Führen Sie das Trimmomatic Flexible Read Trimming Tool (Galaxy Version 0.36.6) aus, um insbesondere Adaptersequenzen und Lesevorgänge von schlechter Qualität zu entfernen. Geben Sie Adaptersequenzen an, die für die Bibliotheksvorbereitung verwendet werden (z. B. TruSeq 3, single-ended). Fügen Sie die folgenden trimmomatischen Operationen hinzu: SLIDINGWINDOW (Anzahl der Basen=4; Durchschnittliche Qualität=20) und MINLEN (Mindestlänge der Lesevorgänge=20).
6. Führen Sie fastQC Read Quality Reports (Galaxy Version 0.69) erneut aus.
7. Run Bowtie2 - Karte liest gegen Referenzgenom (Galaxy Version 2.3.2.2). Verwenden Sie die Genome Reference FASTA-Datei aus dem Verlauf, um Lesevorgänge mit Standardeinstellungen (sehr empfindlich lokal) zuzuordnen.
   HINWEIS: Die vom Bowtie2-Tool generierte BAM-Datei kann mit dem Integrative Genomics Viewer (IGV) visualisiert werden. Die zugehörige BAI-Datei ist ebenfalls erforderlich.
8. Optional flagstat ausführen, das Statistiken für BAM-Datasets (Galaxy Version 2.0) kompiliert.
9. Führen Sie htseq-count - Count (Galaxy Version 0.6.1) aus, das leseüberlappende Features in der GFF-Anmerkungsdatei ausrichtet. Verwenden Sie den Schnittpunktmodus (nicht leer).
10. Archivieren Sie alle Raw-Counts-Dateien aus der htseq-count-Analyse in einer einzigen Zip-Datei.
11. Führen Sie SARTools DESeq2 aus, um Daten zu vergleichen (Galaxy Version 1.6.3.0). Geben Sie die Zip-Datei mit Rohanzahldateien und die Designdatei an, eine tabulatorgetrennte Datei, die das Experiment beschreibt. Befolgen Sie sorgfältig die bereitgestellten Anweisungen, um die Designdatei zu generieren.

Ergebnisse

Die repräsentativen Ergebnisse stammen aus der Untersuchung des RsaC-Targetoms in S. aureus²⁹. RsaC ist eine unkonventionelle 1.116 nt-lange sRNA. Sein 5'-Ende enthält mehrere sich wiederholende Regionen, während sein 3'-Ende (544 nt) strukturell unabhängig ist und alle vorhergesagten Interaktionsstellen mit seinen mRNA-Zielen enthält. Die Expression dieser sRNA wird induziert, wenn Mangan (Mn) knapp ist, was häufig im Zusammenhang mit der Immunantwort des Wirts auftritt. Mit hilfe der MA...

Diskussion

Ein modifiziertes Protokoll für grampositive Bakterien
Das ursprüngliche Protokoll von MAPS wurde entwickelt, um das sRNA-Interkotom im Modellorganismus E. coli^20,30zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll, das sich zur Charakterisierung von sRNA-abhängigen regulatorischen Netzwerken im opportunistischen Humanpathogen S. aureus eignet und durchaus auf andere grampositive Bakterien, pathogen oder nicht,...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Sarstedt	72.690.001
15 mL Zentrifugenröhrchen	Falcon	352070
2 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Starstedt	72.691
2100 Bioanalysator Instrument	Agilent	G2939BA	RNA Menge und Qualität
250 mL Kulturkolben	Dominique Dutscher	2515074	Bakteriell Kulturen
50 mL Zentrifugenröhrchen	Falcon	352051	Kulturzentrifugation
Absolutes Ethanol	VWR Chemicals	20821.321	RNA-Extraktion und -Aufreinigung
Allegra X-12R Zentrifuge	Beckman Coulter		Bakterienpelletierung
Ampicilin (amp)	Sigma-Aldrich	A9518-5G	Wachstumsmedium
Amyloseharz	Neu England BioLabs	E8021S	MS2-Affinitätsreinigung
Anti-Dioxigenin AP Fab-Fragment	Sigma Aldrich	11093274910	Northern-Blot-Assays
Autoradiographie-Kassette	ThermoFisher Scientific	50-212-726	Northern-Blot-Assays
BamHI	ThermoFisher Scientific	ER0051	Plasmidaufbau
BHI (Brain Heart Infusion) Bouillon	Sigma-Aldrich	53286	Wachstumsmedium
Blockierungsreagenz	Sigma Aldrich	11096176001	Northern Blot Assays
CDP-Star	Sigma Aldrich	11759051001	Northern Blot Assays (Substrat)
Zentrifuge 5415 R	Eppendorf		RNA Extraktion und Aufreinigung
Chloroform	Dominique Dutscher	508320-CER	RNA Extraktion und Aufreinigung
DIG-RNA-Markierungsmischung	Sigma-Aldrich	11277073910	Northern-Blot-Assays
DNase I	Roche	4716728001	DNase-Behandlung
Erythromycin (ery)	Sigma-Aldrich	Fluka 45673	Wachstumsmedium
FastPrep Gerät	MP Biomedicals	116004500	Mechanische Lyse
Guanidiumthiocyanat	Sigma-Aldrich	G9277-250G	Northern-Blot-Assays
Hybridisierung Hoven Hybrigene	Techne	FHB4DD	Northern-Blot-Assays
Hybridisierungsröhrchen	Techne	FHB16	Northern-Blot-Assays
Isoamylalkohol	Fisher Scientific	A/6960/08	RNA-Extraktion und -Reinigung
LB (Lysogenie-Brühe)	Sigma-Aldrich	L3022	Wachstumsmedium
Lysing Matrix B Bulk	MP Biomedicals	6540-428	Mechanische Lyse
MicroPulser Elektroporator	BioRad	1652100	Plasmidaufbau
Milli-Q Wassergerät Millipore		Z00QSV0WW	Reinstwasser
NanoDrop Spektralphotometer	ThermoFisher Scientific		RNA/DNA Quantität und Qualität
Nitrozellulosemembran	Dominique Dutsher	10600002	Northern Blot Assays
Phembact Neutre	PHEM Technologies	BAC03-5-11205	Reinigung und Dekontamination
Phenol	Carl Roth	38.2	RNA-Extraktion und -Reinigung
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs	M0530	Plasmidaufbau
pMBP-MS2	Addgene	65104	MS2-MBP Herstellung
Poly-Prep Chromatographiesäule	BioRad	7311550	MS2-Affinitätsaufreinigung
PstI	ThermoFisher Scientific	ER0615	Plasmidaufbau
Qubit 3 Fluorometer	Invitrogen	15387293 RNA-Menge
RNAPro Solution	MP Biomedicals	6055050	Mechanische Lyse
ScriptSeq Complete Kit	Illumina	BB1224	Vorbereitung von cDNA-Bibliotheken
Spektralphotometer Genesys 20	ThermoFisher Scientific	11972278	Bakterienkulturen
SpeedVac Savant Vakuumgerät	ThermoFisher Scientific	DNA120	RNA-Extraktion und -Reinigung
Stratalinker UV Crosslinker 1800	Stratagene	400672	Northern Blot Assays
T4 DNA-Ligase	ThermoFisher Scientific	EL0014	Plasmidaufbau
TBE (Tris-Borat-EDTA)	Euromedex	ET020-C	Northern Blot
Assays ThermalCycler T100	BioRad	1861096	Plasmid Aufbau
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416-100ML	Northern Blot Assays
Röntgenfilmprozessor	hu.q	HQ-350XT	Northern Blot Assays
Röntgenfilme Super RX-N	FujiFilm	4741019318	Northern Blot Assays