Schnelle Bestimmung der Antikörper-Antigen-Affinität durch Massenphotometrie

Zusammenfassung

Wir beschreiben einen einmolekularen Ansatz für Antigen-Antikörper-Affinitätsmessungen mit Massenphotometrie (MP). Das MP-basierte Protokoll ist schnell, genau, verwendet eine sehr geringe Menge an Material und erfordert keine Proteinmodifikation.

Zusammenfassung

Messungen der Spezifität und Affinität von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen sind für medizinische und forschungsmedizinische Anwendungen von entscheidender Bedeutung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Implementierung einer neuen Einzelmolekültechnik, der Massenphotometrie (MP), zu diesem Zweck. MP ist eine etiketten- und immobilisierungsfreie Technik, die molekulare Massen und Populationen von Antikörpern und Antigen-Antikörper-Komplexen auf einer Einmolekülebene erkennt und quantifiziert. MP analysiert die Antigen-Antikörper-Probe innerhalb von Minuten, um die Bindungsaffinität präzise zu bestimmen und gleichzeitig Informationen über die Stoichiometrie und den oligomeren Zustand der Proteine bereitzustellen. Dies ist eine einfache und einfache Technik, die nur Picomol-Mengen an Protein und keine teuren Verbrauchsmaterialien erfordert. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um die Protein-Protein-Bindung für Proteine mit einer Molekularmasse von mehr als 50 kDa zu untersuchen. Bei multivalenten Proteinwechselwirkungen können die Affinitäten mehrerer Bindungsstellen in einer einzigen Messung ermittelt werden. Die einmolekulare Messart und die fehlende Etikettierung setzen jedoch einige experimentelle Einschränkungen mit sich. Diese Methode liefert die besten Ergebnisse, wenn sie auf Messungen von submikromolaren Wechselwirkungsaffinitäten, Antigenen mit einer Molekularmasse von 20 kDa oder größer und relativ reinen Proteinproben angewendet wird. Wir beschreiben auch das Verfahren zur Durchführung der erforderlichen Anpassungs- und Berechnungsschritte mit einer Basisdatenanalysesoftware.

Einleitung

Antikörper sind zu allgegenwärtigen Werkzeugen der Molekularbiologie geworden und werden sowohl in medizinischen als auch in Forschungsanwendungen ausgiebig eingesetzt. In der Medizin sind sie in der Diagnostik von entscheidender Bedeutung, aber auch ihre therapeutischen Anwendungen werden erweitert und neue Antikörper-basierte Therapien werden ständig entwickelt^1,2,3,4. Die wissenschaftlichen Anwendungen von Antikörpern umfassen viele unverzichtbare Labortechniken wie Immunfluoreszenz⁵, Immunpräzipitation

Protokoll

1. Bereiten Sie die Strömungskammern vor

1. Reinigen Sie die Glasabdeckungen
   1. Mit Waschflaschen mit destilliertem Wasser, Ethanol und Isopropanol die 24 mm x 50 mm Abdeckungen in folgender Reihenfolge abspülen: Wasser, Ethanol, Wasser, Isopropanol, Wasser. Trocknen Sie die Abdeckungen mit einem Strom von sauberem Stickstoff. Es ist wichtig, die Abdeckungen von oben nach unten zu spülen, die untere Ecke mit Soft-Tipp-Zange zu halten. Trocknen Sie den Deckelinrutsch in die gleiche Richtung, um eine Kontamination durch die Zange zu vermeiden (Abbildung 2A).
   2. Spülen Sie die 24 mm x 24 mm Abdeckungen mit destilliertem W....

Ergebnisse

Wir haben zuvor die Wechselwirkung von humanen α-Thrombin (HT) und Maus monoklonalen anti-humanen Thrombin-Antikörper (AHT) mit dem MP-basierten Assay¹¹untersucht. Da die Molekularmasse des HT (37 kDa) unter der 40 kDa-Nachweisgrenze liegt, kann die maximale Probenkonzentration die Konzentrationsbeschränkung von 50 nM MP überschreiten, ohne die Auflösung von Massenverteilungen negativ zu beeinflussen. Das Experiment war als Titrationsserie mit dem AHT-Antikörper mit einer festen Konzentration von .......

Diskussion

Das hier beschriebene Mass Photometry-basierte Protokoll bietet eine schnelle und genaue Methode zur Messung von Antigen-Antikörper-Bindungsaffinitäten. Die MP-Analyse verwendet eine sehr geringe Menge an Material, und zusätzliche Informationen – einschließlich Stoichiometrie, Oligomerisierung und Reinheit – können anhand derselben Daten ausgewertet werden (Abbildung 5). Ohne Modifikationen ist diese Methode auf die Messungen von Dissoziationskonstanten im Bereich von ca. 5 nM bis 500 nM und.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Erwerben Sie	Refeyn		MP Datenerfassungssoftware
Anti-Humanthrombin	Haematologic Technologies	AHT-5020	RRID: AB_2864302
Applikatoren mit Wattespitze	Thorlabs	CTA10	optische Wattestäbchen für die Reinigung von Linsen
Deckgläser 24x24 mm	Globe Scientific	1405-10
Deckgläser 24x50 mm	Fisher Scientific	12-544-EP
DiscoverMP	Refeyn		MP Datenverarbeitungssoftware
Pinzette	Elektronenmikroskopie Sciences	78080-CF	Pinzette mit weicher Spitze für die Handhabung von Deckgläsern für die Handhabung von Human
& Alpha;-Thrombin	Haematologic Technologies	HCT-0020
Immersionsöl	Thorlabs	MOIL-30
Isopropanol	Alfa Aesar	36644
Microsoft Excel	Microsoft		Tabellenkalkulation
OneMP	Refeyn		Massenphotometrie Instrument
Origin	OriginLab		wissenschaftliche Grafiksoftware
PBS	Corning	46-013-CM	10x Lager
Spritzenfilter	Millipore	SLGSR33SS	Puffer und Probe filternd