Der genetisch traktierbare Fadenwurm Caenorhabditis elegans kann als einfaches und kostengünstiges Modell für die Wirkstoffforschung verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Identifizierung von Krebsmedikamenten beschrieben, die die nachgeschaltete Signalübertragung von RAS- und EGFR-Proteinen hemmen.
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Methodenartikel
Identifizierung von EGFR- und RAS-Inhibitoren mittels Caenorhabditis elegans
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Veränderungen in der Plasmamembranlokalisierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und seines nachgeschalteten Effektors RAS wurden mit mehreren Krankheiten einschließlich Krebs in Verbindung gebracht. Der freilebende Fadenwurm C. elegans besitzt eine evolutionäre und funktionell konservierte EGFR-RAS-ERK MAP-Signalkaskade, die für die Entwicklung der Vulva zentral ist. Der Gewinn von Funktionsmutationen im RAS-Homolog LET-60 und EGFR-Homolog LET-23 induziert die Erzeugung von sichtbaren nicht-funktionellen ektopischen Pseudovulva entlang der ventralen Körperwand dieser Würmer. Bisher wurde gezeigt, dass der multivulvale (Muv) Phänotyp in diesen Würmern durch kleine chemische Moleküle gehemmt wird. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung des Wurms in einem flüssigkeitsbasierten Assay, um Inhibitoren zu identifizieren, die die Aktivitäten von EGFR- und RAS-Proteinen aufheben. Mit diesem Assay zeigen wir, dass R-Fendalin, ein indirekter Inhibitor von K-RAS, den Muv-Phänotyp unterdrückt, der in den mutierten Würmern let-60(n1046) und let-23(sa62) exprimiert wird. Der Assay ist einfach, kostengünstig, nicht zeitaufwendig einzurichten und kann als erste Plattform für die Entdeckung von Krebstherapeutika verwendet werden.
Einleitung
Die zellulären Wege, die Entwicklungsereignisse innerhalb von Organismen regulieren, sind bei allen Metazoen hoch konserviert. Ein solcher Signalweg ist die EGFR-RAS-ERK-Signalkaskade (MITOGEN Activated Protein Kinase( MAPK), die ein kritischer Signalweg ist, der die Zellproliferation, Differenzierung, Migration und das Überleben steuert1,2. Defekte in diesem Signalweg können zu pathologischen oder Krankheitszuständen wie Krebs führen. Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) hat sich in menschlichen Tumoren, einschließlich 50% der oralen Plattenepithelkarzinome, als hoch exprimiert erwiesen und trägt zur....
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Protokoll
1. Nematodenwachstumsmedium (NGM) Plattenvorbereitung
- 2,5 g Pepton und 3 g NaCl werden zu 970 ml entionisiertem Wasser in einem 2-L-Erlenmeyerkolben hinzugefügt. Inhalt mit einem magnetischen Rührstab umrühren. Danach 20 g Agar in den Kolben geben. Autoklavieren Sie den Inhalt des Kolbens bei 121 °C und einem Druck von 15 lb/in2 für 30 min. Nach der Sterilisation den Kolben auf eine Rührplatte legen und das Medium abkühlen lassen, bis die Temperatur 50 °C erreicht.
- Zur Herstellung der NGM-Platten werden dem abgekühlten Medium folgende Reagenzien zugesetzt: 25 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH = 6,0), 1 ml 1 MMgSO4,1 ml 1 MC....
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Ergebnisse
Wir zeigen zunächst, dass R-Fendilin in der Lage ist, den Muv-Phänotyp im let-60(n1046)-Mutantenstamm im Vergleich zu den DMSO-behandelten Würmern zu unterdrücken. Unsere Daten zeigen, dass R-Fendilin in der Lage ist, den Muv-Phänotyp im let-60(n1046) dosisabhängig zu blockieren (Abbildung 2A,B). Eine Nichtumkehr des Muv-Phänotyps wurde jedoch im lin-1-Nullmutantenstamm als Reaktion auf steigende Konzentrationen von R-Fendilin beobachtet
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Diskussion
Die Assays, die wir mit dem Wurm beschreiben, sind einfach und kostengünstig, um Inhibitoren der EGFR- und RAS-Funktion zu identifizieren. C. elegans ist ein attraktives Modell für die Wirkstoffforschung, da es aufgrund des kurzen Lebenszyklus (3 Tage bei 20 °C) und der Fähigkeit, eine große Anzahl von Larven zu erzeugen, leicht im Labor zu züchten ist. Noch wichtiger ist, dass der EGFR-RAS-ERK-MAPK-Signalweg evolutionär und funktionell konserviert wird, wobei Säugetiere ein genetisch handhabbares System zur Ana.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Danksagungen
Wir danken Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) für die Bereitstellung der let-60 (n1046). Wir danken auch Dr. David Reiner (Texas A & M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology in Houston) für den Lin-1-Stamm. Schließlich danken wir Dr. Danielle Garsin und ihrem Labor (The University of Texas, McGovern Medical School) für die Bereitstellung einiger der Reagenzien. Einige Wurmstämme wurden vom CGC zur Verfügung gestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Diese Forschung wurde durch das Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) Stipendium RP200047 an JF Hanc....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Medien und Chemie | |||
| Agarose | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto Pepton | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Bouillon | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Calciumchlorid | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Cholesterin | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| Magnesiumsulfat | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | ||
| Kaliumphosphat zweibasig | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Kalium pPhosphat monobasisch | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-Fendilin | kommerziell synthetisiert (pharmazeutische Qualität) | ||
| Natriumazid | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| Natriumchlorid | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Natriumhydroxid | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8,25 % Natriumhypochlorit | Bleichmittel | ||
| Natriumphosphat dibasisch | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycinsulfat | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−)-Tetramisol | Hydrochlorid Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126 (MEK-Inhibitor) | Millipore Sigma | 19-147 | |
| Verbrauchsmaterialien | |||
| 15 ml konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen 50 ml | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol 10 ml | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Serologische Einwegpipetten aus Polystyrol 25 ml | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Nr. 1,5 mm x 18 mm Deckgläser | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petrischalen mit durchsichtigem Deckel (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petrischalen mit durchsichtigem Deckel (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Mikroskopische Objektträger aus Glas (75 x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12-Well-Gewebekulturplatten | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bakterienstämme | |||
| E. coli OP50 | |||
| Wurmstämme | |||
| Stamm | Genotyp | Transgene | Source |
| MT2124 | let-60(n1046) IV. | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
Referenzen
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H.
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Nachdrucke und Genehmigungen
