Isolierung, Proliferation und Differenzierung von Rhesusaffen-Fettstammzellen

Zusammenfassung

In diesem Artikel beschreiben wir die Isolierung von aus Rhesusaffen gewonnenen Fettstammzellen (ADSCs) unter Verwendung eines enzymatischen Gewebeverdauungsprotokolls. Als nächstes beschreiben wir die ADSC-Proliferation, die Zellablösung, Zählen und Plattieren umfasst. Schließlich wird die ADSC-Differenzierung unter Verwendung spezifischer adipogener Induktoren beschrieben. Zusätzlich beschreiben wir Färbetechniken, um die Differenzierung zu bestätigen.

Zusammenfassung

Fettgewebe bietet eine reiche und zugängliche Quelle für multipotente Stammzellen, die sich selbst erneuern können. Diese aus Fett gewonnenen Stammzellen (ADSCs) bilden ein konsistentes ex vivo Zellsystem, das funktionell dem von in vivo Adipozyten ähnelt. Der Einsatz von ADSCs in der biomedizinischen Forschung ermöglicht die zelluläre Untersuchung der metabolischen Regulation und Funktion des Fettgewebes. Die ADSC-Differenzierung ist für eine adäquate Adipozytenexpansion notwendig, und die suboptimale Differenzierung ist ein wichtiger Mechanismus der Fettdysfunktion. Das Verständnis von Veränderungen in der ADSC-Differenzierung ist entscheidend für das Verständnis der Entwicklung von metabolischen Dysfunktionen und Erkrankungen. Die in diesem Manuskript beschriebenen Protokolle ergeben, wenn sie befolgt werden, reife Adipozyten, die für mehrere In-vitro-Funktionstests zur Beurteilung der ADSC-Stoffwechselfunktion verwendet werden können, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Assays zur Messung der Glukoseaufnahme, Lipolyse, Lipogenese und Sekretion. Rhesusaffen (Macaca mulatta) sind physiologisch, anatomisch und evolutionär dem Menschen ähnlich und als solche wurden ihre Gewebe und Zellen ausgiebig in der biomedizinischen Forschung und zur Entwicklung von Behandlungen verwendet. Hier beschreiben wir die ADSC-Isolierung mit frischem subkutanem und omentalem Fettgewebe, das von 4-9-jährigen Rhesusaffen gewonnen wird. Fettgewebeproben werden enzymatisch in Kollagenase verdaut, gefolgt von Filtration und Zentrifugation, um ADSCs aus der stromalen Gefäßfraktion zu isolieren. Isolierte ADSCs werden in stromalen Medien proliferiert, gefolgt von etwa 14-21 Tagen Differenzierung unter Verwendung eines Cocktails aus 0,5 μg / ml Dexamethason, 0,5 mM Isobutylmethylxanthin und 50 μM Indomethacin in stromalen Medien. Reife Adipozyten werden nach etwa 14 Tagen der Differenzierung beobachtet. In diesem Manuskript beschreiben wir Protokolle für die Isolierung, Proliferation und Differenzierung von ADSC in vitro. Obwohl wir uns auf ADSCs aus Rhesusaffen-Fettgewebe konzentriert haben, können diese Protokolle für Fettgewebe verwendet werden, das von anderen Tieren mit minimalen Anpassungen gewonnen wird.

Einleitung

Fettgewebe besteht aus einer heterogenen Mischung von Zellen, überwiegend reifen Adipozyten und einer stromalen vaskulären Fraktion einschließlich Fibroblasten, Immunzellen und aus Fett gewonnenen Stammzellen (ADSCs)^1,2,3. Primäre ADSCs können direkt aus weißem Fettgewebe isoliert und zur Differenzierung in Adipozyten, Knorpel- oder Knochenzellen angeregt werden⁴. ADSCs weisen klassische Stammzelleigenschaften wie die Aufrechterhaltung der Multipotenz in vitro und die Selbsterneuerung auf; und haften an Kunststoff in Kultur

Protokoll

Alle erhaltenen Gewebe und Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am Louisiana State University Health Sciences Center genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Institute of Health (NIH-Publikation Nr. 85-12, überarbeitet 1996) durchgeführt.

1. Herstellung von Puffern und Lösungen

1. Bereiten Sie eine sterile 5-phosphatgepufferte Kochsalzlösung (5-PBS) vor, indem Sie 5% Penicillin / Streptomycin (Pen/Streptokokken) und 0,25 μg / ml Pilzhemmer zu 1x PBS hinzufügen. Bereiten Sie eine sterile 2-PBS-Waschpufferlösung (2-PBS) durch Zugabe von 2% Pen/Streptokokken und 0,25 μg/ml Pilzinhibit....

Ergebnisse

Die aus Rhesusaffen-Fettgewebeproben isolierten ADSCs wurden auf Kulturplatten ausgesät und sind in Abbildung 1 dargestellt. Am Tag der Beschichtung sind die Zellen nicht haftend und schwimmen in der Kulturschale, wie in Abbildung 1A gezeigt. Innerhalb von 72 h werden ADSCs zu 80% konfluent und sind bereit für die Adipozytendifferenzierung (Abbildung 1B). ADSCs zeigen starke adipogene Eigenschaften nach chemischer Induktion. Nach 14.......

Diskussion

ADSC-Isolations-, Proliferations- und Differenzierungsprotokolle sind einfach und reproduzierbar, erfordern jedoch eine sorgfältige Technik, um eine angemessene Isolierung, gesunde Expansion und effiziente Differenzierung zu gewährleisten. Eine sterile Arbeitsumgebung ist für alle Zellkulturexperimente von entscheidender Bedeutung. Bakterien oder Pilze können durch kontaminierte Werkzeuge, Medien oder Arbeitsumgebungen in Zellkulturen eingeführt werden. Pilzkontamination wird durch Sporenwachstum in der Kultur angezeigt,.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,4 % Trypanblau	Thermo-Fisher	15250061
1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen	Dot Scientific	707-FTG
100 % Isopropanol	Sigma-Aldrich	PX1838-P
100-mm-Zellkulturschale	Corning	430167
3-Isobutyl-1-methylxanthin	Sigma-Aldrich	I7018
50 ml konisches Kunststoffrohr	Fisher Scientific	50-465-232
70-µ m Zellsieb	Corning	CLS431751
a-MEM	Thermo-Fisher	12561056
Aluminiumfolie	Reynolds Wrap
BODIPY	Thermo-Fisher	D3922
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	05470
Zentrifuge	Eppendorf	5810 R
Kollagenase, Typ I	Thermo-Fisher	17100017
Dexamethason-wasserlösliches	Sigma-Aldrich	D2915
Dimethylsulfoxid, DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Destilliertes Wasser	Thermo-Fisher	15230162
fötales Rinderserum, USDA-zugelassenes	Sigma-Aldrich	F0926
Fungizone/Amphotericin B (250 μg/ml))	Thermo-Fisher	15290018
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Thermo-Fisher	14175095
Hämazytometer mit Deckglas	Sigma-Aldrich	Z359629
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378
Inverses Lichtmikroskop	Nikon	DIAPHOT-TMD
L-Glutamin (200 mM)	Thermo-Fisher	25030081
Laborwippe, 0,5 bis 1,0 Hz	Zuverlässig Wissenschaftliches	Modell 55 Schaukeln
Neutral gepuffertes Formalin (10 %)	Pharmco	8BUFF-FORM
Öl Rot	O Sigma-Aldrich	O0625
Paraformeldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Thermo-Fisher	15140122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4	Thermo-Fisher	10010023
Lysepuffer für rote Blutkörperchen (RBC)	Qiagen	158904
Serologische Pipetten, 2 bis 25 mL	Costar Stripettes
Standard befeuchteter Zellkultur-Inkubator, 37 ° C, 5 % CO2	Sanyo	MCO-17AIC
Trypsin-EDTA (0,25%)	Thermo-Fisher	25200056