Methodenartikel

Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) in der Skelettmuskulatur der Ratte

DOI:

10.3791/61750

⸱

9. Juni 2021

 ,  ,  , 
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) aus dem Skelettmuskel der Ratte. Die Verwendung der Ratte in Muskelverletzungsmodellen bietet eine erhöhte Gewebeverfügbarkeit von atrophischen Muskeln für die Analyse und ein größeres Repertoire an validierten Methoden zur Beurteilung von Muskelkraft und Gang bei frei beweglichen Tieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibro-adipogene Vorläufer (FAPs) sind residente interstitielle Zellen in der Skelettmuskulatur, die zusammen mit myogenen Vorläufern (MPs) eine Schlüsselrolle bei der Homöostase, Verletzung und Reparatur von Muskeln spielen. Aktuelle Protokolle zur Identifizierung und Isolierung von FAPs verwenden Durchflusszytometrie/Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und Studien zur Bewertung ihrer Funktion in vivo wurden bisher ausschließlich an Mäusen durchgeführt. Die größere inhärente Größe der Ratte ermöglicht eine umfassendere Analyse von FAPs in Skelettmuskelverletzungsmodellen, insbesondere bei stark atrophischen Muskeln oder wenn Forscher eine erhebliche Gewebemasse benötigen, um mehrere nachgeschaltete Assays durchzuführen. Die Ratte bietet zusätzlich eine größere Auswahl an Muskelfunktionsassays, die keine Sedierung oder Tötung von Tieren erfordern, wodurch die Morbidität und der Tiereinsatz minimiert werden, indem sie serielle Bewertungen ermöglicht. Die für Mäuse optimierten Durchflusszytometrie/FACS-Protokolle sind speziesspezifisch und insbesondere durch die Eigenschaften kommerziell erhältlicher Antikörper eingeschränkt. Sie wurden nicht für die Trennung von FAPs von Ratten oder stark fibrotischen Muskeln optimiert. Es wurde ein Durchflusszytometrie/FACS-Protokoll zur Identifizierung und Isolierung von FAPs und MPs sowohl aus gesunden als auch aus entferneten Rattenskelettmuskeln entwickelt, das sich auf die differentielle Expression der Oberflächenmarker CD31, CD45, Sca-1 und VCAM-1 stützt. Da rattenspezifische, durchflusszytometrie-validierte primäre Antikörper stark begrenzt sind, wurde eine interne Konjugation des Antikörpers, der auf Sca-1 abzielt, durchgeführt. Mit diesem Protokoll wurde die erfolgreiche Sca-1-Konjugation bestätigt und die durchflusszytometrische Identifizierung von FAPs und MPs durch Zellkultur und Immunfärbung von FACS-isolierten FAPs und MPs validiert. Schließlich berichten wir über einen neuartigen FAPs-Zeitverlauf in einem verlängerten (14 Wochen) Rattendenervierungsmodell. Diese Methode bietet den Forschern die Möglichkeit, FAPs in einem neuartigen Tiermodell zu untersuchen.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) sind eine Population von residenten multipotenten Vorläuferzellen in der Skelettmuskulatur, die eine entscheidende Rolle bei der Homöostase, Reparatur und Regeneration von Muskeln spielen und umgekehrt auch pathologische Reaktionen auf Muskelverletzungen vermitteln. Wie der Name schon sagt, wurden FAPs ursprünglich als Vorläuferpopulation mit dem Potenzial identifiziert, sich in Fibroblasten und Adipozyten zu differenzieren1 und galten als die Schlüsselmediatoren der Fibrofettinfiltration der Skelettmuskulatur bei chronischen Verletzungen und Krankheiten. Weitere Studien ergaben, dass FAPs zusätzlich zur Osteogenese und Chondrogenesefähigsind 2,3,4. So werden sie in der Literatur weiter gefasst als mesenchymale oder stromale Vorläufer 3 ,5,6,7,8. Bei akuten Skelettmuskelverletzungen helfen FAPs indirekt bei der regenerativen Myogenese, indem sie sich vorübergehend vermehren, um eine günstige Umgebung für aktivierte Muskelsatellitenzellen und ihre nachgeschalteten myogenen Vorläufer (MPs) -Gegenstücke1,9,10zuschaffen. Parallel zur erfolgreichen Regeneration durchlaufen FAPs eine Apoptose und bringen ihre Anzahl auf die Ausgangswerte1,9,10,11zurück. Im Gegensatz dazu überschreiben FAPs bei chronischen Muskelverletzungen pro-apoptotische Signale, was zu ihrer Persistenz9, 10, 11und abnormaler Muskelreparatur führt.

In vivo-Studien, die die zellulären und molekularen Mechanismen, mit denen FAPs Muskelreaktionen vermitteln, bewerten, haben bis heute murine Tiermodelleverwendet 1,7,9,10,11,12,13,14. Während gentechnisch veränderte Mäuse leistungsfähige Werkzeuge für diese Analysen sind, begrenzt die geringe Größe des Tieres die Gewebeverfügbarkeit für Studien in langfristigen lokalisierten Verletzungsmodellen, in denen Muskelschwund tiefgreifend sein kann, wie z.B. traumatische Denervierung. Darüber hinaus erfordert die Messung der Muskelkraft und der körperlichen Funktion Ex-vivo- oder In-situ-Messungen, die eine Beendigung der Maus erfordern, oder In-vivo-Methoden, die eine Operation und/oder eine Vollnarkose erfordern, um die Beurteilung der kontraktilen Muskelleistung zu ermöglichen15,16,17,18,19,20 . Bei Ratten existieren gut validierte und global genutzte Muskelfunktionsanalysen sowie Analysen für komplexere motorische Verhaltensweisen wie Ganganalysen (z. B. Ischiasfunktionsindex, CatWalk-Analyse) und werden bei wachen und sich spontan bewegenden Tieren durchgeführt21,22,23,24 . Dies optimiert zusätzlich die Prinzipien der minimalen Morbidität im Tierversuch und die Anzahl der verwendeten Versuchstiere. Die Ratte bietet dem FAPs-Forscher dadurch die zusätzliche Flexibilität eines größeren verletzten Muskelvolumens für Protein- und Zellanalysen und die Möglichkeit, serielle Bewertungen der statischen und dynamischen funktionellen Aktivität und des Verhaltens von Muskelkomplexen im Alarmtier durchzuführen.

FAPs wurden in erster Linie identifiziert und aus ganzen Muskelproben mittels Durchflusszytometrie bzw. Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert. Dies sind laserbasierte Assays, die in der Lage sind, mehrere spezifische Zellpopulationen basierend auf charakteristischen Merkmalen wie Größe, Granularität und einer spezifischen Kombination von Zelloberfläche oder intrazellulären Markern zu identifizieren25. Dies ist sehr vorteilhaft bei der Untersuchung eines Organsystems wie der Skelettmuskulatur, da Homöostase und Regeneration komplexe, multifaktorielle Prozesse sind, die von einer Vielzahl von Zelltypen koordiniert werden. Eine bahnbrechende Studie identifizierte SOWOHL FAPs als auch MPs unter Verwendung durchflusszytometrischer Methoden in der Skelettmuskulatur der Maus1. Sie zeigten, dass FAPs mesenchymaler Natur sind, da ihnen Oberflächenantigene fehlten, die für Zellen aus endothelialen (CD31), hämatopoetischen (CD45) oder myogenen (Integrin-α7 [ITGA7]) Ursprüngen spezifisch waren, aber den mesenchymalen Stammzellmarker Sca-1 (Stammzellantigen 1)1 exprimierten und in Kultur in fibrogene und adipogene Zellen differenzierten. Andere Studien zeigten eine erfolgreiche Isolierung von mesenchymalen Vorläuferzellen im Muskel basierend auf der Expression eines alternativen Stammzellmarkers, des aus Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptors alpha (PDGFRα)2,7,8, und weitere Analysen ergaben, dass es sich wahrscheinlich um die gleiche Zellpopulation wie FAPs3 handelt. FAPs werden jetzt häufig in der Durchflusszytometrie identifiziert, indem entweder Sca-1 oder PDGFRα als positiver Selektionsmarker1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Die Verwendung von PDGFRα ist jedoch für menschliches Gewebe bevorzugt, da ein direkter menschlicher Homolog von murinem Sca-1 noch identifiziert werden muss32. Darüber hinaus wurden andere Zelloberflächenproteine als Marker für MPs (z. B. VCAM-1) berichtet, die eine potenzielle Alternative zu ITGA7 als Indikator für Zellen myogener Abstammung während der FAPs-Isolierung33darstellen.

Während die Durchflusszytometrie / FACS eine leistungsfähige Methodik zur Untersuchung der Rolle und des pathogenen Potenzials von FAPs in der Skelettmuskulatur1,9,10,11,13,29ist sie technisch durch die Spezifität und Optimierung der erforderlichen Reagenzien begrenzt. Da die durchflusszytometrische Identifizierung und Isolierung von FAPs in den Maustiermodellen1,9,10,11,29entwickelt und durchgeführt wurde, stellt dies Forscher, die FAPs in anderen Modellorganismen untersuchen möchten, vor Herausforderungen. Viele Faktoren - wie die optimale zu verarbeitende Gewebegröße sowie die Reagenzien- und/oder Antikörperspezifität und -verfügbarkeit - unterscheiden sich je nach verwendeter Spezies.

Zusätzlich zu den technischen Hindernissen für die Untersuchung von FAPs in einem neuartigen Tiermodell wurden sie weitgehend in einem akuten, toxischen Umfeld untersucht - in der Regel durch intramuskuläre chemische Injektion oder Cardiotoxin. Die Bewertung der langfristigen Dynamik von FAPs beschränkt sich in erster Linie auf die Beurteilung der Duchenne-Muskeldystrophie unter Verwendung des mdx-Mausmodells9,10,11und Modellen von Kombinationsmuskelverletzungen wie massivem Rotatorenmanschettenriss, bei dem gleichzeitige Sehnentransfektion und Denervierung an der Schultermuskulatur durchgeführt wird26,27,28 . Die Reaktion der FAPs auf die alleinige Beleidigung der chronischen traumatischen Denervierung, ein häufiges Auftreten bei Arbeitsunfällen in der Schwerindustrie, der Landwirtschaft und bei Geburtstraumata (Plexus brachialis)34,35,36,37 mit signifikanter Morbidität, wurde nicht so gut charakterisiert, oft auf einen kurzfristigen Zeitrahmen beschränkt11,38.

Wir beschreiben eine Methode zur Identifizierung und Isolierung von FAPs und MPs aus gesunden sowie stark atrophischen und fibrotischen Skelettmuskeln bei der Ratte. Zunächst wird die Identifizierung von CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-FAPs und CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+-MPs unter Verwendung eines Gewebeaufschluss- und Durchflusszytometrie-Färbeprotokolls demonstriert und die anschließende Validierung unserer Ergebnisse erfolgt durch Kultur und immunzytochemische Färbung von FACS-isolierten Zellen. Mit dieser Methode berichten wir auch über einen neuartigen FAPs-Zeitverlauf in einem langfristigen isolierten Denervierungsverletzungsmodell bei der Ratte.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ermittler, die dieses Protokoll durchführen, müssen die Erlaubnis ihres örtlichen Tierethikrates / Pflegeausschusses einholen. Alle Tierarbeiten wurden vom St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC #918) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care (CCAC) durchgeführt. Ein Schema des Durchflusszytometrieprotokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Wenn die nachgeschaltete Anwendung FACS und nachfolgende Zellkultur ist, sollten alle Schritte mit der richtigen aseptischen Technik abgeschlossen werden.

1. Muskelaufbau

  1. Betäuben Sie Ratten mit einem geeigneten Anästhetikum und Opfer gemäß den Richtlinien des örtlichen Vivariums und des Tierethikrats. Dieses Protokoll erntet beispielsweise den Musculus gastrocnemius von erwachsenen weiblichen Lewis-Ratten (200-250 g). Ratten wurden mit 2-3% Isofluran betäubt und durch intrakardiale Injektion von T61 geopfert.
  2. Sobald das Tier geopfert wurde, rasieren Sie das gesamte Hinterbein, um die Position des Muskels zu erleichtern und die Fellkontamination des geernteten Gewebes zu minimieren.
  3. Machen Sie mit einem sterilen Skalpell zwei Schnitte in der Haut: den ersten um den Umfang des Sprunggelenks und den zweiten entlang der Mittellinie des medialen Aspekts des Hinterbeins vom Knöchel bis zur Hüfte.
  4. Schälen Sie die Haut und die oberflächlichen Muskelschichten zurück, um den darunter liegenden Gastrocnemius zu enthüllen, der an den medialen und lateralen Kondylen des Femurs entspringt und an der Achillessehne eingesetzt wird.
  5. Verwenden Sie stumpfe Dissektion, um den Gastrocnemius vom umgebenden Gewebe zu trennen, und behandeln Sie den Muskel nur durch die Sehne, um eine Quetschverletzung zu vermeiden.
  6. Trennen Sie den Gastrocnemius von seiner Einführung, indem Sie die Achillessehne so distal wie möglich mit einer scharfen Schere durchschneiden. Einmal geschnitten, greifen Sie die Achillessehne mit einer Pinzette und schälen Sie den Gastrocnemius vorsichtig vom darunter liegenden Knochen. Halten Sie den Muskel immer noch mit einer Pinzette in einer Hand, lokalisieren Sie die beiden Ursprünge des Gastrocnemius und schneiden Sie an den medialen und lateralen Femurkondylen.
  7. Tupfen Sie den ausgeschnittenen Gastrocnemius sanft gegen ein steriles Stück Gaze, um so viel Blut wie möglich zu entfernen. Trimmen Sie den Muskel auf einer sterilen Oberfläche und entfernen Sie überschüssiges Bindegewebe sowie die Achillessehne.
  8. Legen Sie Muskeln in ein Wiegeboot und wiegen Sie mit einer Präzisionswaage. Dieses Protokoll ist optimiert, um Muskeln mit einem Nassgewicht von 200-600 mg zu verdauen. Die Anwender können überschüssiges entnommenes Gewebe auf Wunsch für andere nachgelagerte Assays unterteilen.
  9. Teilen Sie den geernteten Muskel, der für die Durchflusszytometrie verwendet werden soll, vorsichtig in 3-4 kleinere Stücke (ca. 1-2 cm3)und tauchen Sie ihn in eiskalte 1x PBS ein. Auf Eis kalt halten, bis alle Proben geerntet wurden.

2. Muskelverdauung

  1. Entfernen Sie den Muskel von PBS und legen Sie ihn in eine sterile 10 cm Zellkulturschale. Reißen und zerkleinern Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette, bis die Stücke etwa3-4 mm3betragen, wobei so viel Bindegewebe wie möglich entfernt wird. Nach gründlichem Zerkleinern in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen mit 6 ml DMEM + 1% Penicillin/Streptomycin (P/S) überführen.
  2. 10 μL 300 mMCaCl2-Lösung zu 365 μL Collagenase II-Lösung (Stammkonzentration 4800 U/ml) geben, um das Kollagenase-Enzym zu aktivieren. Geben Sie die aktivierte Kollagenase-II-Lösung in das 50 ml konische Röhrchen, das die Gewebeschlämme enthält. Die endgültige Kollagenase-II-Konzentration beträgt 250 U / ml.
  3. Inkubieren Sie Röhrchen in einem Shaker für 1 h bei 37 ° C, 240 x g, wobei Sie sicherstellen, dass Sie alle 15 Minuten manuell schwenken, um Gewebe zu entfernen, das an der Seite des Röhrchens haften geblieben ist.
  4. Entfernen Sie nach 1 h die Röhrchen aus dem Shaker und fügen Sie pro Probe Folgendes hinzu: 100 μL Collagenase II (4.800 U/ml) und 50 μL Dispase (4,8 U/ml).
  5. Proben mit einer serologischen Pipette 15-20 mal pipettieren, bis die Lösung homogen ist. Wenn Sie mehrere Proben verarbeiten, verwenden Sie für jede Probe eine separate sterile Pipette, um eine Kreuzkontamination der Probe zu vermeiden.
  6. Erneut in einem Shaker für 30 min bei 37 °C und 240 x g inkubieren. Nach 15 Minuten schütteln Sie die Proben von Hand, um anhaftendes Gewebe von der Seite des Röhrchens zu entfernen.

3. Erzeugung einer Einzelzellsuspension

  1. Scheren Sie Proben langsam durch eine 10 ml Spritze mit einer 20 G Nadel für 10 Zyklen.
    HINWEIS: Ein Zyklus beinhaltet die Aufnahme von Muskellösung in die Spritze und die Injektion zurück in die Röhre. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Blasen minimieren, indem Sie das Scheren langsam abschließen, da übermäßiges Schäumen zusätzlichen Zelltod verursachen kann39.
  2. Legen Sie ein 40 μm Zellsieb auf ein steriles 50 ml konisches Rohr und befeuchten Sie es durch Pipettieren von 5 ml DMEM + 10% FBS & 1% P / S.
  3. 1 ml der Probe gleichzeitig durch das Zellsieb pipettieren.
  4. Waschen Sie das Zellsieb, indem Sie DMEM mit 10% FBS und 1% P / S durch das Sieb pipettieren, um das Gesamtvolumen im Röhrchen auf 25 ml zu bringen.
  5. 25 ml der Probe gleichmäßig in zwei konische 15-ml-Röhrchen aufteilen und bei 15 °C, 400 x g für 15 min zentrifugieren.
    HINWEIS: Das Aufteilen der Muskellösung in zwei konische 15-ml-Röhrchen gewährleistet eine bessere Zellerholung nach der Zentrifugation im Vergleich zu einem einzelnen Röhrchen.
  6. Den Überstand aspirieren und das Pellet in 1 ml 1x RBC-Lysepuffer (siehe Ergänzungsdatei)bei Raumtemperatur für 7 min erneut suspendieren, um Erythrozyten zu eliminieren.
  7. Mit 9 mL Waschpuffer (siehe Ergänzungsdatei) das Volumen auf 10 mL erhöhen und Röhrchen bei 400 x g,15 °C für 15 min drehen.
  8. Aspirieren Sie den Überstand und rekombinieren Sie die Pellets durch erneutes Suspendieren in 1 ml Waschpuffer.
  9. Übertragen Sie ein geeignetes Zellvolumen in ein separates 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie es mit trypanblauem Farbstoff. Zählen Sie lebende Zellen auf einem Lichtmikroskop mit einem Hämozytometer.

4. Antikörperfärbung für die Durchflusszytometrie

HINWEIS: Der Sca-1-Antikörper muss vor Durchflusszytometrie-/FACS-Experimenten gemäß den Anweisungen des Herstellers mit APC konjugiert werden. Die Leistung muss für jede Charge von Konjugaten validiert werden (Abbildung 2). Endkonjugationen können in 20 μL Aliquots bei -20 °C gelagert werden und sind drei Wochen haltbar. Das vollständige Konjugationsprotokoll finden Sie in der Ergänzungsdatei.

  1. Für die Durchflusszytometrie werden 1-2 x 106 Zellen pro experimenteller Probe in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Bringen Sie das Volumen mit Waschpuffer auf bis zu 1 ml und legen Sie es auf Eis.
  2. Richten Sie für jedes Experiment die folgenden erforderlichen Kontrollen ein: i) nicht gefärbte und ii) Lebensfähigkeitskontrollen zur genauen Auswahl für die lebende Zellpopulation; iii) Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen an Einzelzellsuspensionen, um genaue Gatter für CD31-/CD45-Fraktionen, FAPs und MPs festzulegen; und iv) einfach gefärbte Kompensationsperlen zur Korrektur des Fluoreszenz-Spillovers zwischen den Kanälen.
    1. Für alle Zellkontrollen aliquot 5 x 105 - 1 x 106 Zellen in 1 ml Waschpuffer in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis legen.
    2. Für die Perlenkontrolle fügen Sie jedem markierten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen1 Tropfen positive Kompensationsperlen (~ 1,5 x 10 5 Perlen pro Tropfen) hinzu. Die gesamte Palette der Kontrollen ist in Tabelle 1aufgeführt.
      HINWEIS: Wenn das Experiment zum ersten Mal durchgeführt wird, führen Sie für jeden konjugierten Antikörper einzelngefärbte Kontrollen auf Einzelzellsuspensionen durch (zusätzlich zu den nicht gefärbten, lebensfähigen, einfach gefärbten Kompensationsperlen- und FMO-Kontrollen), um die positiv gefärbte Population in Zellen zu bewerten und die an Kompensationsperlen beobachtete Färbung zu validieren. Validieren Sie jedes frisch konjugierte Sca-1::APC-Präparat, indem Sie einzeln Kompensationsperlen und Einzelzellsuspensionen färben. Eine vollständige Liste der Färbekontrollen finden Sie in Tabelle 1.
  3. Um die Lebensfähigkeitskontrolle vorzubereiten, übertragen Sie die Hälfte des Zellvolumens aus dem "Lebensfähigkeitsröhrchen" in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Beschriften Sie diese Tube mit "Dead".
  4. "Dead" -Röhrchen bei 65 ° C für 2-3 min inkubieren, um die Zellen abzutöten, und dann auf Eis legen. Kombinieren Sie nach 2-3 min erneut tote Zellen mit lebenden Zellen, die im Lebensfähigkeitskontrollrohr verbleiben. Diese Zellpopulation wird verwendet, um Kompensationswerte (falls erforderlich) festzulegen und Tore für den Lebensfähigkeitsfarbstoff richtig zu setzen.
  5. Zentrifugieren Sie die Einzelzellsuspensionen (experimentelle Proben und Kontrollen) bei 500 x g, 4 °C für 5 min.
  6. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in 100 μL Waschpuffer.
  7. Fügen Sie Antikörper hinzu, abhängig von der experimentellen Probe oder Kontrolle. Informationen zu Antikörperkombinationen und -mengen finden Sie in der Färbematrix (Tabelle 2).
  8. Streichen Sie jede Probe vorsichtig, um ein vollständiges Mischen zu gewährleisten, und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln auf Eis. Für Ausgleichsperlen 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
  9. Für Einzelzellsuspensionsexperimente und Kontrollproben ist das Volumen durch Zugabe von 900 μL Waschpuffer auf 1 ml zu erhöhen. Für Kompensationsperlensteuerungen erhöhen Sie das Volumen auf 1 ml mit 900 μL 1x PBS.
  10. Zentrifugieren Sie Einzelzellsuspensionsproben bei 500 x g, 4 °C für 5 min. Zentrifugenkompensations-Wulstkontrollen bei 300 x g, 4 °C für 5 min.
  11. Für alle Einzelzellsuspensionsproben aspiratieren und verwerfen Sie Überstands- und Resuspensionszellpellets in 300 μL Waschpuffer. Für die Kompensationsperlenkontrolle den Überstand absaugen und verwerfen, das Pellet in 300 μL 1x PBS wieder suspendieren und dann 1 Tropfen (~ 1,5 x 105) negativerKompensationsperlen hinzufügen.
  12. Bewahren Sie alle Einzelzellsuspensionsproben auf Eis unter Aluminiumfolie auf und fahren Sie mit der durchflusszytometrischen Erfassung fort. Kompensationsperlensteuerungen sollten ebenfalls vor Licht geschützt sein, können aber bei Raumtemperatur gehalten werden.
    HINWEIS: Wenn der experimentelle Endpunkt die FAPs-Identifizierung mittels Durchflusszytometrie ist, führen Sie bitte die Schritte 5.1.1-5.1.11 aus. Wenn der Endpunkt die Zellisolierung über FACS für Kultur und Färbung ist, befolgen Sie bitte die Schritte 5.2.1-5.2.9 und abschnitte 6-7.

5. Durchflusszytometrie und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)

  1. Durchflusszytometrie
    HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet ein Tisch-Durchflusszytometer, das mit 405 nm-, 488 nm- und 640 nm-Lasern ausgestattet ist, die in der Lage sind, gleichzeitig 10 verschiedene Farben zu unterscheiden. Bandpassfilter und die zugehörigen Fluorochrome, die in diesem Protokoll verwendet werden, sind wie folgt: 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) und 670/30 (APC). Die Spannungen für jeden Detektor sind wie folgt: FSC 700; SSC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Blau 360; APC 570. Stellen Sie sicher, dass Sie vor der Verwendung in der ordnungsgemäßen Bedienung des Durchflusszytometers oder Zellsortierers geschult sind.
    1. Stellen Sie sicher, dass das Zytometer vor Gebrauch 10-20 Minuten lang eingeschaltet und durch sequentielle Reinigung mit sauberen, Spül- und Mantelflüssigkeitslösungen für jeweils 30-45 s grundiert wurde. Beenden Sie mit einer Spülung mit dH2O. Stellen Sie sicher, dass dem Vorratsbehälter ein ausreichendes Volumen an Mantelflüssigkeit zugesetzt wurde, um den ordnungsgemäßen Probenfluss während der gesamten Erfassung aufrechtzuerhalten.
    2. Richten Sie die Gating-Strategie ein, um FAPs und MPs zu identifizieren, wie in Abbildung 3 dargestellt.
      HINWEIS: FAPs und MPs werden durch die folgende hierarchische Gating-Strategie identifiziert: i) SSC-A vs FSC-A (Seitenzellenstreufläche versus Vorwärtszellstreufläche zur Trennung von Zellen vs. Trümmern), ii) FSC-W vs FSC-H (Vorwärtszellstreubreite versus Vorwärtszellstreuhöhe, um Singuletts von Dubletten im FSC-Parameter zu unterscheiden), iii) SSC-W vs SSC-H (Seitenzellstreubreite versus Seitenzellstreuhöhe, um Singuletts von Dubletten im SSC-Parameter zu unterscheiden), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (zur Unterscheidung von lebenden und toten Singlets), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (um CD31+ und CD45+ Zellen von der weiteren Analyse auszuschließen), und vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E von der CD31-/CD45- (Lineage; Lin-) Bevölkerung (Identifizierung von FAPs und Abgeordneten). FAPs werden als CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-Ereignisse und MPs als CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+-Ereignisse identifiziert.
    3. Führen Sie zuerst jede einzelgefärbte Kompensationsperlensteuerung mit niedriger Geschwindigkeit durch das Zytometer, um Kompensationswerte zu erzeugen, die zur Korrektur von Fluoreszenz-Spillover zwischen Kanälen verwendet werden. Bewerten Sie die Kompensation, indem Sie das Fluoreszenzsignal jedes Steuerelements in seinem eigenen Detektor (z. B. SSC-A vs APC für Sca-1::APC-Einzelgefärbte Perlen) sowie alle anderen Detektoren vergleichen. Es sollte zwei verschiedene Populationen (eine mit negativem und eine mit positivem Signal) im entsprechenden Detektor und nur eine negative Population in allen anderen Detektoren geben. Stellen Sie das Stopptor auf 10.000 Kompensationsperlenereignisse ein und zeichnen Sie die Daten auf.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie zwischen der Aufnahme jeder Probe dH 2 O für10-20Sekunden durch das Zytometer laufen lassen, um eine Kontamination von Probe zu Probe zu vermeiden.
    4. Als nächstes verarbeiten Sie die nicht gefärbten und Lebensfähigkeitskontrollproben, um lebende Einzelzellen richtig zu schützen. Stellen Sie das Stopptor auf 10.000 Singlet-Ereignisse ein und zeichnen Sie Daten auf.
      ANMERKUNG: Etwa 5 min vor der Entnahme jeder Einzelzellsuspensionsprobe mit Ausnahme der ungefärbten Probe 1 μL SYTOX Blue Lebensfähigkeitsfarbstoff (300 μM Arbeitskonzentration verdünnt von 1 mM Stammlösung) zu jeder Probe geben und vorsichtig mischen (Endkonzentration 1 μM).
    5. Anschließend werden die verbleibenden Einzelzellsuspensionskontrollproben entnommen. Bewerten Sie jedes FMO-Steuerelement mit dem entsprechenden Diagramm in der Gating-Strategie (Abbildung 3). Bewerten Sie beispielsweise das FITC-Signal des CD31+CD45 FMO, um ein genaues CD31-/CD45-Gate sicherzustellen. Ein optimales Beispiel ist in Abbildung 3G dargestellt. Wenn das Protokoll zum ersten Mal durchgeführt wird, sollten einzeln gefärbte Kontrollen auf Zellen vor dem Erwerb von FMO-Kontrollen ausgeführt werden.
    6. Bewerten Sie das Fluoreszenzsignal jeder einzelnen gefärbten Zellprobe in ihrem geeigneten Detektor sowie in allen anderen Detektoren, um die ordnungsgemäße Kompensation zu validieren. Stellen Sie das Stopptor auf 10.000 Live-Singlet-Ereignisse ein und zeichnen Sie es in der Software auf.
    7. Sobald alle Kontrollen (Einzelzellsuspensionen und Kügelchen) verarbeitet sind, bereiten Sie alle experimentellen Proben vor, indem Sie zuerst das Volumen jeder Probe messen und aufzeichnen. Diese Messungen werden verwendet, um FAPs und MPs genau zu quantifizieren, wie in Schritt 5.1.11 beschrieben. Fügen Sie dann 50 μL Präzisionszählperlen hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie 2-3 Mal nach oben und unten pipettieren.
    8. Führen Sie kurz die erste experimentelle Probe durch, um die Identifizierung der zählenden Perlenpopulation zu validieren. Diese Population erscheint als ein kleiner, von der allgemeinen Zellpopulation getrennter Cluster auf dem FSC-A vs SSC-A-Diagramm(Abbildung 3A,roter Kasten). Erstellen Sie ein Tor um die zählende Perlenpopulation. Erfassen Sie dann Daten für jede experimentelle Probe, indem Sie mit niedriger Geschwindigkeit durch das Zytometer verarbeiten. Setzen Sie das Stopptor auf 10.000 Zählperlenereignisse und zeichnen Sie auf.
      HINWEIS: Die Ermittler können alternativ Zählperlen identifizieren, indem sie ein zusätzliches Diagramm einrichten, das SSC-A im Vergleich zu einem der Detektoren bewertet, da die zählenden Kügelchen in allen Detektoren fluoreszierend sind.
    9. Nachdem alle Proben verarbeitet wurden, reinigen Sie das Zytometer mit den entsprechenden Protokollen. Exportieren Sie alle Daten zur Analyse.
    10. Öffnen Sie alle Datendateien in einer geeigneten Durchflusszytometrie-Analysesoftware. Legen Sie die für die Datenerfassung verwendete Gating-Strategie wie in Schritt 5.1.2 beschrieben fest. Untersuchen Sie die Kontrollen in der gleichen Reihenfolge wie bei der Datenerfassung (z. B. ungefärbt, Lebensfähigkeit, Einzelfleck, dann FMO-Kontrollen), um die Gating-Strategie erneut zu validieren. Sobald genaue Gatter mit FMO-Kontrollen festgelegt wurden, wenden Sie die Gatter auf alle experimentellen Proben an. Exportieren Sie Rohdaten als Kalkulationstabelle zur Quantifizierung.
    11. Berechnen Sie die Anzahl der FAPs und MPs in jeder experimentellen Probe mit den Zählkügelchen:
      figure-protocol-1
      wobei Acquired Cell Count die Anzahl der aufgezeichneten Ereignisse der relevanten Zellpopulation (z. B. FAPs oder MPs) auf der Erfassungssoftware ist; Acquired Bead Count ist die Anzahl der aufgezeichneten Ereignisse der Zählung von Perlen auf der Akquisitionssoftware; Counting Beads Volume ist das Volumen der Zählperlenlösung, das in Schritt 5.1.7 hinzugefügt wurde; Das Probenvolumen ist das Volumen jeder gefärbten experimentellen Probe vor der Zugabe von Zählperlen. Die Perlenkonzentration ist die Anzahl der Kügelchen pro μL-Lösung; Dieser Wert befindet sich im Produktdatenblatt.
  2. FACS - Sortierung für Zellkultur
    HINWEIS: Dieses Protokoll führt FACS auf einem Zellsortierer durch, der mit 4 Lasern (UV, Violett, Blau, Rot) ausgestattet ist und gleichzeitig 11-14 Farben unterscheiden kann. Befolgen Sie das Protokoll der experimentellen Probenfärbung (Abschnitt 4) und der Durchflusszytometrie, mit Ausnahme der unten beschriebenen Schritte 1 bis 3, um den FACS-Workflow zu optimieren:
    1. Erhöhen Sie die Konzentration der Zellen in den zu sortierenden experimentellen Proben auf 7 x 106 Zellen/ml, um robuste Ausbeuten an FAPs und MPs zu erzeugen.
    2. Um diesem signifikanten Anstieg der Zellkonzentration Rechnung zu tragen, verdoppeln Sie alle Antikörperkonzentrationen in den zu sortierenden Versuchsproben.
    3. Verarbeiten Sie die endgültigen gefärbten Zellproben durch eine 40 μM-Zellsiebkappe, die unmittelbar vor der Sortierung an einem 5-ml-Polystyrolröhrchen befestigt ist, um die Zellverklumpung zu reduzieren und die Sortierausbeute zu erhöhen.
    4. Sammeln Sie einzelne, lebende Ratten-FAPs und MPs direkt aus dem Zellsortierer in einem 5-ml-Polypropylen-Sammelröhrchen, das 1 ml steriles, 100% fetales Rinderserum (FBS) enthält. Halten Sie die Zellen auf Eis, bis die Sortierung abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Wenn Sie FACS an einem externen Standort durchführen, übertragen Sie alle sortierten Zellen auf Eis und in einem gesicherten, abgedeckten Behälter.
    5. Wenn Sie in einer sterilen Biosicherheitswerkbank (BSC) arbeiten, bringen Sie das Volumen der sortierten Zellen mit geeigneten Wachstumsmedien (z. B. FAP-Wachstumsmedien (FAP GM) für sortierte FAPs und MP-Wachstumsmedien (MP GM) für sortierte MPs auf bis zu 7 ml und zentrifugieren Sie bei 500 x g, 4 ° C für 7 min, um so viel Restwaschpuffer wie möglich zu entfernen.
    6. Resuspenieren Sie Pellets in 1 ml geeignetem Wachstumsmedium und eine Platte in eine 12-Well-Platte, die einen sterilen, kollagenbeschichteten 12 mm Glasdeckglas/-well zur anschließenden Immunfärbung enthält (siehe Abschnitt 6).
      HINWEIS: Bei immunzytochemischer Färbung für Kollagen sortierte die Platte Zellen in eine 12-Well-Platte, die einen sterilen, Laminin-beschichteten 12-mm-Glasdecker / -brunnen anstelle von kollagenbeschichtet enthält. Wenn immunzytochemische Experimente mit sofort isolierten Vorläufern erforderlich sind, säen Sie FAPs und MPs mit einer Dichte von 15.000 Zellen pro cm2 aus und fahren Sie direkt mit Schritt 6.1 fort. Für Langzeitkulturen, um die Differenzierung des Vorläufers zu induzieren, samen FAPs mit einer Dichte von 5.000 Zellen pro cm2und MPs mit einer Dichte von 7.500 Zellen pro cm2.
    7. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C und 5% CO2 ineinem Zellkultur-Inkubator. Nach 72 Stunden in der Kultur ändern Sie die Hälfte der Medien. Wechseln Sie die Medien alle 2-4 d danach vollständig.
    8. Um die Entwicklung von Myozyten zu induzieren, wechseln Sie die MPs-Kulturen am Tag 9 der Kultur auf das Medium MP-Differenzierung (MD). Um Adipozyten zu induzieren, schalten Sie die FAPs-Kulturen am Tag 10 der Kultur auf FAP-Adipogen-Differenzierungsmedium (AD) um.
    9. Um die Fibrogenese zu induzieren, können FAPs zu variablen Zeitpunkten während der Kultur auf fibrogene Differenzierungsmedien (FD) umgestellt oder alternativ nach der Isolierung (Schritt 5.2.6) direkt in FD-Medien ausgesät werden (siehe Ergänzende Datei für alle Medienrezepte).

6. Immunzytochemie von kultivierten FAPs und MPs

  1. Um die Zellsortierung zu validieren und die Reinheit von FAPs und MPs-Kulturen nachzuweisen, Immunostain mit zelltypspezifischen Markern, einschließlich PDGFRα (FAPs-Marker), Pax-7 (Muskelstamm [Satelliten] Zellmarker), Fibroblasten-spezifischem Protein (FSP-1, Fibroblastenmarker), Perilipin-1 (Plin-1, Adipozytenmarker), Kollagen Typ 1 (Col1a1, Indikator für Fibrose), Myosin Heavy Chain (MHC, reifer Myozytenmarker).
    1. Zur Immunfärbung frisch sortierter Zellen die 12-Well-Platte bei 200 x g für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, um die Haftung der Zellen am Deckglas/ Well zu erleichtern. Dieser Schritt ist für Langzeitkulturen nicht notwendig. Entfernen Sie Kulturmedien.
    2. Zur Immunfärbung mit FSP-1 fixieren Sie die Zellen mit 1 ml 100% Methanol (MeOH) für 2 min bei 4 °C. Bei Immunfärbung für PDGFRα, Plin-1, Pax7 oder Col1a1 Zellkulturen mit 1 ml 4% PFA in 1x PBS für 15 min bei Raumtemperatur fixieren. MHC Immunostaining verträgt beide Fixiermittel.
      HINWEIS: Überspringen Sie bei Methanol-fixierten Zellen Schritt 6.2 und fahren Sie mit Schritt 6.3 fort.
  2. Saugen Sie 4% PFA ab und waschen Sie Zellkulturen 3-4 mal schnell mit 1x PBS. 1 mL 100 mM Glycin in 1x PBS geben und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren, um resteigene PFA zu inaktivieren. Aspirieren und waschen Sie 1-2 mal mit 1x PBS.
    HINWEIS: Die Zellen können in diesem Stadium in 2 ml 1x PBS belassen, in Frischhaltefolie eingewickelt und maximal 7-10 Tage bei 4 ° C gelagert werden.
  3. Nach dem Waschen 1 mL 0,1% Triton-X in 1x PBS geben und 20 min inkubieren, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.
  4. Waschen Sie die Wells 2-3 mal mit 1-2 ml 1x PBS und blockieren Sie dann zellen mit 1 mL 1x PBS + 3% BSA pro Vertiefung für 1 h bei Raumtemperatur.
  5. 80 μL primärer Antikörper, verdünnt in 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 pur, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/ml) auf ein Stück Parafilm, das auf einen mobilen Behälter geklebt ist. Heben Sie mit einer sterilen feinen Pinzette den Deckglas vorsichtig aus dem Brunnen und kehren Sie ihn auf den Tropfen Der Antikörperlösung um. Inkubieren Sie das Deckglas mit zwei nassen Stücken Papiertuch und decken Sie den Behälter in Kunststofffolie ab, um die Verdunstung der Antikörperlösung zu vermeiden. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: Das Färben von Deckblättern aus dem Bohrloch verwendet weniger Antikörper (~ 80 μL) als das Färben im Bohrloch (mindestens 500 μL).
  6. Lassen Sie an Tag 2 die Deckgläser bei Raumtemperatur 30 Minuten zum Aufwärmen. Verwenden Sie die Pinzette vorsichtig rechts und übertragen Sie die Deckgläser zurück zu ihren jeweiligen Vertiefungen (Zellen nach oben) und waschen Sie 2-3 mal mit 1-2 ml 1x PBS für jeweils 2 min, um so viel primären Antikörper wie möglich zu entfernen.
  7. Mit der gleichen Färbetechnik wie bei der primären Antikörperfärbung färben Sie Zellen mit ziegenfeindlichem Alexa Fluor 488 sekundärem Antikörper (1:400) zum Nachweis von FSP-1, Plin-1, Col1a1 oder PDGFRα und Ziegen-Anti-Maus Alexa Fluor 555 Sekundärantikörper (1:300), um MHC oder Pax-7 nachzuweisen. Inkubieren Sie Zellen für 1 h bei Raumtemperatur und halten Sie die Zellen vor Licht geschützt.
  8. Bringen Sie die Zellen zum Brunnen zurück und inkubieren Sie die Zellen mit Hoechst (1:10.000) für 2-4 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen weitere 2-3 Mal mit 1x PBS für jeweils 2 min, um überschüssiges Hoechst zu entfernen.
  9. Befestigen Sie Deckgläser mit einem anti-fade fluoreszierenden Montagemedium auf Glasobjektträgern und lassen Sie die Dias über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen. Montierte Deckgläser bei 4 °C im Dunkeln aufbewahren.

7. Oil Red O (ORO) Färbung von kultivierten FAPs und MPs

  1. OrO-Färbung auf nicht permeabilisierten Zellen durchführen, da die Permeabilisierung der Zellmembran zu einer unspezifischen/unerwünschten Färbung von nicht-adipogenen Zelltypen führen kann. Bereiten Sie vor Beginn der Färbung einen ORO-Arbeitsstoff vor (siehe Ergänzungsdatei für das Rezept) und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  2. Nach 20 min wird die Lösung mit einem 0,2 μm-Filter filtriert, um ungelöste Aggregate zu entfernen.
  3. Saugen Sie medien aus der Vertiefung ab und fügen Sie 1 ml 10% neutrales gepuffertes Formalin (10% NBF) hinzu. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Die Zellkonfluenz kann zu einem Lifting aus dem Bohrloch / Deckglas führen. Seien Sie vorsichtig beim Ansaugen/Hinzufügen von Lösungen.
  4. Aspiratieren und 1 ml frisches 10% NBF hinzufügen und mindestens 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle gestoppt werden, da Zellen über Nacht in 10% NBF belassen werden können.
  5. Waschen Sie die Vertiefungen einmal schnell mit 1 ml 60% Isopropanol, aspirieren Sie dann und lassen Sie die Vertiefungen vollständig trocknen (ca. 2 min).
  6. Fügen Sie 400 μL Oil Red O Arbeitsmaterial pro Bohrloch hinzu und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass kein ORO an den Wänden der Platte pipettiert wird.
  7. Entfernen Sie das gesamte Oil Red O und waschen Sie den Brunnen schnell 4 mal mit dH2O.
    HINWEIS: Wenn gebeizte Vertiefungen Deckgläser enthalten, montieren Sie sie mit der gleichen Technik wie in Schritt 6.9 beschrieben.
  8. Stellen Sie entweder montierte Deckgläser oder den gebeizten Brunnen mit einem Hellfeldmikroskop vor.

8. Gewebefärbung von kontralateralen und denervaten Ratten-Gastrocnemius-Abschnitten

  1. Picrosirius Rot (PSR)
    1. PsR-Färbung auf 5 μm dicken, formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Ratten-Gastrocnemius histologischen Abschnitten wie zuvor beschrieben40.
  2. Öl Rot O (ORO)
    1. 5 μm dicke isopentangefrorene Ratten-Gastrocnemius histologische Schnitte in 4% PFA für 10 min fixieren, in 60% Isopropylalkohol für 1 min inkubieren.
    2. Färben Sie mit ORO-Arbeitsmaterial für 12 min. In 60% Isopropylalkohol für 1 min inkubieren, 10 min in dH 2 O waschen. Miteinemwasserlöslichen Montagemedium auf Deckgläser montieren.
  3. Sca-1 und Laminingewebe fluoreszierende Immunhistochemie (IHC)
    1. Führen Sie fluoreszierende IHC auf 5 μm dicken isopentangefrorenen Ratten-Gastrocnemius-histologischen Abschnitten durch.
    2. Hydratisieren Sie Proben in 1x PBS für 5 min, fixieren Sie in 4% PFA für 10 min und inkubieren Sie dann Proben in Gewebe IF-Blockierungslösung (siehe Ergänzende Datei) für 90 min.
    3. Inkubieren mit Anti-Sca-1 Primärantikörper (1:500), verdünnt in 1x PBS + 0,05% Tween bei 4 °C über Nacht.
    4. An Tag 2 dreimal in 1x PBS + 0,05% Tween für jeweils 5 min waschen, dann in Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555 (1:500) für 1 h inkubieren.
    5. Erneut waschen (wie zuvor), mit Blocklösung für 1 h inkubieren, dann Anti-Laminin-Primärantikörper (1:500) in 1x PBS + 0,05% Tween für 1 h hinzufügen.
    6. Erneut waschen (wie zuvor), dann in Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 (1:500) für 1 h (für Laminin) inkubieren.
    7. Erneut waschen (wie zuvor) und dann in DAPI (1:10.000) für 4 min inkubieren. Waschen und montieren Sie sie mit einem Anti-Fade-Montagemedium auf Deckgläsern.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identifizierung von FAPs und MPs mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines neuartigen Antikörperpanels einschließlich Sca-1 und VCAM-1
Die Gating-Strategie zur Identifizierung von FAPs im Rattenmuskel basiert auf Durchflusszytometrie-Protokollen in der Maus29, die auf CD31 (Endothel) und CD45 (hämatopoetische) positive Zellen (die sogenannte Abstammung [Lin]) gelangen und das fluoreszierende Profil des FAPs-Markers S...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein optimiertes, validiertes FAPs-Isolationsprotokoll für den Rattenmuskel ist für Forscher unerlässlich, die Verletzungsmodelle untersuchen möchten, die bei der Maus aus biologischen oder technischen Gründen nicht durchführbar sind. Zum Beispiel sind Mäuse kein optimales Tiermodell, um chronische lokale oder neurodegenerative Verletzungen wie langfristige Denervierung zu untersuchen. Biologisch machen es die kurze Lebensdauer und die schnelle Alterung von Mäusen schwierig, die Muskelsequenzen aufgrund der Denervierung d...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken den Flow Cytometry Core Facilities an der University of Ottawa und dem Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto, für ihre Expertise und Anleitung bei der Optimierung des in diesem Manuskript vorgestellten Durchflusszytometrie/FACS-Protokolls. Diese Arbeit wurde vom Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) an JB finanziert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5 mL Polypropylen-RundbodenröhrchenFalcon352063
5 mL Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit ZellsiebkappeFalcon352235
10 cm ZellkulturschalenSarstedt83.3902
12-Well-ZellkulturplatteThermoFisher130185
12 mm Glasabdeckgläser, Nr.2VWR89015-724
10 mL SpritzeBeckton Dickenson302995
15 mL ZentrifugenröhrchenFroggaBio91014
20 Gauge NadelBeckton Dickenson305176
25 mL Serologische PipetteSarstedt86.1685.001
40µ m Zell-SiebFisher Scientific22363547
50 ml ZentrifugenröhrchenFroggaBioTB50
AbC Gesamtantikörper-Kompensation Perlen ThermoFisherA10497
Ammoniumchlorid, ReagenzqualitätBioshopAMC303.500
APC Konjugationskit, 50-100 Mikro; gBiotium92307
Aquatex Wässriges EindeckmediumMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Rinderserumalbumin (BSA)BioshopALB001
CalciumchloridBioshopCCL444.500
Kollagenase Typ IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute ZählperlenThermoFisherC36995
DexamethasonMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4,5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamin
(+)110 mg/L Natriumpyruvat
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson-
FACSRinse SolutionBeckton Dickenson
Fötales RinderserumSigmaF1051
Durchflusszytometrie-ScheidenflüssigkeitBeckton Dickenson342003
FlowJo SoftwareBeckton Dickenson-
Fluoreszierendes EindeckmediumDakoS302380-2
Ziege Anti-Maus Alexa Fluor 555 SekundärantikörperInvitrogenA21424
Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 SekundärantikörperInvitrogenA11008
Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 555 SekundärantikörperInvitrogenA21429
ZiegenserumGibco16210-064
Ham's F10 MediaThermoFisher 11550043(+) Phenolrot
(+) L-Glutamin
(-) HEPES-Hank
" s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Heat Inactivated Horse SerumGibco26050-088
HämozytometerReichertN/A
HEPES, minimum 99,5% TitrationSigmaH3375
PferdeserumThermoFisher16050130
Human Transforming Growth Factor Β 1 (hTGF-β 8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Auch bekannt als 3-Isobutyl-1-methylxanthin
IsopropanolSigmaI9516Auch bekannt als 2-Propanol
Lewis Ratte, weiblichCharles River Kingston004 (Stammcode)200-250 Gramm verwendet
LSRFortessa X-20 TischzytometerBeckton Dickenson-
MikrozentrifugeEppendorfEP-5417R
MoFlo XDP ZellsortiererBeckman Coulter-
Maus Anti-CD31::FITC AntikörperAbcamab33858Klon TLD-3A12
Maus Anti-CD45::FITC AntikörperBiolegend202205Klon OX-1
Maus Anti-CD106::P E AntikörperBiolegend200403Auch bekannt als VCAM-1
Mouse Anti-MHC AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AAuch bekannt als MF20
Mouse Anti-Pax7 AntibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
PE-Cy7 KonjugationskitAbcamab102903
Penicillin-StreptomycinSigma P4333
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4 (1X)Gibco10010-023(-)Calciumchlorid
(-)Magnesiumchlorid
Kaliumbicarbonat, ReagenzqualitätBioshopPBC401.250
Kaninchen Anti-Fibroblast spezifisches Protein 1 (FSP-1) AntikörperInvitrogenMA5-32347FSP-1 auch bekannt als S100A4
Kaninchen Anti-Integrin-a7 AntikörperAbcamab203254
Kaninchen Anti-Laminin AntikörperSigmaL9393
Kaninchen Anti-Perilipin-1 AntikörperAbcamab3526
Kaninchen Anti-Sca-1 AntikörperMillipore SigmaAB4336
Kaninchen Rekombinant Anti-Kollagen Typ I AntikörperAbcamab260043Auch bekannt als Col1a1
Kaninchen Rekombinant Anti-PDGFR Alpha AntikörperAbcamab203491
Rekombinant Human FGF-basischGibcoPHG0266
NatriumazidSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazoneMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510
-340346

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12, 153-163 (2010).
  2. Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
  3. Uezumi, A., Ikemoto-Uezumi, M., Tsuchida, K. Roles of nonmyogenic mesenchymal progenitors in pathogenesis and regeneration of skeletal muscle. Frontiers in Physiology. 5, 1-11 (2014).
  4. Biswas, A. A., Goldhamer, D. J. FACS fractionation and differentiation of skeletal-muscle resident multipotent Tie2+ progenitors. Methods in Molecular Biology. 1460, 255-267 (2016).
  5. Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1-10 (2019).
  6. Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46 (2), 135-143 (2018).
  7. Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  8. Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124 (21), 3654-3664 (2011).
  9. Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
  10. Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  11. Madaro, L., et al. Denervation-activated STAT3-IL-6 signalling in fibro-adipogenic progenitors promotes myofibres atrophy and fibrosis. Nature Cell Biology. 20 (8), 917-927 (2018).
  12. Heredia, J. E., et al. Type 2 innate signals stimulate fibro/adipogenic progenitors to facilitate muscle regeneration. Cell. 153 (2), 376-388 (2013).
  13. Fiore, D., et al. Pharmacological blockage of fibro/adipogenic progenitor expansion and suppression of regenerative fibrogenesis is associated with impaired skeletal muscle regeneration. Stem Cell Research. 17 (1), 161-169 (2016).
  14. Kang, X., et al. Interleukin-15 facilitates muscle regeneration through modulation of fibro/adipogenic progenitors. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 1-11 (2018).
  15. Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., Mcmillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e2782(2011).
  16. Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernández-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In vivo assessment of muscle contractility in animal studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
  17. Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487(2016).
  18. Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183(2013).
  19. Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. (71), e50036(2013).
  20. Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696(2019).
  21. Iohom, G., et al. Long-term evaluation of motor function following intraneural injection of ropivacaine using walking track analysis in rats. British Journal of Anaesthesia. 94 (4), 524-529 (2005).
  22. Brown, C. J., et al. Self-evaluation of walking-track measurement using a sciatic function index. Microsurgery. 10 (3), 226-235 (1989).
  23. Bozkurt, A., et al. CatWalk gait analysis in assessment of functional recovery after sciatic nerve injury. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 91-98 (2008).
  24. Deumens, R., Jaken, R. J. P., Marcus, M. A. E., Joosten, E. A. J. The CatWalk gait analysis in assessment of both dynamic and static gait changes after adult rat sciatic nerve resection. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 120-130 (2007).
  25. McKinnon, K. M. Flow cytometry: An overview. Current Protocols in Immunology. 2018, 1-11 (2018).
  26. Jensen, A. R., et al. Neer Award 2018: Platelet-derived growth factor receptor α co-expression typifies a subset of platelet-derived growth factor receptor β-positive progenitor cells that contribute to fatty degeneration and fibrosis of the murine rotator cuff. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27 (7), 1149-1161 (2018).
  27. Mosich, G. M., et al. Non-fibro-adipogenic pericytes from human embryonic stem cells attenuate degeneration of the chronically injured mouse muscle. JCI Insight. 4 (24), (2019).
  28. Lee, D., et al. HMGB2 is a novel adipogenic factor that regulates ectopic fat infiltration in skeletal muscles. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
  29. Low, M., Eisner, C., Rossi, F. Fibro/Adipogenic Progenitors (FAPs): Isolation by FACS and Culture. Muscle Stem Cells: Methods and Protocols. , 179-189 (2017).
  30. Giuliani, G., et al. SCA-1 micro-heterogeneity in the fate decision of dystrophic fibro/adipogenic progenitors. Cell Death and Disease. 12 (1), 1-24 (2021).
  31. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  32. Upadhyay, G. Emerging role of lymphocyte antigen-6 family of genes in cancer and immune cells. Frontiers in Immunology. 10, 819(2019).
  33. Boscolo Sesillo, F., Wong, M., Cortez, A., Alperin, M. Isolation of muscle stem cells from rat skeletal muscles. Stem Cell Research. 43, 101684(2020).
  34. Ciaramitaro, P., et al. Traumatic peripheral nerve injuries: Epidemiological findings, neuropathic pain and quality of life in 158 patients. Journal of the Peripheral Nervous System. 15 (2), 120-127 (2010).
  35. Noble, J., Munro, C. A., Prasad, V. S. S. V., Midha, R. Analysis of upper and lower extremity peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 45 (1), (1998).
  36. Malik, S. Traumatic peripheral neuropraxias in neonates: A case series. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (10), 10-12 (2014).
  37. Smith, B. W., Daunter, A. K., Yang, L. J. S., Wilson, T. J. An update on the management of neonatal brachial plexus palsy-replacing old paradigms a review. JAMA Pediatrics. 172 (6), 585-591 (2018).
  38. Rebolledo, D. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle fibrosis is mediated by CTGF/CCN2 independently of TGF-β. Matrix Biology. 82, 20-37 (2019).
  39. Walls, P. L. L., McRae, O., Natarajan, V., Johnson, C., Antoniou, C., Bird, J. C. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
  40. Yuen, D. A., et al. Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism. PLOS One. 5 (3), 9543(2010).
  41. Fukada, S. I. The roles of muscle stem cells in muscle injury, atrophy and hypertrophy. Journal of Biochemistry. 163 (5), 353-358 (2018).
  42. Itabe, H., Yamaguchi, T., Nimura, S., Sasabe, N. Perilipins: A diversity of intracellular lipid droplet proteins. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 1-11 (2017).
  43. Chapman, M. A., Mukund, K., Subramaniam, S., Brenner, D., Lieber, R. L. Three distinct cell populations express extracellular matrix proteins and increase in number during skeletal muscle fibrosis. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 312 (2), 131-143 (2016).
  44. Hillege, M., Galli Caro, R., Offringa, C., de Wit, G., Jaspers, R., Hoogaars, W. TGF-β regulates Collagen Type I expression in myoblasts and myotubes via transient Ctgf and Fgf-2 Expression. Cells. 9 (2), 375(2020).
  45. Kafadar, K. A., Yi, L., Ahmad, Y., So, L., Rossi, F., Pavlath, G. K. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
  46. Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. Journal of Visualized Experiments. (81), e50657(2013).
  47. Carlson, B. M. The biology of long-term denervated skeletal muscle. European Journal of Translational Myology. 24 (1), (2014).
  48. Kennedy, E., et al. Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - A model for neonatal, neointimal SMC or differentiated vascular stem cells. Vascular Cell. 6 (1), 1-13 (2014).
  49. Pannérec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development (Cambridge). 140 (14), 2879-2891 (2013).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Flow CytometryRat DenervationCell IsolationSurface MarkersSca 1 ConjugationCell CultureImmunostaining

Verwandte Artikel