Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

Summary

Die Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie kann wesentlich zum Verständnis des Musters der Immunantwort gegen Implantate beitragen. In dieser Arbeit wird eine präzise Methode zur Isolierung von Zellen aus präparierten Implantaten und deren Färbung für die durchflusszytometrische Analyse beschrieben.

Abstract

Der Erfolg der Implantation von im Labor gezüchtetem Gewebe oder eines medizinischen Geräts in eine Person hängt von der Immunantwort des Empfängerwirts ab. Betrachtet man ein Implantat als Fremdkörper, kann eine feindliche und dysregulierte Immunantwort zur Abstoßung des Implantats führen, während eine regulierte Reaktion und Wiedererlangung der Homöostase zu seiner Akzeptanz führen kann. Die Analyse der Mikroumgebungen von Implantaten, die unter In-vivo- oder Ex-vivo-Bedingungen präpariert werden, kann dazu beitragen, das Muster der Immunantwort zu verstehen, was letztendlich zur Entwicklung neuer Generationen von Biomaterialien beitragen kann. Die Durchflusszytometrie ist eine bekannte Technik zur Charakterisierung von Immunzellen und ihren Untergruppen anhand ihrer Zelloberflächenmarker. Diese Übersichtsarbeit beschreibt ein Protokoll, das auf manuellem Würfeln, enzymatischem Aufschluss und Filtration durch ein Zellsieb zur Isolierung einheitlicher Zellsuspensionen aus präpariertem Implantatgewebe basiert. Des Weiteren wurde ein mehrfarbiges Durchflusszytometrie-Färbeprotokoll erläutert, zusammen mit Schritten für anfängliche Zytometereinstellungen, um diese isolierten Zellen durch Durchflusszytometrie zu charakterisieren und zu quantifizieren.

Introduction

Fortschritte auf dem Gebiet der Medizin haben dazu geführt, dass häufig implantierte Materialien zur Unterstützung der Funktion oder des Nachwachsens von geschädigtem Gewebe verwendet werden ^1,2. Dazu gehören Geräte wie Herzschrittmacher, rekonstruktive kosmetische Implantate und orthopädische Platten, die zur Fixierung von Knochenbrüchen verwendet werden ^3,4. Die Materialien, die zur Herstellung dieser Implantate verwendet werden, und die Stellen, an denen sie implantiert werden, spielen jedoch eine wichtige Rolle für den Erfol....

Protocol

HINWEIS: Abbildung 1 gibt einen Überblick über das Durchflusszytometrieprotokoll.

1) Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Sie Medien für die Verdünnung von Enzymen und für die Gewebekultur vor.
   1. 5 ml 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)-Pufferlösung in 500 ml RPMI-Medium geben und gut schütteln. Lagern Sie das Medium bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
2. Berechnen Sie das Volumen der Enzymlösung.
   ANMERKUNG: Das Volumen der Enzymlösung ist das Volumen des Mediums, das die Enzyme (Kollagenase und DNase I) enthält, die benötigt werden, um gewürfeltes Geweb....

Results

Der Prozess der Entwicklung von Durchflusszytometrie-Panels für die Immunanalyse beruht häufig auf dem Vergleich der Ergebnisse mit vorhandenen Daten und der Literatur auf diesem Gebiet. Das Wissen darüber, wie sich Populationen in der Durchflusszytometrie präsentieren können, ist entscheidend für die richtige Interpretation von Daten. Unabhängig davon können Populationen und Zelltypen in verschiedenen Geweben unterschiedlich aussehen, so dass eine gewisse Variabilität zu erwarten ist. Im.......

Discussion

Diese Übersichtsarbeit beschreibt eine detaillierte Methodik zur Isolierung von Zellen aus Biomaterialimplantaten, um eine einheitliche Zellsuspension zu erhalten. Darüber hinaus wurde ein detailliertes Protokoll für die Färbung der Zellsuspension für die Mehrfarben-Durchflusszytometrie sowie die Schritte zur Konfiguration eines Durchflusszytometers für optimale Ergebnisse bereitgestellt. Zellisolierungsmethoden können mehrere Schritte umfassen, wobei häufig eine manuelle Gewebedissektion gefolgt von einem enzymatischen .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Konische 50-ml-Röhrchen	Fisher Scientific	14-432-22
6-Well-Platte	Fisher Scientific	07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer Plus	BD Biosciences	566385
BD Cytofix	BD Biosciences	554655	Nur zur Fixierung von Zellen
Rinderserumalbumin	Millipore Sigma	A7906	Zur Herstellung von FACS Färbepuffer
CD11b AF700	Biolegend	101222	Klon: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	Klon: N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	Klon: 4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	Klon: Ba13
CD206 PE	Biolegend	141705	Klon: C068C2
CD45 BUV737	BD Biosciences	612778	Klon: 104/A20
CD86 BUV395	BD Biosciences	564199	Klon: GL1
CD8a BV421	Biolegend	100737	Klon: 53-6.7
Comp Bead Anti-Maus	BD Biosciences	552843	Zur Kompensationskontrolle
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	Pankreas-Pankreas-Desoxyribonuklease I (DNase I
)F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	Klon: BM8
Fc Block	Biolegend	101301	Klon: 93
Fixations-/Permeabilisierungslösungskit	BD Biosciences	554714	Zur Fixierung und Permeabilisierung von Zellen.
HEPES-Puffer	Thermo Fisher	15630080	Puffer zur Ergänzung von Zellmedien
Liberase	Millipore Sigma 5401127001		Mischung aus gereinigter Kollagenase I und Kollagenase II
LEBEND/TOT Fixierbares blaues Färbungsset für tote Zellen	Thermo Fisher	L23105	Viabilitätsfarbstoff
Ly6c AF488	Biolegend	128015	Klon: HK1.4
Ly6g BV510	Biolegend	127633	Klon: 1A8
MHCII BV786	BD Biosciences	742894	Klon: M5/114.15.2
Phosphatpuffer Kochsalzlösung	Thermo Fisher	D8537
RPMI	Thermo Fisher	11875176	Zellkulturmedien
Siglec F BV605	BD Biosciences	740388	Klon: E50-2440
96-Well-Platte			mit V-Boden