Methodenartikel

Trägergestützte Ein-Topf-Probenvorbereitung für die gezielte Proteomik-Analyse kleiner Mengen menschlicher Zellen

DOI:

10.3791/61797

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6. November 2020

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1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2NHC Key Laboratory of Cancer Proteomics, Department of Oncology, Xiangya Hospital, Central South University, 3Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 4Department of Critical Care Medicine, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Eine proteinträgergestützte Eintopf-Probenvorbereitung in Verbindung mit der Flüssigchromatographie (LC) - Selected Reaction Monitoring (SRM) - wird als cLC-SRM bezeichnet und ist eine praktische Methode für die gezielte Multiplex-Proteomik-Analyse einer kleinen Anzahl von Zellen, einschließlich einzelner Zellen. Es profitiert von der Verwendung von überschüssigem exogenem Protein als Träger und hochspezifischem LC-SRM für eine gezielte Quantifizierung.

Zusammenfassung

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Die Proteinanalyse einer kleinen Anzahl menschlicher Zellen wird in erster Linie durch gezielte Proteomik mit Antikörper-basierten Immunoassays erreicht, die inhärente Einschränkungen aufweisen (z. B. geringes Multiplex und Nichtverfügbarkeit von Antikörpern für neue Proteine). Die auf Massenspektrometrie (MS) basierende zielgerichtete Proteomik hat sich als Alternative herausgestellt, da sie antikörperfrei ist, ein hohes Multiplex aufweist und eine hohe Spezifität und Quantifizierungsgenauigkeit aufweist. Jüngste Fortschritte in der MS-Instrumentierung ermöglichen die MS-basierte zielgerichtete Proteomik für die Multiplex-Quantifizierung von Proteinen mit hoher Häufigkeit in einzelnen Zellen. Es gibt jedoch eine technische Herausforderung für die effektive Verarbeitung einzelner Zellen mit minimalem Probenverlust für die MS-Analyse. Um dieses Problem zu lösen, haben wir kürzlich eine praktische proteinträgergestützte Eintopf-Probenvorbereitung in Verbindung mit der Flüssigchromatographie (LC) entwickelt - ausgewähltes Reaktionsmonitoring (SRM), genannt cLC-SRM für die gezielte Proteomik-Analyse kleiner Mengen menschlicher Zellen. Diese Methode nutzt die Verwendung des kombinierten exogenen Proteins als Träger und die Eintopfverarbeitung mit geringem Volumen, um die Adsorptionsverluste an der Oberfläche stark zu reduzieren, sowie LC-SRM mit hoher Spezifität, um den erhöhten dynamischen Konzentrationsbereich aufgrund der Zugabe von exogenem Trägerprotein effektiv zu adressieren. Seine Nützlichkeit wurde durch die genaue Quantifizierung der meisten mäßig häufigen Proteine in einer kleinen Anzahl von Zellen (z. B. 10-100 Zellen) und von sehr häufigen Proteinen in einzelnen Zellen nachgewiesen. Die einfach zu implementierenden Funktionen und die Tatsache, dass keine speziellen Geräte erforderlich sind, machen diese Methode für die meisten Proteomik-Labore leicht zugänglich. In diesem Dokument haben wir ein detailliertes Protokoll für die cLC-SRM-Analyse einer kleinen Anzahl menschlicher Zellen bereitgestellt, einschließlich Zellsortierung, Zelllyse und -verdauung, LC-SRM-Analyse und Datenanalyse. Weitere Verbesserungen der Nachweisempfindlichkeit und des Probendurchsatzes sind für eine gezielte Einzelzell-Proteomik-Analyse erforderlich. Wir gehen davon aus, dass cLC-SRM in der biomedizinischen Forschung und Systembiologie breit eingesetzt wird, mit dem Potenzial, die Präzisionsmedizin zu erleichtern.

Einleitung

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Jüngste technologische Fortschritte in der Genomik (Transkriptomik) ermöglichen eine umfassende und präzise Analyse des Genoms (Transkriptom) in einzelnen Zellen 1,2,3. Die Einzelzell-Proteomik-Technologien hinken jedoch weit hinterher, sind aber genauso wichtig wie die Genomik (Transkriptomik) 4,5,6,7,8. Darüber hinaus kann die Proteinhäufigkeit nicht unbedingt aus der mRNA-Häufigkeitabgeleitet werden 9, und das Proteom ist komplexer und dynamischer als das Transkriptom10. Angesichts dieser Herausforderungen wird im Allgemeinen eine große Anzahl von gemischten Zellpopulationen (d. h. Volumenzellen) verwendet, um umfassende Proteomdaten zu generieren 11,12,13. Solche Massenmessungen mitteln jedoch stochastische Variationen einzelner Zellen aus und verschleiern so die wichtige Variabilität von Zelle zu Zelle (d. h. Zellheterogenität)4,14. Die Einschränkungen solcher Massenmessungen werden noch gravierender, wenn die interessierenden Zellen nur einen kleinen Teil der Gesamtpopulationen von Zellen ausmachen (z. B. Krebsstammzellen in Tumoren in einem Krebsstadium im Frühstadium). Daher besteht eine große Wissenslücke zwischen der Einzelzellproteomik und der Genomik (Transkriptomik).

Antikörper-basierte Immunoassays (z. B. Durchfluss- oder Massenzytometrie) werden überwiegend für die gezielte proteomische Analyse einzelner Zellen eingesetzt 6,7,15,16,17,18. Sie leiden jedoch unter einer geringen Multiplexi, einer begrenzten Spezifität und der Nichtverfügbarkeit von Antikörpern für neue Proteine von Interesse. Die auf Massenspektrometrie (MS) basierende zielgerichtete Proteomik hat sich als Alternative für die genaue Proteinquantifizierung erwiesen, da sie antikörperfrei, hoch ≥150 Proteine in einer einzigen Analyse19), hohe Quantifizierungsgenauigkeit (absolute Mengen oder Konzentrationen) und hohe Spezifität und Reproduzierbarkeit (≤10 % CV) ist20,21,22,23. Jüngste bedeutende Fortschritte in der Probenvorbereitung haben die MS-basierte Einzelzellproteomik für die quantitative Analyse von sehr häufig vorkommenden Proteinen aus einzelnen menschlichen Zellen ermöglicht. Die MS-basierte Einzelzellproteomik steckt jedoch noch in den Kinderschuhen. Zum Beispiel kann die fortschrittlichste MS-Plattform in Verbindung mit ultraniedrigen RPLC-Flussraten nur den markierungsfreien MS-Nachweis und die Quantifizierung von ~670-870 Proteinen von insgesamt ≥12.000 Proteinen in einzelnen HeLa-Zellen ermöglichen24,25.

Derzeit stehen sechs MS-basierte Einzelzell-Proteomik-Ansätze für die Analyse einzelner Säugetierzellen zur Verfügung, von denen vier für die globale Proteomik vorgesehen sind (nanoPOTS: nanowell-based Preparation in One pot for Trace Samples26; iPAD-1: integriertes Proteomanalysegerät für die Einzelzellanalyse27; OAD (Öl-Luft-Tröpfchen) Chip-basierte Einzelzell-Proteomanalyse28; SCoPE-MS: Einzelzellproteomik mittels Massenspektrometrie29) und die beiden anderen dienen der gezielten Proteomik (cLC-SRM: Carrier-Assisted Liquid Chromatography (LC) - Selected Reaction Monitoring (SRM)30; cPRISM-SRM: Carrier-Assisted High Pressure High-Resolution Separations mit intelligenter Selektion und Multiplexing gekoppelt an SRM31). Alle diese Ansätze haben jedoch technische Nachteile. nanoPOTS, iPAD-1 und OAD reduzieren das Probenverarbeitungsvolumen auf 2-200 nL und sind nicht für breite Tischanwendungen geeignet 26,27,28. Bei SCoPE-MS wird nach der Einzelzellverarbeitung ein TMT-Träger (Tandem Mass Tag) hinzugefügt, so dass er Oberflächenadsorptionsverluste während der Probenverarbeitung nicht wirksam verhindern kann, wenn ein einzelnes Röhrchen für die Einzelzellverarbeitungverwendet wird 29, was zu einer geringen Reproduzierbarkeit mit einem Korrelationskoeffizienten von nur ~0,2-0,4 zwischen den Replikaten32 führt. Für cLC-SRM und cPRISM-SRM ist die Verwendung exogener Proteine als Träger für die gezielte Proteomik besser geeignet, da Peptide aus überschüssigen exogenen Proteinen häufig durch MS/MS sequenziert werden, was die Wahrscheinlichkeit für die Sequenzierung von endogenen Peptiden mit geringer Häufigkeit stark verringert30,31. Im Gegensatz zur globalen Proteomik zur relativen Quantifizierung können die beiden gezielten Proteomik-Ansätze eine genaue oder absolute Proteinanalyse einer kleinen Anzahl von Zellen mit hoher Reproduzierbarkeit unter Verwendung von mit schweren Isotopen markierten internen Standards bei bekannten Konzentrationen ermöglichen. Im Vergleich zu cPRISM-SRM, das eine vorherige hochauflösende PRISM-Fraktionierung erfordert, was dazu führt, dass viele Fraktionsproben analysiert werden müssen, hat cLC-SRM einen signifikanten Vorteil beim Probendurchsatz ohne Fraktionierung und kann gleichzeitig Hunderte von Proteinen in einer einzigen Analyse quantifizieren, jedoch mit relativ geringerer Nachweisempfindlichkeit30. Daher ist cLC-SRM leichter zugänglich und sollte über breitere Einsatzmöglichkeiten für die genaue Multiplex-Proteinanalyse kleiner Zellzahlen sowie massenbegrenzter Proben verfügen.

Darin beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Durchführung von cLC-SRM für eine bequeme gezielte Proteomik-Analyse einer kleinen Anzahl menschlicher Zellen, einschließlich einzelner Zellen. Das Protokoll besteht aus den folgenden Hauptschritten: Zellsortierung durch FACS (fluoreszenzaktivierte Zellsortierung), Zelllyse und -verdau in PCR-Röhrchen mit geringem Volumen, LC-SRM-Datenerfassung und SRM-Datenanalyse mit öffentlich verfügbarer Skyline-Software (Abbildung 1). Sein breiter Nutzen wurde zusammen mit unseren bereits gut etablierten SRM-Assays durch die absolute gezielte Quantifizierung von EGFR/MAPK-Signalwegproteinen in 1-100 MCF7- oder MCF10A-Zellen und die Bestimmung von Signalwegproteinkopien pro Zelle bei einem breiten dynamischen Konzentrationsbereich nachgewiesen30. Wir gehen davon aus, dass die meisten Proteomik-Forscher mit dem detaillierten Protokoll cLC-SRM problemlos in ihren Laboren für die genaue Proteinanalyse ultrakleiner Proben (z. B. seltener Tumorzellen) implementieren können, um ihre Projektanforderungen zu erfüllen.

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Abbildung 1: Überblick über alle Schritte der cLC-SRM (computergestützte Eintopf-Probenvorbereitung gekoppelt mit einer molekularen Schmelze der HROMATOGRAPHIE - sgewählte Mechanismus der Interventionsmessung). Nichtmenschliche Zelllysatverdaue (z. B. Shewanella oneidensis) werden zur Vorbehandlung von PCR-Röhrchen für die Beschichtung der Röhrchenoberfläche verwendet. Eine kleine Anzahl menschlicher Zellen oder einzelner Zellen, die nach FACS sortiert sind, werden in vorbehandelte PCR-Röhrchen gesammelt. BSA-Proteinträger (oder nicht-humane Zelllysat-Proteome), schwere interne Standards (IS) und TFE (oder DDM) werden nacheinander in Probenröhrchen gegeben, um die Zelllyse zu erleichtern und die Adsorptionsverluste an der Oberfläche zu reduzieren. Konzeptionell wird der kombinierte DDM- und nicht-humane Zelllysat-Proteomträger gut für cLC-SRM funktionieren. Die Zelllyse erfolgt durch Beschallung, und die Denaturierung des Proteins wird durch Erhitzen bei hoher Temperatur erreicht. DTT- und IAA-Reagenzien werden für die Reduktion bzw. Alkylierung verwendet (dieser Schritt ist optional). Trypsin wird für die Verdauung mit einem viel höheren Verhältnis von Trypsin zur Proteinmenge hinzugefügt als bei der Standard-Trypsinverdauung. Die Kappe des Probenröhrchens wird entfernt und dann wird das PCR-Röhrchen für die direkte LC-SRM-Analyse in das LC-Fläschchen eingeführt. Die gesammelten SRM-Daten werden mit Hilfe der öffentlich zugänglichen Skyline-Software analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protokoll

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HINWEIS: Die Schritt-für-Schritt-Analyse des cLC-SRM ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Vorbehandlung von PCR-Röhrchen

  1. Geben Sie 100 μl nichtmenschliche (z. B. Shewanella oneidensis) Zelllysatverdaue in einer Menge von 0,2 μg/μl in PCR-Röhrchen. Über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren, um die Oberfläche des PCR-Röhrchens zu beschichten.
  2. Entfernen Sie die Zelllysatverdaue durch Pipettieren, spülen Sie die PCR-Röhrchen 3 Mal mit Wasser in HPLC-Qualität und trocknen Sie die PCR-Röhrchen dann in einem Abzug.
  3. Bewahren Sie beschichtete PCR-Röhrchen bis zur weiteren Verwendung in einem 4 °C-Gefrierschrank auf.

2. FACS-Sortierung

  1. Richten Sie einen fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) (siehe Materialtabelle) in eine 96-Well-PCR-Platte aus, indem Sie fluoreszierende Kügelchen mit Farbstoffen verwenden, die von der Laserquelle angeregt werden können, um zuverlässige Referenzsignale zu liefern.
  2. Stellen Sie sicher, dass die FACS-Maschine gut auf das Sortieren von Zellen in den Boden von PCR-Platten ausgerichtet ist.
    1. Stellen Sie den Winkel des Sortierstroms auf das Minimum ein, um die Erfolgsrate zu maximieren, dass die Zellen in die Böden der Vertiefungen sortiert werden, anstatt auf die Seiten zu treffen.
    2. Um die Maschine zu zielen, verwenden Sie den Teststrom, um Tröpfchen des PBS-Puffers (z. B. 100 Tröpfchen) auf die Vertiefung einer leeren Platte zu "sortieren", um sicherzustellen, dass sich die gesammelten Tröpfchen auf dem Boden befinden. Wenn die Tröpfchen nicht in der richtigen Position landen, kalibrieren Sie den Zellsortierer neu und wiederholen Sie den Vorgang, bis die Tröpfchen im Sortierstrom korrekt aufgefangen wurden.
  3. Legen Sie die beschichteten PCR-Röhrchen in ein 96-Well-PCR-Röhrchengestell.
  4. Sortieren Sie die gewünschte Anzahl menschlicher Brustzellen (MCF7 oder MCF10A) in vorbeschichtete PCR-Röhrchen.
  5. Zentrifugieren Sie die sortierten Brustzellen sofort bei 100 x g für 10 min bei 4 °C, um sie am Boden des Röhrchens zu halten und einen möglichen Zellverlust zu vermeiden.
  6. Lagern Sie die sortierten Zellen bis zur weiteren Analyse in einem -80 °C-Gefrierschrank.

3. Zugabe von Proteinträgern, schweren internen Standards und TFE

  1. Geben Sie 4 μl 25 mM NH4HCO3 in PCR-Röhrchen mit gesammelten Zellen.
  2. 1 μl 10 ng/μl Rinderserumalbumin (BSA) in 25 mM NH4HCO3 in Probenröhrchen geben.
  3. Geben Sie 0,3 μl 100 fmol/μl rohe schwere Peptidstandards (insgesamt 30 fmol) in Probenröhrchen.
    HINWEIS: Aliquots von rohen schweren Peptidstandards für Proteine des EGFR/MAPK-Signalwegs werden in einer nominalen Konzentration von 100 fmol/μl in 25 mM NH4HCO3 hergestellt. Geben Sie das kleine Volumen der rohen schweren Peptidstandards in 100 fmol/μl in die Mitte der Lösung und stellen Sie sicher, dass sich keine Flüssigkeitsreste in der Pipettenspitze befinden.
  4. 9 μl 100 % TFE in Probenröhrchen mit einer Endkonzentration von ~60 % TFE geben.
  5. Zentrifugieren Sie 5 min lang bei 1500 x g und wirbeln Sie dann 3 min lang vorsichtig bei 100 x g vortexen.

4. Zelllyse und Proteindenaturierung

  1. Beschallung von FACS-sortierten Brustzellen auf Eis für 1 min mit 1-min-Intervallen für insgesamt 5 Zyklen bei einer Amplitude von 70 % und 0,5 Hz.
  2. Inkubieren Sie die Proben 1 h lang bei 90 °C für die Proteindenaturierung mit einem PCR-Thermocycler mit der Option mit beheiztem Deckel.
    HINWEIS: TFE ist ein flüchtiges Lösungsmittel mit einem Siedepunkt von 74 °C, daher wird die Option mit beheiztem Deckel gewählt, um eine vollständige Trocknung mit erheblichem Probenverlust zu vermeiden.
  3. Kühlen Sie die Proben mit einer Zentrifugation bei 1500 x g für 3 Minuten auf Raumtemperatur ab.

5. Reduktion und Alkylierung (fakultativ)

  1. 0,6 μl 50 mM DTT für eine Endkonzentration von 2 mM zugeben.
    HINWEIS: Die DVB-T-Lösung muss jedes Mal frisch zubereitet werden. 77,5 mg DTT wiegen und dann in 1 mL 25 mM NH4HCO3 auflösen, um 500 mM DTT herzustellen. 10 μl 500 mM DTT werden dann in 90 μl 25 mM NH4HCO3 gegeben, um 50 mM DTT herzustellen.
  2. 5 min bei 1500 x g zentrifugieren und dann 3 min bei 850 U/min schonend mischen.
  3. Inkubieren Sie 1 h lang bei 56°C und schütteln Sie es leicht bei 100 x g.
  4. Kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur ab und zentrifugieren Sie sie 3 Minuten lang bei 1500 x g .
  5. Geben Sie 0,5 μl 60 mM IAA mit einer Endkonzentration von ~2 mM in das RT-PCR-Röhrchen.
    HINWEIS: Die IAA-Lösung muss jedes Mal frisch zubereitet werden. Wiegen Sie 74,3 mg IAA und lösen Sie es dann in 1 ml 25 mM NH4HCO3 auf, um 400 mM IAA zu erhalten. 15 μl 400 mM IAA werden in 85 μl 25 mM NH4HCO3 gegeben, um 60 mM IAA zu erhalten.
  6. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 30 min unter leichtem Schütteln bei 100 x g inkubieren.
    HINWEIS: Die Reduktions- und Alkylierungsschritte sind optional, wenn keine Cystein-haltigen Peptide als Zielproteine ausgewählt wurden.

6. Trypsin-Verdauung

  1. Reduzieren Sie das Probenvolumen mit einem SpeedVac-Konzentrator auf ~4 μl.
    HINWEIS: TFE ist ein flüchtiges Lösungsmittel mit einem Siedepunkt von 74 °C. Ein hoher TFE-Anteil hemmt die Trypsinverdauung.
  2. 9 μl 25 mM NH4HCO3 und 1-3 μl 15 ng/μl Trypsin zum Aufschluss mit der endgültigen Trypsinkonzentration von 1-3 ng/μl zugeben.
    HINWEIS: Bei 10 FACS-sortierten menschlichen Brustzellen (~1 ng) beträgt das Verhältnis von Trypsin-Enzym zu Protein ≥15:1, 750-mal höher als bei der Standard-Trypsin-Verdauung (das Verhältnis von 1:50).
  3. Vorsichtig bei 100 x g für 3 min mischen und über Nacht (~16 Stunden) bei 37 °C inkubieren.
  4. Fügen Sie 0,5 μl 5%ige Ameisensäure hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.
  5. 1 h bei 1500 x g zentrifugieren.
  6. Bis zur weiteren LC-SRM-Analyse im -80 °C-Gefrierschrank oder zur sofortigen Analyse in einem 4 °C-Gefrierschrank lagern.

7. Vorbereitung für die direkte LC-SRM-Analyse

  1. Entfernen Sie die Kappe des PCR-Röhrchens, das für die Entnahme (Schritt 2) und Verarbeitung (Schritt 6) von FACS-sortierten Brustzellen verwendet wurde.
  2. Führen Sie das PCR-Röhrchen in das LC-Fläschchen ein.
  3. Verschließen Sie das LC-Fläschchen für die LC-SRM-Analyse.
    HINWEIS: Bei kleinen Mengen von Zellen, die in einer 96-Well-PCR-Platte verarbeitet werden, wird die Mattenabdeckung hinzugefügt, um die Platte für die direkte LC-SRM-Analyse abzudichten.

8. LC-SRM-Analyse

  1. Analysieren Sie Proben mit UPLC, das mit einem Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer gekoppelt ist.
  2. Verbinden Sie Kapillar-C18-Säulen (75 μm i.d. × 20 cm für Standardgradienten und 100 μm i.d. × 10 cm für kurzen Gradienten) über eine rostfreie Metallverbindung mit einem chemisch geätzten Elektrospray-Emitter aus Quarzglas mit einem Innendurchmesser von 20 μm.
  3. Verwenden Sie eine 20-μl-Probenschleife, um die gesamte Probe (insgesamt ~15 μl) direkt in die LC-Säule zu laden, um die Detektionsempfindlichkeit zu maximieren.
  4. Verwenden Sie 0,1 % Ameisensäure in Wasser und 0,1 % Ameisensäure in 90 % Acetonitril als mobile Phasen A und B für die Kapillar-RPLC-Trennung.
  5. Verwenden Sie den binären LC-Gradienten bei Flussraten von 300 nL/min für einen Standardgradienten, wenn eine große Anzahl von Zielproteinen (>10) gemessen wird. Standardgradient: 5-20 % B in 26 min, 20-25 % B in 10 min, 25-40 % B in 8 min, 40-95 % B in 1 min und bei 95 % B für 7 min für insgesamt 52 min, und die analytische Säule wurde 8 min lang bei 99,5 % A wieder äquilibriert.
  6. Verwenden Sie den binären LC-Gradienten bei Flussraten von 400 nL/min für einen kurzen Gradienten, wenn eine kleine Anzahl von Zielproteinen (≤10) gemessen wird. Kurzer Gradient für eine schnelle Trennung: 5-95 % B in 5 min und die analytische Säule wurde 5 Minuten lang bei 99,5 % A mit einer Gesamtlaufzeit von 10 Minuten LC wieder ausgeglichen.
  7. Betreiben Sie das QQQ-Massenspektrometer mit Ionensprühspannungen von 2.400 ± 100 V, einer Kapillar-Offset-Spannung von 35 V, einer Skimmer-Offset-Spannung von -5 V und einer Kapillareintrittstemperatur von 220° C.
  8. Beziehen Sie die anderen QQQ MS-Parameter ohne weitere Optimierung aus der automatischen Abstimmung und Kalibrierung.
  9. Spike unterschiedliche Konzentrationen von rohen schweren Peptidstandards in 20-50 ng/μl nichtmenschlicher Zelllysatverdaue vor der LC-SRM-Analyse von Proben, um die Peptid-LC-Retentionszeit (RT) für den Aufbau einer geplanten SRM-Methode und potenzielle Interferenzübergänge für eine genaue Quantifizierung zu bestimmen.
  10. Verwenden Sie den RT Scheduled SRM-Modus für die Multiplex-Quantifizierung mit einem Scan-Fenster von ≥6 Minuten.
    HINWEIS: Das Scan-Fenster wird entsprechend angepasst, abhängig von der Anzahl der Übergänge in einem bestimmten Zeitfenster.
  11. Stellen Sie die Gesamtzykluszeit auf 1 s ein, und die Verweilzeit für jeden Übergang wird automatisch angepasst, abhängig von der Anzahl der Übergänge, die in verschiedenen Retentionszeitfenstern gescannt wurden. Für jeden SRM-Übergang wird eine minimale Verweilzeit von 10 ms benötigt. Alle Zielproteine können gleichzeitig in einer einzigen LC-SRM-Analyse überwacht werden

9. Datenanalyse

  1. Importieren von Rohdatendateien in die öffentlich zugängliche Skyline-Software33 zur Datenvisualisierung jedes Zielpeptids zur Bestimmung ihrer Nachweisbarkeit.
  2. Verwenden Sie zwei Kriterien, um die Erkennung und Integration von SRM-Peaks zu bestimmen: 1) gleiche LC-Retentionszeit; 2) ungefähr die gleichen relativen SRM-Peakintensitätsverhältnisse über mehrere Übergänge zwischen endogenen (leichten) Peptiden und ihren entsprechenden (schweren) isotopenmarkierten Peptid-internen Standards.
  3. Überprüfen Sie alle SRM-Daten manuell, um die korrekte SRM-Peakzuordnung und SRM-Peakgrenze für eine zuverlässige Quantifizierung anhand der beiden oben genannten Kriterien sicherzustellen.
  4. Verwenden Sie den besten Übergang mit einem hohen SRM-Signal, aber ohne Matrixinterferenz für die Proteinquantifizierung, und verwenden Sie die anderen Übergänge als Referenz.
  5. Verwenden Sie mehrere Replikate, um die Standardabweichung (SD) und den Variationskoeffizienten (CV) zu erhalten.
  6. Berechnen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) anhand der Spitzenintensität des Spitzenwerts über dem durchschnittlichen Hintergrundrauschen innerhalb eines Retentionszeitbereichs von ±15 s für den Standardgradienten und ±6 s für den kurzen Gradienten. Die Nachweisgrenze (LOD) und die Bestimmungsgrenze (LOQ) sind definiert als die niedrigsten Konzentrationspunkte, bei denen das S/N-Verhältnis mindestens 3 bzw. 7 beträgt.
  7. Wenden Sie neben S/N ≥7 noch ein weiteres Kriterium für die konservative Bestimmung der LOQ-Werte an: Die Surrogatpeptidantwort gegen verschiedene Zellzahlen muss innerhalb des linearen dynamischen Bereichs liegen.
  8. Verwenden Sie die Excel-Software, um alle Kalibrierkurven zu zeichnen. Laden Sie die RAW-Daten von QQQ MS in die öffentlich zugängliche Skyline-Software, um Diagramme von extrahierten Ionenchromatogrammen (XICs) mehrerer überwachter Übergänge von Zielproteinen anzuzeigen.

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Ergebnisse

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Kleine Mengen an MCF7-Zelllysaten (0,5-20 ng äquivalent zu 5-200 Zellen) wurden zunächst verwendet, um die Leistung von cLC-SRM durch gezielte Quantifizierung von Proteinen des EGFR/MAPK-Signalwegs zu bewerten, da sie im Vergleich zu kleinen Mengen von Zellen, die nach FACS sortiert wurden, einheitlicher sind und weniger variieren. Wie in Abbildung 2A gezeigt, zeigt XICs deutlich die Detektion von SRM-Übergängen für ATADDELSFK, abgeleitet von GRB2, die bei ~2...

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Diskussion

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cLC-SRM ist eine praktische zielgerichtete Proteomik-Methode, die eine genaue Multiplex-Proteinanalyse einer kleinen Anzahl von Zellen, einschließlich einzelner Zellen, ermöglicht. Diese Methode nutzt die Vorteile der proteinträgergestützten Eintopf-Probenvorbereitung, bei der alle Schritte, einschließlich der Zellentnahme, der mehrstufigen Zelllyse und des Zellverdaus sowie des Transfers der Peptidverdaue in eine Kapillar-LC-Säule für die MS-Analyse, in einem Topf (z. B. Einzelröhrchen ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von NIH Grant R21CA223715 (TS) und UG3CA256967 (TS und HL) unterstützt. Die hierin beschriebenen experimentellen Arbeiten wurden im Environmental Molecular Sciences Laboratory des Pacific Northwest National Laboratory durchgeführt, einer nationalen wissenschaftlichen Nutzereinrichtung, die vom Energieministerium der Vereinigten Staaten von Amerika unter dem Vertrag DE-AC05-76RL0 1830 gesponsert wird.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2 mL LC-Fläschchen aus GlasMicrosolv 9502S-WCVGefäß zur Aufnahme des PCR-Röhrchens für die Autosample-Injektion
BSASigma-AldrichP0834-10 & mal; 1 mlTrägerprotein zur starken Reduzierung von Oberflächenadsorptionsverlusten
DTTThermo ScientificA39255Reagenz zur Reduktion
AmeisensäureThermo Scientific28905Reagenz zum Stoppen der Enzymreaktion
IAAThermo ScientificA39271Reagenz zur Alkylierung
Peptidinterne StandardsNeuengland PeptidGezielte Quantifizierung von EGFR/MAPK-Signalwegproteinen
RT-PCR-Röhrchen GeneMate BioexpressT-3035-10,2 mL PCR-Röhrchen für die Probenvorbereitung in einem Topf
Skyline softwareUniversity of WashingtonÖffentlich verfügbar für SRM-Datenanalyse
UltraschallgerätHielscher UltraschalltechnologieUTR200Beschallung auf Eis für die Zelllyse
Speed Vac KonzentratorThermo ScientificReduzierung des TFE-Anteils für einen effektiven Trypsinaufschluss
TFESigma-Aldrich18370-10&fach; 1mL60% TFE für die Zelllyse
Thermocycler mit beheiztem DeckelPeltier Thermocycler  PTC-200Heizung für die Proteindenaturierung
Trypsin GoldPromegaV528AEnzym für die Proteinverdauung
Waters BEH C18-SäuleWatersC18-Säule für die Peptidtrennung

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  2. Miyamoto, D. T., et al. RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).
  3. Wang, Y., Navin, N. E. Advances and applications of single-cell sequencing technologies. Molecular Cell. 58 (4), 598-609 (2015).
  4. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  5. Gavasso, S., Gullaksen, S. E., Skavland, J., Gjertsen, B. T. Single-cell proteomics: potential implications for cancer diagnostics. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (5), 579-589 (2016).
  6. Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 83-88 (2012).
  7. Hughes, A. J., et al. Single-cell western blotting. Nature Methods. 11 (7), 749-755 (2014).
  8. Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
  9. Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
  10. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (6), 427-439 (2010).
  11. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  12. Zhang, H., et al. Integrated Proteogenomic Characterization of Human High-Grade Serous Ovarian Cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
  13. Zhang, B., et al. Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 513 (7518), 382-387 (2014).
  14. Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining Signaling Pathways with an Expanding Single-Cell Toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
  15. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  16. Di Palma, S., Bodenmiller, B. Unraveling cell populations in tumors by single-cell mass cytometry. Current Opinion in Biotechnology. 31, 122-129 (2015).
  17. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 8 Unit 8 11-20 (2012).
  18. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Current Opinion in Biotechnology. 24 (4), 745-751 (2013).
  19. Lee, J. Y., et al. Detection of Head and Neck Cancer Based on Longitudinal Changes in Serum Protein Abundance. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 29 (8), 1665-1672 (2020).
  20. Shi, T., et al. Advancing the sensitivity of selected reaction monitoring-based targeted quantitative proteomics. Proteomics. 12 (8), 1074-1092 (2012).
  21. Shi, T., et al. Advances in targeted proteomics and applications to biomedical research. Proteomics. 16 (15-16), 2160-2182 (2016).
  22. Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Molecular Systems Biology. 4, 222(2008).
  23. Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. 9 (6), 555-566 (2012).
  24. Zhu, Y., et al. Proteomic Analysis of Single Mammalian Cells Enabled by Microfluidic Nanodroplet Sample Preparation and Ultrasensitive NanoLC-MS. Angewandte Chemie International Edition. 57 (38), 12370-12374 (2018).
  25. Cong, Y., et al. Improved Single-Cell Proteome Coverage Using Narrow-Bore Packed NanoLC Columns and Ultrasensitive Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (3), 2665-2671 (2020).
  26. Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9 (1), 882(2018).
  27. Shao, X., et al. Integrated Proteome Analysis Device for Fast Single-Cell Protein Profiling. Analytical Chemistry. 90 (23), 14003-14010 (2018).
  28. Li, Z. Y., et al. Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis. Analytical Chemistry. 90 (8), 5430-5438 (2018).
  29. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19 (1), 161(2018).
  30. Zhang, P., et al. Carrier-Assisted Single-Tube Processing Approach for Targeted Proteomics Analysis of Low Numbers of Mammalian Cells. Analytical Chemistry. 91 (2), 1441-1451 (2019).
  31. Shi, T., et al. Facile carrier-assisted targeted mass spectrometric approach for proteomic analysis of low numbers of mammalian cells. Communications Biology. 1, 103(2018).
  32. Vitrinel, B., Iannitelli, D. E., Mazzoni, E. O., Christiaen, L., Vogel, C. Simple Method to Quantify Protein Abundances from 1000 Cells. ACS Omega. 5 (25), 15537-15546 (2020).
  33. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  34. Shi, T., et al. Conservation of protein abundance patterns reveals the regulatory architecture of the EGFR-MAPK pathway. Science Signaling. 9 (436), 6(2016).
  35. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  36. He, J., et al. Analytical platform evaluation for quantification of ERG in prostate cancer using protein and mRNA detection methods. Journal of Translational Medicine. 13, 54(2015).
  37. Shi, T., et al. Antibody-free, targeted mass-spectrometric approach for quantification of proteins at low picogram per milliliter levels in human plasma/serum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15395-15400 (2012).
  38. Shi, T., et al. Targeted quantification of low ng/mL level proteins in human serum without immunoaffinity depletion. Journal of Proteome Research. 12 (7), 3353-3361 (2013).

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