Segmentierung des Wachstums von Endothelzellen in 6-Well-Platten auf einem Orbitalschüttler für mechanobiologische Studien

Kuin  T. Pang; Mean Ghim; Mehwish Arshad; Xiaomeng Wang; Peter  D. Weinberg

doi:10.3791/61817

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Methodenartikel

Segmentierung des Wachstums von Endothelzellen in 6-Well-Platten auf einem Orbitalschüttler für mechanobiologische Studien

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DOI:

10.3791/61817

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3. Juni 2021

Kuin T. Pang^*¹^,² , Mean Ghim^*¹ , Mehwish Arshad¹ , Xiaomeng Wang²^,³^,⁴ , Peter D. Weinberg¹

¹Department of Bioengineering, Imperial College London, ²Institute of Molecular and Cell Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), ³Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University Singapore, ⁴Singapore Eye Research Institute, The Academia

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Beschichtungsmethode, um das Wachstum von Endothelzellen auf einen bestimmten Bereich einer 6-Well-Platte für die Scherspannungsanwendung unter Verwendung des Orbitalschüttlermodells zu beschränken.

Zusammenfassung

Scherspannung, die der Arterienwand durch den Blutfluss auferlegt wird, beeinflusst die Morphologie und Funktion der Endothelzellen. Niedrige Magnitude, oszillatorische und multidirektionale Scherspannungen wurden alle postuliert, um einen pro-atherosklerotischen Phänotyp in Endothelzellen zu stimulieren, während hohe Magnituden und unidirektionale oder einachsige Scherungen die endotheliale Homöostase fördern. Diese Hypothesen erfordern weitere Untersuchungen, aber traditionelle In-vitro-Techniken haben Einschränkungen und sind besonders schlecht darin, zellen multidirektionale Scherspannungen aufzuerlegen.

Eine Methode, die zunehmend eingesetzt wird, ist die Kultierung von Endothelzellen in Standard-Multi-Well-Platten auf der Plattform eines Orbitalschüttlers; Bei dieser einfachen, kostengünstigen, hochdurchsatzreichen und chronischen Methode erzeugt das wirbelnde Medium in verschiedenen Teilen des Bohrbrunnens unterschiedliche Muster und Größen der Scherung, einschließlich multidirektionaler Scherung. Es hat jedoch eine signifikante Einschränkung: Zellen in einer Region, die einer Art von Fluss ausgesetzt sind, können Mediatoren in das Medium freisetzen, die Zellen in anderen Teilen des Brunnens betreffen, die verschiedenen Strömungen ausgesetzt sind, wodurch die scheinbare Beziehung zwischen Fluss und Phänotyp verzerrt wird.

Hier stellen wir eine einfache und kostengünstige Modifikation der Methode vor, die es ermöglicht, Zellen nur bestimmten Scherspannungseigenschaften auszustellen. Die Zellaussaat wird auf einen definierten Bereich der Vertiefung beschränkt, indem der interessierende Bereich mit Fibronektin beschichtet wird, gefolgt von der Passivierung mit passivierender Lösung. Anschließend können die Platten auf dem Shaker verwirbelt werden, was dazu führt, dass die Zellen je nach Standort gut definierten Scherprofilen wie multidirektionaler Scherung niedriger Größe oder einachsiger Scherung hoher Größe ausgesetzt werden. Die Verwendung von Standard-Zellkultur-Kunststoffwaren ermöglicht nach wie vor eine einfache weitere Analyse der Zellen. Die Modifikation hat bereits den Nachweis löslicher Mediatoren ermöglicht, die unter definierten Scherspannungseigenschaften aus dem Endothel freigesetzt werden und Zellen an anderer Stelle im Bohrplatz beeinflussen.

Einleitung

Reaktionen von Gefäßzellen auf ihre mechanische Umgebung sind wichtig für die normale Funktion der Blutgefäße und für die Entwicklung von Krankheiten¹. Die Mechanobiologie der Endothelzellen (ECs), die die innere Oberfläche aller Blutgefäße auskleiden, war ein besonderer Schwerpunkt der mechanoobiologischen Forschung, da ECs direkt den Scherstress erfahren, der durch den Blutfluss über sie erzeugt wird. Verschiedene phänotypische Veränderungen wie Entzündungsreaktionen, veränderte Steifigkeit und Morphologie, die Freisetzung vasoaktiver Substanzen und die Lokalisation und Expression von Junctionalproteinen hängen von der EC-Exposition gegenüber....