Isolierung und funktionelle Beurteilung menschlicher Brustkrebsstammzellen aus Zell- und Gewebeproben

Das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen menschlicher Brustkrebsstammzellen (BCSCs) ist entscheidend, um die Herausforderungen bei der Brustkrebsbehandlung zu bewältigen. Die Entstehung des BCSC-Konzepts geht auf das frühe 21^{. Jahrhundert zurück}, als eine kleine Population von CD44⁺CD24^-/niedrigen Brustkrebszellen in der Lage war, heterogene Tumore in Mäusen zu erzeugen ^1,2. Anschließend wurde beobachtet, dass menschliche Brustkrebszellen mit hoher enzymatischer Aktivität der Aldehyddehydrogenase (ALDH^high) ebenfalls ähnliche stammzellähnliche Eigenschaften aufwiesen³. Diese BCSCs stellen eine kleine Population von Zellen dar, die zur Selbsterneuerung und Differenzierung fähig sind, was zur heterogenen Natur von Massentumoren ^{beiträgt 1,2,3}. Zunehmende Beweise deuten darauf hin, dass Veränderungen in evolutionär konservierten Signalwegen das Überleben und die Aufrechterhaltung von BCSC vorantreiben 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass die extrinsische Mikroumgebung der Zelle eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung verschiedener BCSC-Funktionen spielt^15,16,17. Diese molekularen Signalwege und die externen Faktoren, die die BCSC-Funktion regulieren, tragen zum Rückfall von Brustkrebs, zur Metastasierung¹⁸ und zur Entwicklung von Therapieresistenzen bei 19,20,21, wobei die Restexistenz von BCSCs nach der Behandlung eine große Herausforderung für das Gesamtüberleben von Brustkrebspatientinnen darstellt^22,23 . Die präklinische Bewertung dieser Faktoren ist daher sehr wichtig, um BCSC-zielgerichtete Therapien zu identifizieren, die für bessere Behandlungsergebnisse und ein verbessertes Gesamtüberleben bei Brustkrebspatientinnen von Vorteil sein könnten.

Mehrere in vitro menschliche Brustkrebs-Zelllinienmodelle und in vivo menschliche Xenograft-Modelle wurden verwendet, um BCSCs 24,25,26,27,28,29 zu charakterisieren. Die Fähigkeit von Zelllinien, sich nach jeder nachfolgenden Passage kontinuierlich neu zu besiedeln, macht diese zu einem idealen Modellsystem für die Durchführung von Omics-basierten und pharmakogenomischen Studien. Zelllinien können jedoch die in Patientenproben beobachtete Heterogenität oft nicht rekapitulieren. Daher ist es wichtig, Zellliniendaten mit Patientenproben zu ergänzen. Die Isolierung von BCSCs in ihrer reinsten Form ist wichtig, um eine detaillierte Charakterisierung von BCSCs zu ermöglichen. Das Erreichen dieser Reinheit hängt von der Auswahl der phänotypischen Marker ab, die für BCSCs spezifisch sind. Derzeit wird der ALDH-Zellphänotyp^{mit hohem}CD44⁺CD24-Zellgehalt am häufigsten verwendet, um humane BCSCs aus Massen-Brustkrebszellpopulationen zu unterscheiden und zu isolieren, wobei Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) für maximale Reinheit ^{verwendet wird 1, 3,26}. Darüber hinaus können die Eigenschaften isolierter BCSCs wie Selbsterneuerung, Proliferation und Differenzierung mit in vitro und in vivo Techniken bewertet werden.

Zum Beispiel können In-vitro-Koloniebildungsassays verwendet werden, um die Fähigkeit einer einzelnen Zelle zu beurteilen, sich selbst zu erneuern, um eine Kolonie von 50 Zellen oder mehr bei unterschiedlichen Behandlungsbedingungen zu bilden³⁰. Mammosphären-Assays können auch verwendet werden, um das Selbsterneuerungspotenzial von Brustkrebszellen unter verankerten Bedingungen zu beurteilen. Dieser Assay misst die Fähigkeit einzelner Zellen, bei jeder nachfolgenden Passage unter serumfreien, nicht adhärenten Kulturbedingungen als Kugeln (Mischung aus BCSCs und Nicht-BCSCs) zu erzeugen und zu wachsen³¹. Darüber hinaus können 3-dimensionale (3D) Kulturmodelle verwendet werden, um die BCSC-Funktion zu bewerten, einschließlich Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, die die In-vivo-Mikroumgebung genau rekapitulieren und die Untersuchung der Aktivität potenzieller BCSC-zielgerichteter Therapien ermöglichen³². Trotz der vielfältigen Anwendungen von In-vitro-Modellen ist es schwierig, die Komplexität von In-vivo-Bedingungen nur mit In-vitro-Assays zu modellieren. Diese Herausforderung kann durch die Verwendung von Maus-Xenograft-Modellen zur Bewertung des BCSC-Verhaltens in vivo überwunden werden. Insbesondere dienen solche Modelle als ideales System zur Beurteilung der Brustkrebsmetastasierung³³, zur Untersuchung von Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung während des Krankheitsverlaufs 34, zur In-vivo-Bildgebung 35 und zur Vorhersage der patientenspezifischen Toxizität und Wirksamkeit von Antitumorwirkstoffen ³⁴.

Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung für die Isolierung von humanen ALDH^hohenCD44⁺CD24^- BCSCs in maximaler Reinheit aus Massenpopulationen heterogener Brustkrebszellen. Wir bieten auch eine detaillierte Beschreibung von drei In-vitro-Techniken (koloniebildender Assay, Mammosphärentest und 3D-Kulturmodell) und einen In-vivo-Tumor-Xenograft-Assay, der zur Beurteilung verschiedener Funktionen von BCSCs verwendet werden kann. Diese Methoden wären für Forscher geeignet, die an der Isolierung und Charakterisierung von BCSCs aus menschlichen Brustkrebszelllinien oder primär von Patienten abgeleiteten Brustkrebszellen und Tumorgewebe interessiert sind, um die BCSC-Biologie zu verstehen und/oder neuartige BCSC-zielgerichtete Therapien zu untersuchen.

Die Entnahme von chirurgischen oder Biopsieproben von Patienten, die direkt von einwilligenden Brustkrebspatientinnen stammten, wurde nach einem genehmigten humanethischen Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Ethic Board genehmigt wurde. Alle Mäuse, die zur Erstellung von von Patienten abgeleiteten Xenograft-Modellen verwendet wurden, wurden gepflegt und in einer von der Institution zugelassenen Tiereinrichtung untergebracht. Das Tumorgewebe aus patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen mit Mäusen wurde gemäß dem genehmigten Ethikprotokoll generiert, das vom institutionellen Tierpflegeausschuss genehmigt wurde.

1. Präparation von Zelllinien

1. Führen Sie alle Zellkultur- und Färbevorgänge unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank durch. Verwenden Sie sterile Zellkulturschalen/-kolben und Reagenzien.
2. Halten Sie menschliche Brustkrebszellen bei 37 °C mit 5% CO₂ in definierten Medien, ergänzt mit fetalem Rinderserum (FBS) und notwendigen Wachstumsfaktoren, die für jede Zelllinie spezifisch sind.
3. NIH3T3-Fibroblastenzellkulturen der Maus (zur Verwendung in koloniebildenden Assays) bei 37 °C mit 5%_CO2 in Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 10% FBS.
4. Für alle Kulturen, füllen Sie die alten Medien alle 2-3 Tage mit frischen Medien auf. Sobald die Kulturen 75-80% Konfluenz erreicht haben, Subkultur in mehrere sterile Zellkulturkolben.

2. Vorbereitung von Brustkrebs-Tumorgewebe

1. Sammeln Sie die vom Patienten abgeleiteten chirurgischen oder Biopsieproben direkt von einwilligenden Brustkrebspatientinnen im Rahmen eines vom institutionellen Ethikrat genehmigten Humanethikprotokolls.
2. Anschließend sammeln und generieren Sie Tumorgewebe aus patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen unter Verwendung von Mäusen unter einem vom institutionellen Tierpflegeausschuss genehmigten Tierethikprotokoll.
3. Sammeln Sie alle Tumorgewebe unter sterilen Bedingungen in ein 50 ml steriles konisches Röhrchen mit 30 ml DMEM:F12-Medien, halten Sie es auf Eis und verarbeiten Sie die Proben wie unten beschrieben innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme.

3. Erzeugung von Einzelzellsuspensionen von Brustkrebszellen

1. Asspirieren Sie Medien aus dem Kolben, der eine Monoschicht von Brustkrebszellen enthält, die zu 60-80% konfluent ist (Zelllinien Ihrer Wahl). Waschen Sie die Zellen mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). PBS absaugen und geeignete Zelldissoziationslösung hinzufügen (z. B. Trypsin:EDTA; gerade genug, um die Monoschicht der Zellen zu bedecken) und 5 min bei Raumtemperatur (empfohlen) oder bei 37 °C inkubieren.
2. Fügen Sie 5 ml Kulturmedien hinzu, um die Aktivität der Zelldissoziationslösung zu neutralisieren.
3. Die resultierende dissoziierte Zelllösung wird in ein 50 mL konisches Röhrchen überführt und bei 1000 x g für 5 min zentrifugiert.
4. Überstand verwerfen und das Zellpellet in 5 ml 1x PBS resuspendieren. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und einem Mikroskop.
   HINWEIS: Beobachten Sie die Zellverklumpung im Hämozytometer. Wiederholen Sie den Zelldissoziationsschritt, wenn sich keine Einzelzellsuspension gebildet hat.
5. Nach der Zellzählung die Zellsuspension bei 1000 x g für 5 min neu zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Zellpellet im ALDH-Substratpuffer in einer Konzentration von 1 x 10⁶ Zellen / ml resuspendieren.

4. Erzeugung einer Einzelzellsuspension aus Gewebeproben

1. Zerkleinern Sie das Tumorgewebe mit chirurgischen Klingen in einer Kreuztechnik, um kleinere Stücke von etwa 1 mm Größe zu erhalten. Die Gewebestücke werden in ein frisches 50 ml konisches Röhrchen mit 10 mL Dissoziationspuffer (1X Kollagenase in DMEM:F12) überführt. Das konische Röhrchen mit Parafilm verschließen und bei 37 °C in einem Schüttelbrutschrank 40 min inkubieren.
   HINWEIS: Wenn kein Shaker-Inkubator vorhanden ist, legen Sie das Röhrchen in ein 37 °C warmes Wasserbad und mischen Sie das Röhrchen alle 5-10 Minuten.
2. Pelletieren Sie das verdaute Gewebe durch Zentrifugieren der Probe bei 530 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 5 ml Trypsin hinzu. Pipettieren Sie mit einer 1-ml-Pipette (eingestellt auf 750 μL), um das Pellet zu stören, und inkubieren Sie 5 Minuten lang in einem 37 °C-Wasserbad. Nach der Inkubation pipetten Sie kräftig auf und ab, um einzelne Zellen freizusetzen.
3. Das Gesamtvolumen im Röhrchen mit DMEM:F12-Medien auf 25 mL auffüllen und bei 1000 x g für 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Dispase-DNase-Lösung. In einem 37 °C warmen Wasserbad 5 min inkubieren.
4. Füllen Sie das Gesamtvolumen in der Röhre mit PBS auf 10 ml auf. Mischen Sie durch Pipettieren auf und ab, führen Sie die resultierende Zellsuspension durch ein 40-μm-Zellsieb, das an einem frischen 50-ml-konischen Röhrchen befestigt ist. Zentrifugieren bei 1000 x g für 5 min.
5. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml 1x PBS. Zählen Sie die Zellen und schließen Sie die Herstellung der Zellsuspension gemäß den Schritten 3.4 und 3.5 ab.

5. Isolierung von Brustkrebsstammzellen (BCSCs)

1. Label-Durchflussröhrchen für die ungefärbte Kontrolle, einzellige Färbekontrollen (DEAB-Kontrolle, ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7, 7AAD), das Negativkontrollröhrchen (gefärbt mit DEAB, CD44-PE, CD24-PE-Cy7 und 7AAD), fluoreszierende minus eins (FMO) Kontrolle und die Sortierröhre (gefärbt mit ALDH, CD44, CD24 und 7AAD).
2. Übertragen Sie 500 μL (0,5 x 10⁶ Zellen) der Zellsuspensionen aus Schritt 3.5 oder Schritt 4.5 in jedes Röhrchen, das nur als Zellen gekennzeichnet ist, CD44, CD24 und 7AAD. Legen Sie die Röhrchen bis zum Gebrauch auf Eis.
3. 2 ml Probe (2 x 10⁶ Zellen) in das entsprechende ALDH-Röhrchen überführen. Fügen Sie 5 μL DEAB in die "DEAB-Kontroll"- und "Negativkontrollröhrchen" hinzu und verschließen Sie sie fest. Fügen Sie 10 μL ALDH-Substrat in die ALDH-Röhre hinzu, mischen Sie gut durch Wirbeln und übertragen Sie sofort 500 μL in die entsprechenden "DEAB-Kontrollröhrchen" und "Negativkontrollröhrchen". Rekapitulieren Sie die "DEAB-Kontrolle", "Negativkontrolle" und "ALDH-Röhrchen" und inkubieren Sie bei 37 °C für 30-60 min (nicht mehr als 60 Minuten).
   HINWEIS: Die optimale Inkubationszeit kann je nach Zelllinie optimiert werden müssen. Schützen Sie das ALDH-Substrat und die Röhrchen mit gefärbten Zellen immer vor Licht.
4. Nach der Inkubation alle Proben für 5 min bei 250 x g zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL ALDH-Substratpuffer. Fügen Sie die vom Hersteller empfohlene oder benutzeroptimierte Konzentration des Anti-CD44-PE- und Anti-CD24-PE-Cy7-Antikörpercocktails hinzu und inkubieren Sie bei 4 °C für 30 min. Fügen Sie Anti-CD44-PE- und Anti-CD24-PE-Cy7-Antikörper zu den jeweils mit "CD44" und "CD24" markierten Röhrchen hinzu.
5. Nach der Inkubation alle Proben bei 250 x g für 5 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μL ALDH-Substratpuffer. Inkubieren Sie das "Negativkontrollröhrchen", das "Sortierröhrchen" und das "7ADD"-Röhrchen mit 7AAD (empfohlene Konzentration: 0,25 μg/1 x 10⁶ Zellen) für 10 min auf Eis.
   HINWEIS: Die ALDH-Aktivität wird im grün fluoreszierenden Kanal nachgewiesen, daher sollte ein Fluorochrom mit einem anderen kompatiblen Emissionsspektrum verwendet werden. Wenn während der Multiparameter-Durchflusszytometrie eine spektrale Überlappung beobachtet wird, sollten Einzelfarbkontrollen und FMO-Steuerung als Leitfaden verwendet werden, um eine Kompensation zwischen Fluorochromen zu ermöglichen, um das Übergreifen des Fluoreszenzsignals in andere Kanäle zu minimieren.
6. Richten Sie das Analyseprotokoll auf dem FACS-Gerät ein, um die Probenanalyse vorzubereiten. Erstellen Sie Streudiagramme (Vorwärts- vs. Seitenstreuung, Vorwärtsstreuung vs. Fluoreszenzkanäle).
7. Stellen Sie mit dem ungefärbten Steuerelement den Photomultiplier ein, um Trümmer von der gesamten Zellpopulation zu trennen, und passen Sie die Fluoreszenzspannung an, um die gesamte Zellpopulation um die erste logarithmische Skala zu bewegen (10¹). Bewegen Sie mit der DEAB-Steuerung die gesamte Zellpopulation innerhalb der zweiten Log-Skala (10²), indem Sie den grün fluoreszierenden Spannungskanal anpassen.
8. Analysieren Sie zuerst alle einzelnen Färbekontrollen (ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7) und 7AAD- und FMO-Steuerung, indem Sie die Spannung anpassen, um gefärbte von nicht gefärbten Zellen zu trennen und das Verschütten von fluoreszierenden Signalen in andere Kanäle zu minimieren.
9. Gate auf die positive Population für jede einzelne gefärbte Zellprobe. Verwendung des Negativkontrollröhrchens, Gate für Lebensfähigkeit (7AAD negativ), ALDH^niedrige und ALDH^hohe Zellpopulationen (repräsentative Gating-Strategie in Abbildung 1B gezeigt).
10. Analysieren Sie gefärbte Proben mit mehreren Parametern, um BCSCs zu isolieren. Wählen Sie unter Verwendung der lebensfähigen ALDH^Low und ALDH^High Gates die Zellpopulation CD44⁺CD24- (BCSC) bzw. CD44-CD24⁺ (^Nicht-BCSC) aus (Abbildung 1B).
11. Sammeln Sie lebensfähige BCSCs und Nicht-BCSCs in Sammelmedien in sterilen Sammelröhrchen (Populationen aus zwei repräsentativen Zelllinien, die in Abbildung 2A&B gezeigt sind). Verwenden Sie sortierte Zellen für nachgeschaltete In-vitro- und In-vivo-Assays, wie unten beschrieben.
    HINWEIS: Zusätzlich zu den unten beschriebenen In-vitro- und In-vivo-Assays können BCSCs durch Messung der Expression pluripotenter Marker wie SOX2, OCT4 und NANOG mittels Standard-Immunoblotting-Techniken validiert werden.

Abbildung 1: FACS-Gating-Strategie zur Isolierung von BCSCs aus Brustkrebszelllinien und Gewebeproben. (A) Flussdiagramm, das das Verfahren der BCSC-Isolierung beschreibt. (B) Repräsentative FACS-Diagramme, die die Sortierstrategie zur Isolierung lebensfähiger BCSCs und Nicht-BCSCs aus einem heterogenen Zellpool zeigen. MDA-MB-231 menschliche Brustkrebszellen werden gleichzeitig mit 7-AAD, CD44-APC, CD24-PE und dem ALDH-Substrat markiert. Zelluntergruppen wurden unter Verwendung eines Vierfarbprotokolls auf einer FACS-Maschine isoliert. Die Zellen werden basierend auf der erwarteten Lichtstreuung ausgewählt, dann für Singuletts und Lebensfähigkeit basierend auf 7-AAD-Ausschluss. Die Zellen werden dann auf ALDH-Aktivität analysiert und die besten 20% positivsten werden als^ALDH-hohe Population ausgewählt, während die unteren 20% der Zellen mit der niedrigsten ALDH-Aktivität als ALDH-niedrig eingestuft wurden. Schließlich werden 50% der ALDH-Low-Zellen basierend auf einem CD44-Low/-CD24⁺-Phänotyp und 50% der ALDH-High-Zellen basierend auf dem CD44⁺CD24-Phänotyp ausgewählt. Diese Abbildung wurde von Chu et ^al.17 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: BCSC-Anteile sind in verschiedenen Brustkrebszelllinien variabel. Repräsentatives Bild, das den unterschiedlichen Anteil von BCSCs und Nicht-BCSCs in (A) SUM159 und (B) MDA-MD-468 dreifach negativen Brustkrebszelllinien nach Markierung und Sortierung wie in Abbildung 1 beschrieben zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

6. Koloniebildender Assay

1. Resuspendieren Sie die interessierenden Zellen (sortierte Zellen aus Schritt 5.11 oder unsortierte Zellen aus Schritt 3.5 oder 4.5) in vollständigen Medien.
2. Beschriften Sie drei Durchflussrohre für 1 x 10 2, 2 x 10 2 und 5 x 10² Zellen. Fügen Sie 2 ml komplettes Medium hinzu und übertragen Sie die entsprechende Zellnummer (sortiert aus Schritt 5.11 oder unsortierte Zellen aus Schritt 3.5 oder 4.5) in die entsprechenden Röhrchen. Mischen Sie die Zelllösungen gründlich, indem Sie sie 5 Mal auf und ab pipettieren.
3. Platten Sie die Zellen in eine 6-Well-Platte und verteilen Sie die Zellsuspension, indem Sie die Platten vorsichtig schwenken, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erhalten.
4. Die Platten werden in einem Inkubator mit 5 %_CO2 bei 37 °C inkubiert, bis Kolonien entstehen (wobei Kolonien = ≥50 Zellen pro Kolonie) auftreten. Füllen Sie die Medien zweimal pro Woche sorgfältig auf, ohne die Koloniebildung zu stören.
5. Medien absaugen und einmal mit 1 ml PBS waschen. 0,5 ml 0,05% kristallviolette Lösung in jede Vertiefung geben und die Platte 30 Minuten lang inkubieren. Entfernen Sie überschüssige kristallviolette Flecken, indem Sie sie mit 2 ml Wasser waschen. Wiederholen Sie den Waschschritt, bis die Hintergrundflecken entfernt wurden.
6. Zählen und notieren Sie mit einem Mikroskop mit 4-facher und 10-facher Vergrößerung die Gesamtzahl der erzeugten Kolonien (repräsentative Bilder in Abbildung 3A).
7. Berechnen Sie die Häufigkeit der Koloniebildung wie folgt: Häufigkeit (%) = (# der gebildeten Kolonien/Anzahl der ausgesäten Zellen) x 100. Wenn beispielsweise 25 Kolonien aus 1 x 10² Zellen erzeugt werden, dann ist die Häufigkeit der Koloniebildung, Frequenz = (25/100) x100 = 25%.
8. Alternativ können die Schritte 6.1 bis 6.4 durch eine alternative Methode ersetzt werden, die eine Kokultur mit Fibroblasten umfasst, die eine mikroökologische Unterstützung für BCSCs durch die Produktion notwendiger Wachstums- und Überlebensfaktoren bieten.
9. Vorbeschichtung von 60 mm Kulturschalen mit Rinderkollagen Typ I (1 zu 30 Verdünnung von 3 mg/ml Kollagen). Lassen Sie Kollagen 30 Minuten in einem 37 °C Inkubator polymerisieren. Das unpolymerisierte Kollagen absaugen und die Platte zweimal mit 1x PBS waschen. Decken Sie die kollagenbeschichtete Platte mit 1 ml PBS ab und stellen Sie sie bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur beiseite.
10. Beschriften Sie drei Durchflussrohre für 1 x 10 3, 5 x 10³ und 1 x 10⁴ Zellen. Fügen Sie 4 ml koloniebildendes Assay-Medium hinzu und überführen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen (sortiert aus Schritt 5.11 oder unsortierte Zellen aus Schritt 3.5 oder 4.5) in die entsprechenden Röhrchen. Fügen Sie bestrahlte NIH3T3-Fibroblasten der Maus hinzu (4 x 10⁴ Zellen/ml Medien). Mischen Sie Zelllösungen gründlich, indem Sie sie 5 Mal auf und ab pipettieren.
11. Das PBS wird aus der kollagenbeschichteten Kulturschale aus Schritt 6.1 abgesaugt und die Zellmischung wie in Schritt 6.3 beschrieben auf jede der Zellkulturplatten aufgetragen.
12. Inkubieren Sie die Platten in einem 37 °C, 5% CO₂ -Inkubator und lassen Sie sie 7-10 Tage ungestört oder bis sich Kolonien bilden, ohne das Medium aufzufüllen. Zählen und notieren Sie die Gesamtzahl der generierten Kolonien, wie in den Schritten 6.6 und 6.7 beschrieben.

7. Mammosphären-Assay

1. Resuspendieren Sie die interessierenden Zellen (sortierte Zellen aus Schritt 5.11 oder unsortierte Zellen aus Schritt 3.5 oder 4.5) in kompletten Mammosphärenmedien und Plattenzellen mit einer Seedingdichte von 5 x 10 2 Zellen/cm² Fläche in einer 96 Well-Ultra-Low-Attachment-Zellkulturplatte.
   HINWEIS: Die Zellaussaatdichte sollte für verschiedene Zelllinien optimiert werden.
2. Die Kulturplatten 5-10 Tage in einem 37 °C Inkubator mit 5%_CO2 inkubieren. Füllen Sie die Medien zweimal pro Woche vorsichtig auf, ohne die Mammosphärenbildung zu stören.
3. Zählen Sie nach der Inkubation die Anzahl der Mammosphären, die in jeder Vertiefung mit einem Mikroskop erzeugt werden. wobei Mammosphären als Brustkrebszellcluster mit einem Durchmesser von mehr als 100 μm definiert sind (repräsentative Bilder in Abbildung 3B).
4. Berechnen Sie die Mammosphärenbildungseffizienz (MFE) wie folgt: MFE (%) = (Anzahl der Mammosphären pro Vertiefung)/ (Anzahl der pro Vertiefung ausgesäten Zellen) x 100 (d.h. wenn 5 Mammosphären von 1 x 10² Zellen in einem Well erzeugt werden, dann MFE = (5/100) x 100 = 5%).
5. Um Mammosphären zu subkulturieren, geben Sie die Medien mit Mammosphäreninhalt vorsichtig in ein frisches 50 ml konisches Röhrchen und Zentrifugenmedien bei 1000 x g für 5 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μL Trypsin und inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml komplettem Mammosphärenmedium. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und legen Sie die Zellen wie in Schritt 7.1 beschrieben in einer Zellkulturplatte mit extrem niedriger Bindung neu an.
   HINWEIS: Zusätzlich zur Subkulturierung können die aus der Mammosphäre gewonnenen Zellen auch weiter von FACS analysiert werden, um den BCSC-Phänotyp zu bewerten und/oder reine Populationen von BCSCs für andere nachgeschaltete Assays zu erhalten.
7. Um die Anzahl der Mammosphären-initiierenden Zellen in Ihren Zellpopulationen zu bestimmen, verwenden Sie eine alternative Methode mit kugelbegrenzender Verdünnungsanalyse (SLDA). Plattenzellen in seriellen Verdünnungen von hohen bis niedrigen Zellzahlen in einer 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Zellkulturplatte, wobei die höchste Verdünnung zu weniger als einer Zelle pro Vertiefung führt.
8. Die Kulturplatte 10-14 Tage in einem 37 °C Inkubator mit 5%_CO2 inkubieren und ungestört lassen, um eine Zellaggregation zu vermeiden.
9. Zählen Sie nach der Inkubation die Anzahl der Mammosphären, die in jeder Vertiefung mit einem Mikroskop erzeugt werden. wobei Mammosphären als Brustkrebszellcluster mit einem Durchmesser von mehr als 100 μm definiert sind. Berechnen Sie die Häufigkeit und Signifikanz der Kugel mit der Online-Software Extreme Limiting Dilution Analysis (ELDA) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).

8.3D Kulturmodell

1. Je nach experimenteller Fragestellung Basalmembranextrakt (BME) mit oder ohne Wachstumsfaktoren (reduziert) verwenden. Um die Wirkung des individuellen Wachstumsfaktors auf Krebszellen zu bewerten, verwenden Sie einen reduzierten BME. Es hilft auch bei der Minimierung der unspezifischen Auswirkungen endogener Wachstumsfaktoren, die bei BME vorhanden sind.
   HINWEIS: BME erstarrt über 10 °C. Halten Sie BME auch während des Auftauschritts immer auf Eis.
2. Geben Sie vorsichtig 50 μL BME pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte, ohne Luftblasen zu erzeugen, und lassen Sie sie 1 h lang bei 37 °C polymerisieren. Nach 10 Minuten Inkubation 100 μL PBS hinzufügen, um ein Austrocknen der Gelschicht zu vermeiden.
3. Resuspendieren Sie die sortierten Zellen aus Schritt 5.11 oder unsortierte Zellen aus Schritt 3.5 oder 4.5 in einer Konzentration von 5 x 10³ bis 5 x 10⁴/200 μL in 3D-Kulturmedien.
4. Sobald der BME polymerisiert ist, entfernen Sie PBS, geben Sie 200 μL Zellsuspension in jede Vertiefung und inkubieren Sie im 37 °C Inkubator mit 5%_CO2. Fügen Sie PBS zu den umliegenden Bohrlöchern hinzu, um eine Verdunstung der Medien zu vermeiden.
   HINWEIS: Die optimale Anzahl von Zellen für die Beschichtung sollte vor dem Einstellen des Experiments bestimmt werden. Je nach experimenteller Fragestellung können BCSCs allein oder mit anderen Zelltypen (Fibroblasten/Endothel-/Immunzellen etc.) kultiviert werden.
5. Zweimal wöchentlich frische Medien auf die Kulturteller geben. Pflegen Sie Kulturen für 10-14 Tage, bevor Sie die Bildung von Organoiden analysieren (repräsentative Bilder in Abbildung 3C).
6. Für die Subkulturierung saugen Sie die Medien vorsichtig ab und fügen Sie 200 μL Dispase in jede Vertiefung enthaltende Zelle hinzu. Die Platte in einem 37 °C Inkubator für 1 h inkubieren. Nach der Hälfte der Inkubationszeit (30 min) nehmen Sie die Platte heraus, pipetten Sie die Dispaselösung vorsichtig 5 Mal auf und ab und legen Sie sie für weitere 30 Minuten wieder in den Inkubator.
7. Nach 1 h wird die dissoziierte Zelllösung in ein Flussrohr überführt. Waschen Sie den Brunnen mit 1x PBS mit 2% FBS (fPBS) und geben Sie es in das Durchflussrohr. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1000 x g für 5 min. Den Überstand vorsichtig absaugen und 500 μL Trypsin hinzufügen, bei 37 °C 5 min inkubieren. Inaktivieren Sie Trypsin durch Zugabe der gleichen Menge fPBS und Zentrifuge bei 1000 x g für 5 min.
8. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml 3D-Kulturmedien. Zählen Sie die Zellen und legen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen im BME wie in den Schritten 8.2 bis 8.4 neu an.
   HINWEIS: Mehrere Vertiefungen können zusammengefasst werden, um die interessierende Zellpopulation weiter zu analysieren oder zu sortieren.

Abbildung 3: In-vitro-Assays zur Beurteilung der BCSC-Zellfunktion. In-vitro-Assays wurden wie in den Protokollabschnitten 6.1 bis 6.5 (A), 7.1 bis 7.4 (B) oder 81 beschrieben durchgeführt. auf 8,4 + 8,6 (C). (A) Repräsentatives Bild, das die von menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB-231 erzeugten Kolonien zeigt; (B) Repräsentative Bilder, die die Mammosphärenbildung durch menschliche MCF7-, SUM159- oder MDA-MB-468-Zelllinien sowie von Patienten abgeleitete LRCP17-Brustkrebszellen zeigen. (C) Repräsentative Bilder, die die 3D-Strukturen zeigen, die von MCF7- und MDA-MB-231-Brustkrebszellen in 3D-Kulturmodellen gebildet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

HINWEIS: Führen Sie Tierversuche unter einem Tierethikprotokoll durch, das vom institutionellen Tierpflegekomitee genehmigt wurde.

9. In vivo Xenograft-Modell

1. Um die Tumorinitiationskapazität von Brustkrebsstammzellen zu bestimmen, bereiten Sie die Zellen (sortierte Population aus Schritt 5.7 oder unsortierte Populationen aus Schritt 3.5 oder 4.5) unter Verwendung eines begrenzenden Verdünnungsansatzes vor. Zellen in PBS werden seriell mit 1 bis 5 verschiedenen Verdünnungsgruppen verdünnt, mit Dosen von nur 0,01-0,2 x 10² Zellen/100 μL und bis zu 1 x 10⁶ Zellen/100 μL.
   HINWEIS: Unsortierte/ganze Populationszellen können als Kontrolle verwendet werden. Die Anzahl der verwendeten Verdünnungsgruppen hängt vom gewünschten wissenschaftlichen Ergebnis ab (z. B. wenn nur die Tumorgenität getestet wird, kann 1 Gruppe mit einer höheren Zellzahl verwendet werden, während es bei der Berechnung der Tumorinitiierungskapazität optimal ist, 5 limitierende Verdünnungsdosen zu testen).
2. Um Xenograft-Modelle aus menschlichen Brustkrebszellen zu generieren, verwenden Sie immungeschwächte weibliche Mäuse (athymische nackte [nu/nu], nicht-adipöse Diabetiker/schwere kombinierte immundefiziente [NOD/SCID] oder NOD/SCID IL2γ [NGS] Stämme).
   HINWEIS: Obwohl mindestens 4 Tiere pro Gruppe verwendet werden können, werden 8-12 Tiere pro Gruppe empfohlen, um robuste Ergebnisse zu erhalten, insbesondere zur Begrenzung der Verdünnungsanalyse.
3. Führen Sie Standard-Brustfettpolster-Injektionen (MFP) mit 100 μl / Maus jeder Zellpräparation unter sterilen Bedingungen in einer Biosicherheitswerkbank durch.
   HINWEIS: Für ein optimales Brusttumorwachstum und spontane Metastasen in entfernte Organe wird der thorakale MFP empfohlen. Alternativ kann auch der Leisten-MFP verwendet werden.
4. Überwachen Sie die Mäuse nach der Injektion täglich auf den allgemeinen Gesundheitszustand und das Tumorwachstum an der Injektionsstelle. Nach Erkennung eines tastbaren Tumors beginnen Sie mit der Messung der Tumorgröße durch Messschieber in zwei senkrechten Dimensionen und zeichnen Sie wöchentlich bis zum Endpunkt auf.
   HINWEIS: Der experimentelle Endpunkt wird auf der Grundlage der Vorschriften des institutionellen Tierethikprotokolls festgelegt. Typischerweise ist ein Endpunkt durch Euthanasie in der Regel erforderlich, sobald das Tumorvolumen 1500 mm³ erreicht. Bei BCSC-Populationen und/oder höheren Zelldosen (z. B. >1 x 104 Zellen) wird dieser Endpunkt wahrscheinlich innerhalb von 4-8 Wochen nach MFP-Injektion erreicht. Bei sehr niedrigen Zelldosen und/oder Nicht-BCSC-Zellpopulationen sollte das Tumorwachstum bis zu 8 Monate nach der Injektion fortschreiten dürfen.
5. Aus diesen Messungen berechnen Sie das Tumorvolumen mit der folgenden Formel: Volumen in mm³ = 0,52 x (Breite)² x Länge. Wenn Sie einen begrenzenden Verdünnungsansatz verwenden, berechnen Sie die tumorinitiierende Kapazität und Signifikanz mit der ELDA-Online-Software (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).
6. Alternativ, um den Endpunkt human zu erweitern, entfernen Sie chirurgisch Primärtumoren und überwachen Sie weiterhin Mäuse auf Gesundheit und/oder Entwicklung von spontanen Metastasen in entfernten Organen. Verwenden Sie reseziertes Tumorgewebe für die Erzeugung von seriellen Xenotransplantaten.
7. Am Endpunkt Gewebe von Primärtumoren und entfernten Organen (Lymphknoten, Lunge, Leber, Gehirn, Knochen) entnehmen und histopathologische und/oder immunhistochemische Analysen durchführen oder das Tumorgewebe dissoziieren und in den in den Abschnitten 6-8 beschriebenen In-vitro-Assays verwenden.

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Isolierung humaner BCSCs aus einer heterogenen Population von Brustkrebszellen, entweder aus Zelllinien oder aus dissoziiertem Tumorgewebe. Für jede gegebene Zelllinie oder Gewebeprobe ist es entscheidend, eine einheitliche Einzelzellsuspension zu erzeugen, um BCSCs mit maximaler Reinheit zu isolieren, da die Kontamination von Nicht-BCSC-Populationen zu variablen zellulären Reaktionen führen könnte, insbesondere wenn das Studienziel darin besteht, die Wirksamkeit von Therapeutika zu bewerten, die auf BCSCs abzielen. Die Anwendung einer strengen Sortierstrategie minimiert das Vorhandensein kontaminierender Nicht-BCSCs und führt dazu, dass der Anteil der Brustkrebszellen gesammelt werden kann mit stammzellähnlichen Eigenschaften, die einen zellulären Phänotyp aufweisen, der sie von der Massenpopulation von Krebszellen unterscheidet. Menschliche Brustkrebszellen, die eine erhöhte enzymatische ALDH-Aktivität aufweisen, hohe Konzentrationen des Zelloberflächenmarkers CD44 exprimieren und eine niedrige/negative Expression von CD24 aufweisen, haben einenALDH-hohenCD44+CD24-Phänotyp und können als BCSC klassifiziert werden. Der Anteil der BCSCs innerhalb der Massenpopulation kann zwischen Zelllinien oder Patienten variieren (Abbildung 2) und hängt oft vom Krankheitsstadium ab, wobei aggressiverer Brustkrebs in der Regel einen höheren Anteil an BCSCs aufweist26,36,37.

Isolierte BCSCs können verwendet werden, um verschiedene In-vitro - und In-vivo-Assays durchzuführen, wobei ihr Verhalten und ihre Funktion mit dem der Massen- und/oder Nicht-BCSC-Populationen verglichen werden können. Zum Beispiel kann die Fähigkeit einer einzelnen Brustkrebszelle, sich selbst zu erneuern und Kolonien von 50 Zellen zu erzeugen, durch koloniebildende Assays beurteilt werden (Abbildung 3A). Die Fähigkeit von BCSCs, sich unter verankerungsunabhängigen experimentellen Bedingungen selbst zu erneuern, kann durch Mammosphärentests beurteilt werden, bei denen variable Kugelanzahl, Größe und Kugelinitiierungskapazität analysiert und mit dem Vorhandensein und der Funktion von BCSCs korreliert werden können (Abbildung 3B). Es ist wichtig, die Seeding-Zelldichten für verschiedene Brustkrebszelllinien oder Brusttumorproben zu bestimmen, um optimale Ergebnisse zu erhalten. Dies ist besonders wichtig bei der Durchführung von SLDA, da höhere Zelldichten zu einer Zellaggregation führen können, was zu einer Fehlinterpretation der Zellaktivität führt.

Die Kultivierung von Brustkrebszellen in BME ermöglicht es BCSCs, 3D-Strukturen zu bilden, die unter vivo-Bedingungen rekapitulieren (Abbildung 3C). Die 3D-Kultur von Brustkrebszellen in Gegenwart anderer mikroumweltbedingter Zelltypen wie Fibroblasten, Endothelzellen und/oder Immunzellen hat die zusätzliche Fähigkeit, die Rolle der Mikroumgebung beim 3D-Wachstum von BCSCs zu untersuchen38,39. Die spezifischen Zellzahlen, die zur Erzeugung von 3D-Organoiden erforderlich sind, können je nach Zelllinie oder Tumorquelle des Patienten variieren, daher ist es wichtig, die Kulturbedingungen und Zellzahlen vor groß angelegten Experimenten zu optimieren.

Schließlich können in vivo Maus-Xenograft-Modelle verwendet werden, um die Unterschiede in der Wachstums- (Abbildung 4), Selbsterneuerung, Differenzierung und/oder Tumorinitiierungsfähigkeit von BCSCs in vivo im Vergleich zu Nicht-BCSCs oder Massenzellpopulationen zu verstehen. Häufig sind die in vitro beobachteten zellulären Reaktionen in Gegenwart exogener Faktoren oder therapeutischer Wirkstoffe nicht repräsentativ für die In-vivo-Umgebung, was darauf hindeutet, dass die In-vitro-Beobachtung durch In-vivo-Studien ergänzt werden sollte, wann immer dies möglich ist. Unter Verwendung von in vivo Xenograft-Modellen bleibt die zelluläre Heterogenität und Tumorarchitektur erhalten und somit können diese Modelle als System dienen, das die Mikroumgebung bei menschlichen Patienten genau nachahmt. Im lebenden Organismus LDA kann durchgeführt werden, um den Anteil tumorinitiierender Zellen in einer gegebenen gemischten Population von Krebszellen (BCSCs oder Nicht-BCSCs) zu bestimmen40,41. Der Bereich der verwendeten Zellverdünnungen sollte optimiert werden und hängt von der Häufigkeit der initiierenden Zellen in der interessierenden Zellpopulation ab. Idealerweise sollten diese Verdünnungen Dosen enthalten, die zu 100% Tumorbildung führen, bis hin zu Zelldosen ohne Tumorbildung und einem angemessenen Bereich dazwischen. Die Häufigkeit tumorinitiierender Zellen in Primärproben kann variabel sein, und in Fällen, in denen Brusttumoren eine sehr geringe Anzahl oder heterogene Populationen tumorinitiierender Zellen aufweisen, kann die Durchführung von LDA eine besondere Herausforderung darstellen42. In diesen Fällen wäre die Injektion einer größeren Anzahl von Zellen für das Verständnis der Brustkrebsbiologie besser geeignet.

Abbildung 4: In vivo Xenograft-Assays zur Beurteilung der BCSC-Funktion. MDA-MB-231-Brustkrebszellen wurden mittels FACS isoliert, wie in Abbildung 1 beschrieben, und in das rechte Brustfettpolster weiblicher NSG-Mäuse injiziert, wie in den Protokollabschnitten 9.1 bis 9.8 beschrieben (5 x 105 Zellen/Maus; 4 Mäuse/Zellpopulation). Die primäre Brusttumorwachstumskinetik wird für ALDHhiCD44+CD24- (■) versus ALDHniedrigeCD44niedrige/-CD24+ (□) Populationen gezeigt. Daten dargestellt als Mittelwert ± S.E.M. * = signifikant unterschiedliche Tumorgröße als entsprechende ALDHniedrigeCD44niedrige/- Untergruppen zum gleichen Zeitpunkt (P < 0,05). Diese Abbildung wurde von Croker et al.26 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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