Method Article

Erstellung akuter und chronischer experimenteller Modelle der motorischen Tic-Expression bei Ratten

DOI:

10.3791/61743

⸱

May 27th, 2021

 ,  , 
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir präsentieren Protokolle zur Erstellung akuter und chronischer experimenteller Modelle der Tic-Expression bei sich frei verhaltenden Ratten. Die Modelle basieren auf der Implantation von Striatalkanülen und der anschließenden GABA A-Antagonistenanwendung. Das akute Modell verwendet transiente Injektionen, während das chronische Modell verlängerte Infusionen über eine subkutan implantierte Mini-Osmotikpumpe verwendet.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Motorische Tics sind plötzliche, schnelle, wiederkehrende Bewegungen, die die Schlüsselsymptome des Tourette-Syndroms und anderer Tic-Störungen sind. Die Pathophysiologie der Tic-Generation ist mit einer abnormalen Hemmung der Basalganglien verbunden, insbesondere ihrer primären Inputstruktur, dem Striatum. In Tiermodellen sowohl von Nagetieren als auch von nichtmenschlichen Primaten induziert die lokale Anwendung vonGABA-A-Antagonisten wie Bicuculline und Picrotoxin in die motorischen Teile des Striatums eine lokale Enthemmung, was zur Expression motorischer Tics führt.

Hier stellen wir akute und chronische Modelle motorischer Tics bei Ratten vor. Im akuten Modell lösen bikukulline Mikroinjektionen durch eine in das dorsale Striatum implantierte Kanüle die Expression von Tics aus, die für kurze Zeiträume von bis zu einer Stunde anhalten. Das chronische Modell ist eine Alternative, die die Verlängerung der Tic-Expression auf Zeiträume von mehreren Tagen oder sogar Wochen ermöglicht, wobei eine kontinuierliche Infusion von Bikukullin über eine subkutane Mini-Osmotik-Pumpe verwendet wird.

Die Modelle ermöglichen die Untersuchung der Verhaltens- und neuronalen Mechanismen der Tic-Generation im gesamten cortico-basalen Ganglienweg. Die Modelle unterstützen die Implantation zusätzlicher Aufnahme- und Stimulationsgeräte zusätzlich zu den Injektionskanülen und ermöglichen so eine Vielzahl von Anwendungen wie elektrische und optische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnungen. Jede Methode hat unterschiedliche Vor- und Nachteile: Das akute Modell ermöglicht den Vergleich der kinematischen Eigenschaften der Bewegung und der entsprechenden elektrophysiologischen Veränderungen vor, während und nach der Tic-Expression sowie der Auswirkungen von Kurzzeitmodulatoren auf die Tic-Expression. Dieses akute Modell ist einfach zu etablieren; Es ist jedoch auf einen kurzen Zeitraum beschränkt. Das chronische Modell ist zwar komplexer, ermöglicht jedoch die Untersuchung der Tic-Dynamik und der Verhaltenseffekte auf die Tic-Expression über längere Zeiträume. Somit bestimmt die Art der empirischen Abfrage die Wahl zwischen diesen beiden komplementären Modellen der Tic-Expression.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tics sind das bestimmende Symptom des Tourette-Syndroms (TS) und anderer Tic-Störungen. Tics werden als plötzliche, schnelle, wiederkehrende Bewegungen (motorische Tics) oder Vokalisierungen (Vocal Tics)beschrieben 1. Der Tic-Ausdruck schwankt typischerweise in seinen zeitlichen (Frequenz)2 und räumlichen (Intensität, Körperposition)3 Eigenschaften über mehrere Zeitskalen (Stunden, Tage, Monate und Jahre). Diese Veränderungen werden durch verschiedene Faktoren beeinflusst, wie z. B. Umweltmerkmale4,5, Verhaltenszustände6,7und freiwillige und vorübergehende Unterdrückung8.

Obwohl der neuronale Mechanismus, der die motorischen Tics steuert, noch nicht vollständig verstanden ist, haben immer mehr theoretische und experimentelle Studien neue Beweise für seine Natur geliefert9. Derzeit wird angenommen, dass die Pathophysiologie der Tic-Generation die Kortiko-Basalganglien-Schleife (CBG) umfasst und insbesondere mit einer abnormalen Hemmung des Striatums, des primären Basalganglien-Eingangskerns10,11,12, verbunden ist . Frühere Studien an Nagetieren und Primaten haben gezeigt, dass das Striatum durch lokale Anwendung verschiedenerGABA-A-Antagonisten wie Bikukullin und Picrotoxin13 , 14,15,16,17,18enthemmt werden kann . Dieser pharmakologische Eingriff führt zu einer transienten motorischen Expression auf der kontralateralen Seite der Injektion und etabliert so ein robustes akutes Modell von Tic-Störungen mit Gesichts- und Konstruktvalidität. Das akute Modell ist einfach zu induzieren und ermöglicht es, die Auswirkungen der kurzfristigen Modulation wie elektrische und optische Stimulation gleichzeitig mit elektrophysiologischen und kinematischen Aufzeichnungen vor, während und nach der Tic-Expression zu untersuchen. Das akute Modell ist jedoch auf den kurzen Zeitraum nach der Injektion beschränkt. Basierend auf dem akuten Modell haben wir kürzlich ein chronisches Modell der Tic-Erzeugung bei Ratten vorgeschlagen, das eine verlängerte, festverzinsliche Infusion von Bikukullin in das Striatum über eine subkutan implantierte Mini-Osmotikpumpeverwendet 19. Dieses Modell erweitert den Zeitraum der Tic-Expression auf mehrere Tage/Wochen. Die konstante Freisetzung von Bikukullin über einen längeren Zeitraum ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen einer Vielzahl von Faktoren wie pharmakologischen Behandlungen und Verhaltenszuständen auf die Tic-Expression.

Hier stellen wir Protokolle zur Generierung der akuten und chronischen Modelle der Tic-Expression bei Ratten vor. In Abhängigkeit von der spezifischen Forschungsfrage ermöglichen die Protokolle die Feinabstimmung der Parameter einschließlich der einseitigen versus bilateralen Implantation, der Stelle der Tics (entsprechend der somatotopischen Organisation des Striatums)18 und des Winkels der Implantatkanüle (abhängig von der Lage der zusätzlichen implantierten Geräte). Die im chronischen Modell verwendete Methode basiert teilweise auf kommerziellen Produkten, jedoch mit kritischen Anpassungen an das Tic-Modell. In diesem Artikel werden die Anpassungen aufgeführt, die erforderlich sind, um diese Tic-Modelle individuell anzupassen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und überwacht und hielten sich an den National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals und die Bar-Ilan University Guidelines for the Use and Care of Laboratory Animals in Research. Dieses Protokoll wurde vom Nationalen Komitee für Versuche an Versuchstieren im Gesundheitsministerium genehmigt.

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet weibliche Long-Evans-Ratten (akute und chronische Modelle) und weibliche Sprague Dawley-Ratten (akutes Modell) im Alter von 3-10 Monaten, 280-350 g. Die Implementierung dieser Modelle in anderen Stämmen, Gewichten oder Altersgruppen sollte sorgfältig auf unterschiedliche Reaktionen getestet werden.

1. Akutes Modell

  1. Vorbereitung vor der Operation
    1. Implantat-Kanülen-Vorbereitung
      HINWEIS: Die Implantatkanüle ermöglicht lokale bikuline Injektionen in das Striatum.
      1. Schneiden Sie ein Hyporohr aus Edelstahl, 25 G (OD 0.02'', ID 0.015''), um eine Implantatkanüle zu erhalten(Abbildung 1,Gerät #1). Verwenden Sie ein rotierendes Werkzeug, um gerade Kanten zu erzielen. Die Länge der Kanüle hängt von der Zieltiefe der Implantation, dem Winkel der Kanülenimplantation und der endgültigen Zementkappenhöhe ab. Die Tiefe des Implantationsziels muss 2 mm (0,079'') höher sein als das endgültige Injektionsziel, um Gewebeschäden zu vermeiden.
        HINWEIS: Das höchste implantierte Objekt bestimmt die Kappenhöhe.
      2. Schleifen und glätten Sie die Implantat-Kanülen-Kanten, um zusätzliche mechanische Reibung für das Gehirn zu verhindern. Führen Sie eine 30 G (0,01'') Nadel durch, um alle internen Hindernisse zu entfernen.
    2. Dummy-Vorbereitung
      HINWEIS: Der Dummy ist ein abnehmbarer interner Draht, der in der implantierten Kanüle platziert ist. Der Dummy versiegelt die implantierte Kanüle und verhindert so ihre Verstopfung.
      1. Machen Sie einen Dummy, indem Sie einen 0,013 '' Draht mit einem rotierenden Werkzeug schneiden. Der Dummy sollte 3 mm (0,118'') länger sein als die Implantatkanülenlänge(Abbildung 1,Gerät #2).
      2. Setzen Sie den Dummy in die Implantatkanüle ein, bis er das Ende erreicht. Biegen Sie den überschüssigen Draht, indem Sie ihn gegen die Kanüle drücken. Der gebogene Teil sollte bündig mit der Implantatkanüle sein, um zu verhindern, dass der Dummy aus der implantierten Kanüle fällt und die Ratte ihn entfernt.
    3. Injektor-Vorbereitung
      HINWEIS: Der Injektor, bestehend aus einem flexiblen Schlauch und einer Injektionskanüle (Abbildung 1, Gerät #3), ermöglicht eine direkte bikukulline Injektion in das Striatum.
      1. Schneiden Sie ein 70 cm (27.559'') flexibles Polymer-Mikrobohrrohr (OD 0.06'', ID 0.02'') (Abbildung 1, Gerät #3.1).
        HINWEIS: Die Länge des flexiblen Rohrs wird durch den Abstand zwischen dem Versuchskäfig und dem Standort der Infusionspumpenmaschine definiert. Es muss lang genug sein, um die freie Bewegung der Ratte während der Injektionszeit zu ermöglichen, aber nicht zu lang, um zu vermeiden, dass sich die Ratte darin verheddert (siehe Abbildung 3A).
      2. Schneiden Sie ein Hyporohr aus Edelstahl, 30 G (OD 0.012'', ID 0.007''), um Injektionskanüle zu erhalten(Abbildung 1,Vorrichtung #3.2). Verwenden Sie ein rotierendes Werkzeug, um gerade Kanten zu erzielen. Es sollte 5 mm (0,197'') länger als die Implantatkanüle messen: 2 mm (0,079'') länger als die implantierte Kanüle im Gehirn, um das endgültige Injektionsziel zu erreichen, und 3 mm (0,118''), um es in den flexiblen Schlauch einzuführen.
      3. Schleifen und glätten Sie die Spitze der Injektionskanüle, wodurch zusätzliche mechanische Reibung für das Gehirn verhindert wird. Setzen Sie einen Draht mit einem Durchmesser von 0,005 '' ein, um zu überprüfen, ob er ungehindert ist.
      4. Führen Sie 3 mm (0,118'') der Injektionskanüle in das flexible Rohr ein und kleben Sie die Verbindung zwischen ihnen, um einen Injektor zu erhalten. Verwenden Sie Cyanacrylat (CA) Klebstoff und CA Beschleuniger.
      5. Befestigen Sie eine Spritze mit 25 G Nadel (0,018''), die mit sterilem Wasser gefüllt ist, an den Injektor und waschen Sie sie durch. Dadurch wird sichergestellt, dass die Strömungsorientierung, die aus der Injektionskanüle kommt, gerade und mühelos ist. Wenn der Fluss nicht gerade ist, verwenden Sie die Spitze der 30 G (OD 0,01 '') Nadel, um alle Hindernisse zu entfernen und das Injektionskanülenloch zu vergrößern und den Fluss erneut zu überprüfen.
    4. Kanülenhalter-Vorbereitung
      HINWEIS: Der Kanülenhalter ist mit dem stereotaxischen Arm verbunden und hält die Implantatkanüle während der Implantation. Der Kanülenhalter besteht aus Kanülenhalterfuß und Kanülenhalterble blei, die miteinander verklebt sind (Bild 1, Gerät #4). Während der Implantation wird die Kanülenhalterbasis am stereotaktischen Arm befestigt und die Kanülenhalterleitung an der Implantatkanüle befestigt.
      1. Kanülenhalterfuß: Geschnitten 10 cm (3.947'') aus Edelstahl, 22 G (OD 0.028'', ID 0.017'') Hyporohr (Abbildung 1, Gerät #4.1).
      2. Kanülenhalter-Leitung: Schneiden Sie 0,013'' Draht auf eine Länge von 3 mm (0,118'') länger als die gewünschte Implantatkanüle (Abbildung 1, Gerät #4.2).
      3. Setzen Sie die Kanülenhalterleitung in die Kanülenhalterbasis ein und kleben Sie die Verbindung zwischen ihnen mit CA-Kleber und CA-Beschleuniger. Die Leitung sollte 1 mm (0,039'') kürzer sein als die Implantatkanüle, um Gewebeschäden während der Implantation zu vermeiden.
    5. Bikukulinpräparation: Bicucullin-Methiodid in physiologischer Kochsalzlösung oder künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/μL auflösen. Die gelöste Bikukulline in 1 ml Spritzen teilen, mit Aluminiumfolie abdecken und bei -20 °C einfrieren, bis sie benötigt wird. Bei Bedarf die Spritze vor Gebrauch auftauen.
  2. Chirurgie
    1. Induzieren Sie die Anfangsanästhesie, indem Sie die Ratte in eine entworfene Kammer legen und 4-5% Isofluran gemischt mit einem Sauerstoff mit einer Rate von 0,5-1 L / min abgeben. Dann injizieren Sie die Ratte intramuskulär (IM oder IP) mit Ketamin und Xylazin (100 bzw. 10 mg/ kg) Mischung.
    2. Rasieren Sie den Kopf der Ratte mit einem elektrischen Klipper.
    3. Geben Sie Lidocain-Gel in die Ohren der Ratte. Legen Sie Vaseline auf die Augen der Ratte, um Hornhauttrocknung und Trauma zu verhindern.
    4. Befestigen Sie die Ratte im stereotaktischen Rahmen mit Ohrbügeln und Zahnstange.
    5. Tupfen Sie die Kopfhaut der Ratte mit Povidonjod ab und dann mit Alkohol, um den Bereich zu sterilisieren. Entlang der gewünschten Schnittlinie mit 0,5 - 1% Lidocainlösung subkutan (SC) infiltrieren. Machen Sie mit einer Skalpellklinge einen Schnitt entlang der Kopfhaut.
    6. Ziehen Sie die Faszie zu den Rändern, um den Operationsbereich zu öffnen.
    7. Reinigen Sie den Schädel mit steriler Kochsalzlösung mit Wattestäbchen. Im Falle einer Blutung verwenden Sie einen Kauterizer, um die Blutkapillar zu kauterisieren. Dieser Schritt ist entscheidend für die Stabilität der Kappe im Laufe der Zeit.
    8. Klemmen Sie die Faszie mit vier gekrümmten Hämostaten (zwei vordere, zwei hintere) ein, um die Operationsstelle zu vergrößern.
    9. Messen Sie die Bregma- und Lambda-Koordinaten. Nivellieren Sie die dorsoventralen (DV) Koordinaten der beiden Punkte, so dass sie sich in einem Bereich von 100 μm befinden.
    10. Messen und markieren Sie mit dem stereotaxischen Gerät die Koordinaten der interessierenden Bereiche und der zu implantierenden Ankerschrauben. Die Koordinaten der geraden Implantationskanüle für die Tic-Induktion im Vordergliedmaßenbereich sind: AP: +1 bis +1,5, ml: ±2,5, DV: 3; Hinterbeine Fläche: AP: -0,4 bis -0,5, ml: ±3,5, DV:318,20.
      HINWEIS: Im Falle der Implantation mehrerer Geräte, die die Implantation von Kanülen gerade verhindern, ändern Sie den Winkel der Kanülenimplantation und ihre Koordinaten entsprechend (Vordergliedmaßenkoordinaten: AP: +2,7, ml: ±2,5, DV: 3, Winkel 15° von vorne nach posterior).
    11. Bohren Sie Löcher in den Schädel unter dem Mikroskop. Verwenden Sie eine Dentalbohrmaschine mit 1/4-1/2 Bit-Hartmetall-Rundbohrern. Um das Risiko von Hirnverletzungen zu minimieren, passen Sie die Bohrgeschwindigkeit entsprechend den Bohrfähigkeiten an und vermeiden Sie mechanischen Druck. Bohren Sie, bis das Gehirn sichtbar ist, für etwa 1 mm. Nehmen Sie Blut mit einem Wattestäbchen auf und waschen Sie es mit steriler Kochsalzlösung.
      HINWEIS: Die Ankerschrauben dienen zur Stabilisierung der Kappe. Stellen Sie sicher, dass sich die Schrauben in beiden Hemisphären und entlang der vorderen hinteren Achse befinden.
    12. Kanülenimplantation
      1. Schrauben Sie die Ankerschrauben in die Löcher. Verwenden Sie Schrauben aus Edelstahl #0 x 1/8.
        HINWEIS: Die Anzahl der Ankerschrauben hängt von der Gesamtzahl der implantierten Geräte ab. Erdschrauben (z.B. für die elektrischen Aufnahmen oder elektrischen Stimulationen) sollten die Gehirnoberfläche erreichen.
      2. Befestigen Sie den Kanülenhalter am stereotaktischen Arm.
      3. Schieben Sie die Implantatkanüle auf den Kanülenhalter. Positionieren Sie die Implantatkanüle langsam über dem Loch, bis sie das Gehirn erreicht.
      4. Messen Sie die DV-Koordinaten ausgehend von der Gehirnoberfläche. Senken Sie die Implantatkanüle bis zum Implantationsziel. Nehmen Sie das aus dem Loch kommende Blut mit einem Wattestäbchen auf, waschen Sie es mit steriler Kochsalzlösung und trocknen Sie es dann gründlich ab.
      5. Kleben Sie die implantierte Kanüle mit Gelkleber auf den Schädel. Warten Sie, bis es trocken ist.
      6. Tragen Sie Zahnzement entlang der implantierten Kanüle auf, um ihn am Schädel zu befestigen. Lassen Sie 2 mm (0,079'') vom oberen Ende ausspannen, um das Einsetzen des Dummys zu ermöglichen. Warten Sie, bis es trocken ist.
        HINWEIS: Legen Sie keinen Zement auf den Kanülenhalter.
      7. Heben Sie den Kanülenhalter an und lassen Sie die implantierte Kanüle an Ort und Stelle.
      8. Setzen Sie den Dummy in die implantierte Kanüle ein.
      9. Implantieren Sie alle anderen Geräte wie Aufnahmearrays, optische Fasern, Stimulationselektroden usw. Tragen Sie Zahnzement auf den Rest des Schädels auf und bedecken Sie alle Implantate.
      10. Injizieren Sie 3 ml Ringer-Lösung bei Raumtemperatur und Carprofen 5 mg/kg SC21.
      11. Überwachen Sie die Ratte, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt (das Tier ist aufrecht, hat die Kontrolle über seine Atemwege und ist nicht in Aspirationsgefahr). Bringen Sie die Ratte zur vollständigen Genesung in ihren Heimatkäfig zurück.
  3. Mikroinjektionen
    HINWEIS: Während der Injektion ist es wichtig zu überprüfen, ob der Fluss der Bikukulline intakt ist. Dies kann geschehen, indem sich eine kleine Luftblase im Injektor bildet und seine Bewegung überwacht wird. Das verbleibende Volumen des Injektors kann mit Kochsalzlösung gefüllt werden, so dass kein Bikukullin verschwendet wird.
    1. Befestigen Sie den Injektor mit einer 25 G Nadel (OD 0,018'') an einer bikukulinen Spritze. Füllen Sie ~ 1/3-1/2 des Injektors und entfernen Sie die Spritze, so dass sich eine kleine Luftblasebildung erlässt.
    2. Befestigen Sie den Injektor mit einer 25 G Nadel (OD 0,018'') an einer sterilen, mit Kochsalzlösung gefüllten Spritze. Füllen Sie den Injektor, bis die Bikukulline das Ende erreicht und ein kleiner Tropfen herauskommt.
    3. Entfernen Sie den Kolben einer 10 μL Präzisions-Glasmikrospritze.
    4. Schneiden Sie ein kurzflexibles Polymerrohr (~3 cm, 1.181'') und befestigen Sie es an der Präzisions-Mikrospritze aus Glas.
    5. Verbinden Sie das andere Ende des kurzflexiblen Röhrchens mit einer 1 mL Spritze, 25 G Nadel (OD 0.018''), die mit sterilem Wasser gefüllt ist.
    6. Spritzen Sie Wasser durch das kurzflexible Rohr in die Präzisions-Glasmikrospritze, bis Wasser aus ihr herauskommt. Trennen Sie das kurzflexible Rohr.
    7. Setzen Sie den Kolben wieder ein, bis er die ~7 μL-Marke auf der Präzisions-Glasmikrospritze erreicht.
    8. Setzen Sie die Präzisions-Glasmikrospritze in den bestimmten Schlitz in der Infusionspumpenmaschine ein.
    9. Befestigen Sie den Injektor an der Präzisions-Glasmikrospritze und konfigurieren Sie die Einstellungen auf eine Rate von 0,35 μL/min und ein Gesamtvolumen von 0,35 μL.
    10. Legen Sie ein Papiertuch unter die Injektorspitze. Markieren Sie die Luftblasenposition auf dem Injektor, starten Sie die Infusionspumpenmaschine und überprüfen Sie, ob ein bikukulliner Tropfen auftritt. Markieren Sie nach der Injektion erneut die Position der Luftblase.
      HINWEIS: Die Differenz zwischen den beiden Markierungen entspricht der gewünschten Differenz während der experimentellen Injektion.
    11. Legen Sie die Ratte in den Versuchskäfig und entfernen Sie den Dummy.
    12. Setzen Sie den Injektor bis zum Ende in die implantierte Kanüle ein (siehe Abbildung 3A).
    13. Starten Sie die Infusionspumpenmaschine. Stellen Sie sicher, dass sich die Luftblase bewegt. Starten Sie die Stoppuhr, um die Tic-Initiierungs- und Beendigungszeiten zu verfolgen.
    14. Entfernen Sie eine Minute nach der Injektion den Injektor und setzen Sie den Dummy langsam wieder ein.
      HINWEIS: Wenn Sie den Dummy nach der Injektion einsetzen, wird die Bikukulline in das Injektionsziel gedrückt.
  4. Nach der Injektion
    1. Trennen Sie den Injektor von der Präzisions-Glasmikrospritze.
    2. Waschen Sie die verbleibende Lösung mit einer luftgefüllten Spritze aus dem Injektor aus. Reinigen Sie den Injektor mit sterilem Wasser und lassen Sie ihn dann ab, indem Sie Luft durch den Injektor einspritzen.
    3. Trennen Sie die Präzisions-Glasmikrospritze von der Infusionspumpenmaschine und reinigen Sie sie mit sterilem Wasser.

2. Chronisches Modell

  1. Vorbereitung vor der Operation
    1. Kanülen-Guide-Vorbereitung
      HINWEIS: Die Kanülenführung ist Teil des Infusionsschlauches und wird verwendet, um die Infusionskanüle während der Implantation am Kanülenhalter zu befestigen.
      1. Schneiden Sie 12 mm (0,472'') Edelstahl, 25 G (OD 0,02'', ID 0,015'') Hyporohr, um eine Kanülenführung zu erhalten (Abbildung 2,Gerät #1). Verwenden Sie ein rotierendes Werkzeug, um gerade Kanten zu erzielen.
      2. Bereiten Sie einen Kanülenhalter wie in Schritt 1.1.4 beschrieben vor. Setzen Sie den Kanülenhalter in die Kanülenführung ein, um zu überprüfen, ob er richtig befestigt ist, und entfernen Sie ihn.
    2. Infusions-Kanülen-Zubereitung
      HINWEIS: Die Infusionskanüle ist auch ein Teil des Infusionsschlauches. Es wird in das Endziel des Striatums implantiert und ermöglicht eine fokale Infusion von Bikukullin.
      1. Schneiden Sie Edelstahl, 30 G (OD 0.012'', ID 0.007'') Hyporöhrchen, um eine Infusionskanüle zu erhalten. Verwenden Sie ein rotierendes Werkzeug, um gerade Kanten zu erzielen. Die Gesamtlänge der Infusionskanüle ist die Summe der gewünschten Implantationstiefe zuzüglich eines Sicherheitsfaktors (~1-2 mm, 0,039''-0,079''), des infusionskanülen gebogenen Teils (2 mm, 0,079''), der Überlappung mit der Kanülenführung (3 mm, 0,118'') und des horizontalen Teils (4 mm, 0,157'')(Abbildung 2,Vorrichtung #2).
        HINWEIS: Im Gegensatz zum akuten Modell ist die Implantationstiefe gleich dem endgültigen Infusionsziel.
      2. Führen Sie einen Draht mit einem Durchmesser von 0,005 '' in die Infusionskanüle ein und biegen Sie sie an der vorgesehenen Stelle in eine L-Form. Der vertikale Teil entspricht der gewünschten Implantationstiefe plus 4-5 mm (0,157''-0,197''), und der horizontale Teil ist 4 mm (0,157'') lang.
        HINWEIS: Das Einsetzen des Innendrahtes verhindert eine Verstopfung der Kanüle beim Biegen.
    3. Flexible Katheterschlauchvorbereitung
      HINWEIS: Es ist auch ein Bestandteil des Infusionsschlauches. Es verbindet die Infusionskanüle über einen Schlauchadapter mit der Mini-Osmotik-Pumpe.
      1. 8 cm (3.149'') Polyethylen (PE)-10 Schlauch (ID 0.011'', OD 0.025'') geschnitten (Abbildung 2, Gerät #3).
        HINWEIS: Die Länge des Katheters wird durch den Abstand zwischen dem Implantationsziel und der Pumpenposition bestimmt, so dass Kopf und Hals der Ratte frei bewegen können (siehe Abbildung 3B).
    4. Montage des Infusionsschlauches
      HINWEIS: Das Infusionsröhrchen leitet die Bikukulline von der Mini-Osmotikpumpe zum Gehirn. Es besteht aus der Kanülenführung, der Infusionskanüle, dem flexiblen Katheterschlauch, dem Schlauchadapter und dem Strömungsmoderator (Bild 2).
      1. Entfernen Sie den Innendraht von der Infusionskanüle. Untersuchen Sie die Kanüle unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass ihre Kanten auf beiden Seiten offen und sauber sind. Wenn nicht, verwenden Sie eine 30 G (OD 0,01'') Nadel, um es zu öffnen.
      2. Kleben Sie die Kanülenführung mit CA-Kleber und CA-Beschleuniger auf den vertikalen Abschnitt der Infusionskanüle in der Nähe des gebogenen Teils auf die Überlappung von 3 mm (0,118'').
      3. Führen Sie den horizontalen Teil der Infusionskanüle in den flexiblen Katheterschlauch ein. Die Überlappung sollte mindestens 2 mm (0,079'') groß sein.
      4. Werfen Sie die lichtdurchlässige Kappe des Pumpendurchflussmoderators aus. Dies zeigt das kurze Kanülenrohr aus Edelstahl (Abbildung 2, Gerät #5.1).
        HINWEIS: Der Flow-Moderator ist Teil des Mini-Osmotik-Pumpen-Kits. Es besteht aus einer durchscheinenden Kappe, einem kurzen Kanülenteil, einem weißen Flansch und einem langen Kanülenteil. Der lange Kanülenteil wird in die Mini-Osmotikpumpe eingeführt und der kurze Kanülenteil wird über einen Schlauchadapter mit dem Katheterschlauch verbunden.
      5. Tauchen Sie den Schlauchadapter (Abbildung 2, Gerät #4) in 70% Alkohol. Warten Sie einige Minuten, bis das Material aufquellen kann.
      6. Befestigen Sie den Schlauchadapter am kurzen Kanülenteil des Strömungsmoderators, bis er den weißen Flansch berührt (Abbildung 2, Gerät #5.2). Der Schlauchadapter schrumpft in der Luft, um eine dicht verschlossene Verbindung zu bilden.
      7. Setzen Sie den flexiblen Katheterschlauch in das offene Ende des Schlauchadapters ein, bis er den kurzen Kanülenteil des Strömungsmoderators berührt.
      8. Halten Sie das lange Kanülenteil (Abbildung 2, Gerät #5.3) mit einem Clipständer und kleben Sie alle Verbindungen. Die Verbindungen bestehen zwischen dem Schlauchadapter und dem weißen Flansch, dem Schlauchadapter und dem flexiblen Katheterschlauch und schließlich dem flexiblen Katheterschlauch und dem horizontalen Teil der Infusionskanüle. Warten Sie mehrere Stunden, bis der Kleber vollständig trocken ist (abhängig von der Klebstoffart).
        HINWEIS: Verwenden Sie PE-kompatiblen Klebstoff, um zu verhindern, dass sich die Verbindungen lösen.
      9. Injizieren Sie steriles Wasser durch den langen Kanülenteil des Infusionsröhrchens mit einer 27 G (0,014'') stumpfen Nadel. Stellen Sie sicher, dass das Wasser reibungslos durch die Infusionskanüle fließt. Injizieren Sie Luft durch das Infusionsrohr, um das Wasser abzulassen.
    5. Ansaugung der Mini-Osmotikpumpe
      HINWEIS: Die Grundierung ist ein Startvorgang, der es der Pumpe ermöglicht, die Infusion unmittelbar nach der Implantation zu starten.
      1. Füllen Sie ein Heizbad mit Wasser bei Körpertemperatur (~ 37 ° C). Füllen Sie ein kleines Becherglas mit steriler Kochsalzlösung und legen Sie es in das Heizbad.
      2. Wickeln Sie die Mini-Osmotikpumpe mit einem Papiertuch ein und befestigen Sie sie vertikal mit der Öffnung nach oben, indem Sie einen Cliphalterständer verwenden.
      3. Füllen Sie die Pumpe mit ACSF mit einer Spritze mit einer 27 G (0,014'') stumpfen Nadel. Während Sie die Spritze entfernen, injizieren Sie weiterhin die ACSF, um das Eindringen von Luft zu verhindern. Eine ACSF-Blase erscheint in der Öffnung der Pumpe.
        HINWEIS: Die anfängliche ACSF-Infusion ermöglicht es der Ratte, sich vollständig von der Operation zu erholen, bevor Tics induziert werden. Optional kann die mit Bikuline gefüllte Pumpe während der primären Operation implantiert werden, um den folgenden Pumpenaustausch zu vermeiden, aber sie ist nicht optimal19.
      4. Befestigen Sie eine Spritze, 27 G (0,014'') stumpfe Nadel an den langen Kanülenteil des Infusionsröhrchens und injizieren Sie ACSF durch diese. Während Sie die Spritze entfernen, injizieren Sie weiterhin die ACSF, um das Eindringen von Luft zu verhindern. Eine ACSF-Blase erscheint im langen Kanülenteil.
      5. Setzen Sie den langen Kanülenteil in die Pumpe ein, blasen Sie in die Blase. Eine ACSF-Blase sollte an der Spitze der Infusionskanüle erscheinen.
      6. Legen Sie die Pumpe in das Becherglas. Grundieren Sie die Pumpe, die am Infusionsschlauch befestigt ist, für mindestens 4-6 Stunden (bei ~ 37 °C) vor der Pumpenimplantation. Stellen Sie sicher, dass nur die Pumpe die Kochsalzlösung kontaktiert.
    6. Pumpenimplantationschirurgie
      1. Betäubung der Ratte gemäß dem Anästhesieprotokoll. Siehe Schritt 1.2.1.
      2. Rasieren Sie den Kopf und Rücken der Ratte mit einem elektrischen Klipper, leicht hinter dem Schulterblatt.
      3. Führen Sie die grundlegenden Schritte in der Operation aus, wie in den Schritten 1.2.3-1.2.11 beschrieben. Der Schnitt sollte entlang der Kopfhaut bis zum Hinterhauptknochen erfolgen.
      4. Sterilisieren Sie einen großen Hämostaten (~14 cm lang, 5.512'') im Autoklaven. Führen Sie den Hämostat durch den Schnitt ein und erstellen Sie eine subkutane Tasche im Rücken der Ratte, indem Sie ihn abwechselnd durch die Mittelkapelllinie unter der Haut öffnen und schließen.
        HINWEIS: Die Tasche sollte groß genug sein, um die Pumpe zu enthalten und sie leicht bewegen zu lassen.
    7. Mini-osmotische Pumpen- und Infusionsschlauchimplantation
      1. Befestigen Sie den Kanülenhalter am stereotaktischen Arm und platzieren Sie ihn zur Implantation in der gewünschten Position.
      2. Nehmen Sie die Pumpe aus dem Heizbad und legen Sie sie auf den Rücken der Ratte, der mit einem Papiertuch bedeckt ist.
      3. Schieben Sie die Kanülenführung des Infusionsschlauches auf den Kanülenhalter.
      4. Halten Sie die Pumpe mit einem Hämostat und führen Sie sie vorsichtig in die unterkutane Tasche ein.
      5. Implantieren Sie die Ankerschrauben.
        HINWEIS: Implantieren Sie die Ankerschrauben nach dem Einsetzen der Pumpe, um eine Verstopfung der Taschenöffnung zu vermeiden, und vor der Kanülenimplantation, um eine Kanülenverschiebung zu vermeiden.
      6. Implantieren Sie die Infusionskanüle in das Target und kleben Sie sie mit Gelkleber auf den Schädel. Warten Sie, bis es trocken ist. Die Koordinaten für die Vordergliedmaßen-Tic-Induktion sind: AP: +1 bis +1,5, ml: ±2,5, DV: 5.
      7. Tragen Sie Zahnzement entlang der Infusionskanüle auf, um ihn am Schädel zu befestigen. Warten Sie, bis es trocken ist.
      8. Heben Sie den Kanülenhalter an und lassen Sie die implantierte Kanüle an Ort und Stelle.
      9. Implantieren Sie alle anderen Geräte. Tragen Sie Zahnzement auf den Rest des Schädels auf und bedecken Sie alle Implantate. Lassen Sie genügend flexible Katheterschläuche in der Unterhauttasche unbefestigt, um die freie Bewegung der Ratte zu ermöglichen.
        HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich keine freiliegenden Bereiche zwischen dem Schädel und der Taschenöffnung befinden und dass der Katheter nicht gebogen ist.
      10. Schließen Sie die Operation wie in den Schritten 1.2.12.10-1.2.12.11 beschrieben ab.
  2. Pumpenersatzchirurgie
    HINWEIS: Jeder Mini-osmotische Pumpentyp hat seine eigene vorgegebene Abgabeinfusionszeit. Daher sollte die Pumpenersatzoperation vor dem Verfallsdatum durchgeführt werden.
    1. Vorbereitung vor der Operation
      1. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. Füllen Sie die Pumpe mit Bikukullin mit einer Spritze mit einer 27 G (0,014'') stumpfen Nadel. Während Sie die Spritze entfernen, injizieren Sie weiterhin Bikukullin, um das Eindringen von Luft zu verhindern.
      3. Setzen Sie den Durchflussmoderator (an der transluzenten Kappe befestigt) in die Pumpe ein.
      4. Legen Sie die Pumpe in das Becherglas. Grundieren Sie die Pumpe für mindestens 4-6 Stunden (bei ~ 37 °C) vor dem Pumpenwechsel.
    2. Chirurgie
      1. Betäuben Sie die Ratte (siehe Schritt 1.2.1.1) und rasieren Sie ihren Rücken mit einem elektrischen Clipper.
      2. Tupfen Sie den Rücken der Ratte mit Povidonjod und dann mit einem Alkoholtuch ab, um den Bereich zu sterilisieren. Infiltrieren Sie entlang der gewünschten Schnittlinie mit einer 0,5-1% igen Lidocainlösung (SC).
      3. Machen Sie einen Schnitt auf der Haut über der implantierten Pumpe. Waschen Sie die Tasche mit ACSF bei Raumtemperatur und trocknen Sie sie mit Mullpolstern ab. Verwenden Sie autoklavierte Einwegvorhänge, um den Bereich in der Nähe des Schnitts abzudecken.
      4. Trennen Sie die ACSF-gefüllte Pumpe mit einem Hämostat vom Strömungsmoderator und entsorgen Sie sie.
      5. Entfernen Sie die mit Bikuline gefüllte Pumpe aus dem Heizbad. Lösen und entsorgen Sie den Durchflussmoderator von der mit Bikuline gefüllten Pumpe.
      6. Befestigen Sie die mit Bikuline gefüllte Pumpe vorsichtig am implantierten Strömungsmoderator. Vermeiden Sie es, die umgebende Haut zu berühren.
        HINWEIS: Die Schritte 2.2.2.4-2.2.2.6 sollten schnell ausgeführt werden, um Luftblasen zu vermeiden. Die Pumpe sollte jedoch langsam eingeführt werden, um ein schnelles Eindringen von Bikuline in das Gehirn zu verhindern.
      7. Drücken Sie die beiden Ränder des Schnitts mit einer Zette eng zusammen. Kleben Sie die Schnittlinie mit einem Gewebekleber. Alternativ schließen Sie den Schnitt mit Nähten.
      8. Tupfen Sie den Bereich mit Povidonjod ab und schließen Sie die Operation wie in den Schritten 1.2.12.10-1.2.12.11 beschrieben ab.

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Results

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Protokolle zur Erstellung der akuten und chronischen Modelle für die Tic-Induktion bei Ratten wurden oben vorgestellt. Die Protokolle decken die vollständige Vorbereitung auf Operationen und Experimente ab (Abbildung 1 für das akute Modell, Abbildung 2 für das chronische Modell). Die Anwendung von Bicuculline in die motorischen Bereiche des Striatums führt zur Expression von anhaltenden motorischen Tics. Tics erscheinen auf der kontralateralen Seite der Anwendun...

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Discussion

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In diesem Manuskript haben wir die Protokolle der akuten und chronischen Modelle für die Tic-Induktion bei einer sich frei verhaltenden Ratte detailliert beschrieben. Diese Protokolle beschreiben die Vorbereitung aller Komponenten, die Operation und den experimentellen Prozess, der für die Anpassung an spezifische Forschungsbedürfnisse angepasst werden kann. Das Hauptprinzip, das diesen Modellen zugrunde liegt, ist die direkte lokale Anwendung von Bicuculline auf die motorischen Bereiche des Striatums, von dem bekannt is...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgements

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Diese Studie wurde teilweise durch ein Stipendium der Israel Science Foundation (ISF) unterstützt (297/18). Die Autoren danken M. Bronfeld für die Etablierung des akuten Nagetiermodells und M. Israelashvili für ihre Kommentare.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AnkerschraubenMicro FastenersSMPPS0002#0 x 1/8 - Flachkopf Blechschrauben
Bicuculline MethiodidSigma Aldrich14343
Cyanoacrylat (CA) BeschleunigerZapPT29
Cyanoacrylat (CA) KleberBSIIC-2000Dieser Kleber hat sich als stärker erwiesen als andere
ZahnzementColteneH00322Hygenic Perm Repair Material Reline Resin Self Cure
Glue GelLoctiteUltra Gel Control
HämostatWPI501242Jeder Hämostat mit einer Größe von ca. 14 cm wäre ausreichend
Hypo-Tube, extra dünnwandig 25GKomponentenlieferfirmaHTX-25X
Hypotube, normal wandig 22GKomponentenzulieferfirmaHTX-22R
Hypo-Rohr, normale Wand 30GKomponentenzulieferfirmaHTX-30R
InfusionspumpenmaschineNew Era Pump SystemsNE-1000
Mini-OsmotispumpeALZET20011.0µ l pro Stunde, 7 Tage
PE-kompatibler KlebstoffCEYSSpezial schwierige Kunststoffe (geeignet für PE)
PE-10 KatheterschlauchALZETPE-10ID = 0,28mm, AD = 0,61mm
Präzisionsglas-Mikrospritze, 10&Mikro; lHamilton800651701 RNR 10µ l syr (22s/51/3)
Gewebekleber3M1469SbVetbond
SchlauchadapterCMA3409500
Tygon Mikrobohrung, 0,02 Zoll ID * 0,06 ODKomponentenlieferfirmaTND80-020
Draht 0,005 ZollKomponentenlieferfirmaGWX-0050
Draht 0,013 ZollKomponentenlieferfirmaGWX-0130

References

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