Methodenartikel

Eine einfache Trockenschnittmethode zum Erhalt von Vollkornharzund und ihren Anwendungen

DOI:

10.3791/61822

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23. Januar 2021

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1Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology of Jiangsu Province/Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding, Yangzhou University, 2Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops of Jiangsu Province/Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety of the Ministry of Education, Yangzhou University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Technik ermöglicht die schnelle und einfache Herstellung von Vollkornharzabschnitten für die Beobachtung und Analyse von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Bereichen des Saatguts.

Zusammenfassung

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Die Morphologie, Größe und Quantität der Zellen, Stärkegranulate und Proteinkörper im Saatgut bestimmen das Gewicht und die Qualität des Saatguts. Sie unterscheiden sich zwischen den verschiedenen Saatgutregionen erheblich. Um die Morphologien von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern klar zu betrachten und ihre Morphologieparameter quantitativ genau zu analysieren, wird der Abschnitt in vollwertiger Größe benötigt. Obwohl die Paraffin-Sektion in vollsamen Größe die Ansammlung von Lagermaterialien in Samen untersuchen kann, ist es aufgrund der geringen Auflösung des dicken Abschnitts sehr schwierig, die morphologischen Parameter von Zellen und Speichermaterialien quantitativ zu analysieren. Der dünne Harzabschnitt hat eine hohe Auflösung, aber die routinemäßige Harzschnittmethode ist nicht geeignet, den vollwertigen Abschnitt aus reifen Samen mit einem großen Volumen und hohem Stärkegehalt vorzubereiten. In dieser Studie stellen wir eine einfache Trockenschnittmethode zur Vorbereitung des gesamten Harzabschnitts vor. Die Technik kann die kreuz- und längsförmigen Ganzkernabschnitte von sich entwickelnden, reifen, gekeimten und gekochten Samen, die in LR White Harz eingebettet sind, auch für große Samen mit hohem Stärkegehalt vorbereiten. Der ganzaggroße Abschnitt kann mit fluoreszierendem Aufheller 28, Jod und Coomassie brillantblaur R250 gefärbt werden, um speziell die Morphologie von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern deutlich zu zeigen. Das erhaltene Bild kann auch quantitativ analysiert werden, um die morphologischen Parameter von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen zu zeigen.

Einleitung

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Pflanzensamen enthalten Lagermaterialien wie Stärke und Protein und liefern Energie und Nahrung für die Menschen. Form, Größe und Menge der Zell- und Lagermaterialien bestimmen das Gewicht und die Qualität des Saatguts. Die Zellen und Speichermaterialien in verschiedenen Samenregionen haben signifikant unterschiedliche Morphologien, insbesondere für einige hochamylose Getreidepflanzen mit Hemmung des Stärkeverzweigungsenzyms IIb1,2,3. Daher ist es sehr wichtig, die Morphologien von Zellen und Lagermaterialien in verschiedenen Samenregionen zu untersuchen.

Paraffinschnitt ist eine gute Methode, um den ganzwertigen Abschnitt vorzubereiten und kann die Gewebestruktur des Saatguts und die Ansammlung von Lagermaterial in verschiedenen Regionen des Saatguts4,5,6aufweisen. Die Paraffinabschnitte haben jedoch in der Regel eine Dicke von 6-8 m mit geringer Auflösung; Daher ist es sehr schwierig, die Morphologie von Zell- und Speichermaterialien klar zu beobachten und quantitativ zu analysieren. Die Harzprofile haben in der Regel eine Dicke von 1-2 m und eine hohe Auflösung und eignen sich sehr gut, um die Morphologie von Zell- und Lagermaterialien zu beobachten und zu analysieren7. Die routinemäßige Harzschnittmethode hat jedoch Schwierigkeiten bei der Vorbereitung des Abschnitts in voller Saatgröße, insbesondere für Samen mit einem großen Volumen und hohem Stärkegehalt; somit gibt es keine Möglichkeit, die Morphologie von Zellen und Lagermaterialien in verschiedenen Bereichen des Saatguts zu beobachten und zu analysieren. LR White Harz ist ein Acrylharz und weist eine geringe Viskosität und starke Durchlässigkeit auf, was zu seinen guten Anwendungen bei der Herstellung des Harzabschnitts von Samen führt, insbesondere für Getreidereife Kerne mit großem Volumen und hohem Stärkegehalt. Darüber hinaus kann die in LR White Resin eingebettete Probe leicht mit vielen chemischen Farbstoffen gefärbt werden, um die Morphologie von Zellen und Speichermaterialien unter Licht- oder Fluoreszenzmikroskop deutlich zu zeigen7. In unserem vorherigen Papier haben wir über eine Trockenschnittmethode zur Herstellung der in LR White Harz eingebetteten Abschnitte von reifen Getreidekernen berichtet. Die Methode kann auch den vollwertigen Abschnitt des entwickelnden, gekeimten und gekochten Getreidekerns8vorbereiten. Der erhaltene Abschnitt im Ganzensaathat hat viele Anwendungen in der Mikromorphologiebeobachtung und -analyse, insbesondere zur übersichtlichen Betrachtung und quantitativen Analyse der morphologischen Unterschiede von Zell- und Speichermaterialien in verschiedenen Samenregionen8,9.

Diese Technik eignet sich für Forscher, die die Mikrostruktur des Gewebes und die Form und Größe von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen mit Hilfe des Lichtmikroskops beobachten möchten. Die Bilder von Abschnitten in Vollkorngröße, die speziell für die Ausstellung von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern gebeizt wurden, können mit einer Morphologie-Analysesoftware analysiert werden, um die morphologischen Parameter von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen quantitativ zu messen. Um die technische Anwendbarkeit und die Anwendung von Ganzsaat-Abschnitten zu demonstrieren, haben wir in dieser Studie die reifen Samen von Mais und Ölraps sowie die sich entwickelnden, gekeimten und gekochten Reiskerne untersucht. Das Protokoll enthält vier Prozesse. Hier verwenden wir reifen Maiskern, der aufgrund des großen Volumens und des hohen Stärkegehalts am schwierigsten bei der Vorbereitung der ganzaatigen Abschnitte ist, als Beispiel, um die Prozesse Schritt für Schritt auszustellen.

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Protokoll

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1. Herstellung von harzeingebettetem Saatgut (Abbildung 1)

  1. Fix sechs Mais reife Kerne in 10 ml von 2,5% Phosphat-gepuffertem Glutaraldehyd (0,1 M, pH7,2) bei 4 °C für 48 h. Die Forscher können andere fixative Mischungen, fixative Konzentrationen und Fixierungsbedingungen nach ihren Forschungszielen und Gewebetypen wählen.
  2. Nehmen Sie die Kerne heraus und schneiden Sie sie längs oder quer auf 2-3 mm Dicke mit einer scharfen doppelseitigen Klinge, und fixieren Sie sie in 10 ml von 2,5% phosphatgepuffertem Glutaraldehyd (0,1 M, pH 7,2) wieder für 48 h.
  3. Waschen Sie die Proben dreimal mit 10 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2) jeweils 30 min lang.
  4. Dehydrieren Sie die Proben in zunehmenden Qualitäten von ethanolwäriger Lösung (10 ml) von 30% bis 50%, 70%, 90% einmal und 100% dreimal für 30 min jedes Mal.
  5. Infiltrieren Sie die Proben in 10 ml erhöhenden Qualitäten der LR White Harzlösung, die mit Ethanol von 25% auf 50%, 75% einmal verdünnt wird, und 100% zweimal bei 4 °C für 12 h jedes Mal.
  6. Bereiten Sie die Sockel für Proben vor dem Einbetten vor. 0,25 ml 100% LR Weißharz in ein 2-ml-Zentrifugenrohr geben und bei 60 °C für 48 h polymerisieren.
  7. Nacheinander das reine LR White Harz (0,5 ml) und die infiltrierte Probe in das Zentrifugenrohr mit einem Sockel geben. Richten Sie die Proben mit der anatomischen Nadel aus und polymerisieren Sie sie bei 60 °C im Ofen für 48 h.

2. Trockenschnitt zur Vorbereitung eines Abschnitts in voller Saatgröße (Abbildung 1)

  1. Nehmen Sie die eingebetteten Kerne aus dem Zentrifugenrohr heraus und schneiden Sie das überschüssige Harz um die Probe mit einer scharfen Klinge aus.
  2. Klemmen Sie den Harzblock im Probenhalter von Ultramikrotom (EM UC7), und schneiden Sie das überflüssige Harz auf der Oberfläche der Probe und um die Probe herum mit einer Klinge ab.
  3. Die Oberfläche der Probe fein mit einem Glasmesser polieren, bis ein vollständiger Abschnitt gebildet werden kann.
  4. Legen Sie vor dem Schneiden einen kleinen Kupferhaken etwa 2 mm über der Klingenkante und schneiden Sie die Probe in einen 2 m Abschnitt. Die Rolle des Hakens ist es, das Curling nach oben des Abschnitts zu vermeiden.
  5. Setzen Sie den Haken unter den Abschnitt, um ihn zu unterstützen, wenn der Abschnitt lang wird.
  6. Fügen Sie 100 l Wasser auf einer unvorbehandelten Rutsche hinzu und übertragen Sie den kompletten und ungebrochenen Abschnitt vorsichtig mit der Pinzette ins Wasser.
  7. Um den faltigen Abschnitt zu glätten, die Probe auf dem Abflachungstisch bei 50 °C über Nacht erhitzen und trocknen.
    1. Wenn der Abschnitt bröckelt oder reißt, verlängern Sie die Zeit für jede Harzinfiltration der Probe von 12 h auf 24 h oder 48 h.
    2. Wenn der Abschnitt einige Linien parallel zum Messer hat, klemmen Sie den Probenblock fest. Wenn der Abschnitt einige Linien vertikal zum Messer hat, verwenden Sie bitte ein neues Messer.

3. Färbung und Beobachtung des Abschnitts

HINWEIS: Um die Gewebestruktur und Morphologie von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern zu beobachten, färben Sie die Abschnitte entsprechend dem Forschungszweck mit spezifischen Flecken. Hier verwenden wir den fluoreszierenden Aufheller 28, Jodlösung und Coomassie brillant blau R250, um die Zellwände, Stärkegranulate bzw. Proteinkörper zu färben.

  1. Zur Beobachtung der Morphologie der Zellen den Abschnitt mit 40 ml 0,1% (w/v) fluoreszierender Aufheller 28 wässrige Lösung in einem 70 ml kompakten Glas-Färbeglas glas bei 45 °C für 10 min färben, und dann mit fließendem Wasser für 5 min abspülen. Beobachten und fotografieren Sie den Abschnitt unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist.
  2. Zur Beobachtung der Morphologie von Stärkegranulat den Abschnitt mit 40 l Jodlösung (0,07% (w/v) I2 und 0,14% (w/v) KI in 25% (v/v) Glycerin) 1 min färben und die Mitprobe, die Jodlösung enthält, mit einem Deckzettel bedecken. Sehen und fotografieren Sie die Probe unter einem Lichtmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist.
  3. Zur Beobachtung der Morphologie von Proteinkörpern Tauchen Sie den Abschnitt mit 40 ml 10% (v/v) Essigsäure in ein 70 ml kompaktes Glas-Färbeglasglas für 10 min bei 45 °C ein und färben Sie ihn dann in 40 ml von 1% (w/v) Coomassie brilliant blue R250 in 25% (v/v) Isopropanol und 10% (v/v) Essigsäure für 15 min bei 45 °C. Die gebeizten Abschnitte mit fließendem Wasser 5 min waschen und trocknen. Beobachten und fotografieren Sie den Abschnitt unter einem Lichtmikroskop, das mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist.

4. Quantitative Analyse von Morphologieparametern

  1. Prozess und quantitativ analysieren die fotografierten Bilder für Fläche, Lang-/Kurzachse und Rundheit von Zellen, Stärkegranulaten und Proteinkörpern in verschiedenen Samenregionen mit Morphologie-Analysesoftware (Image-Pro Plus 6.0 Software) nach den Verfahren von Zhao et al.9 genau.

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Ergebnisse

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Einfache Trockenschnittmethode zur Gewinnung eines Ganzaatschnitts
Wir etablieren ein einfaches Trockenschnittverfahren zur Herstellung eines in LR-Weißharz eingebetteten Samenabschnitts in voller Saatgröße (Abbildung 1). Das Verfahren kann transversale und längsförmige Vollsaatschnitte mit einer Dicke von 2 m vorbereiten(Abbildung 2-5, Ergänzende Abbildung 1-4). Zum Beispiel kann der ausgereifte...

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Diskussion

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Die Samen sind die wichtigste erneuerbare Ressource für Lebensmittel, Futter und industrielle Rohstoffe und sind reich an Lagermaterialien wie Stärke und Protein. Die Morphologie und Quantität der Zellen sowie der Inhalt und die Konfiguration der Lagermaterialien beeinflussen das Gewicht und die Qualität der Samen7,12. Obwohl die Stereologie- und Bildanalysetechnologie die Größe und Quantität der Zellen in einer Geweberegion messen kann, fehlen sie in vielen Labo...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Die Finanzierung wurde von der National Natural Science Foundation of China (32071927), dem TalentProjekt der Yangzhou University und dem Priority Academic Program Development der Jiangsu Higher Education Institutions bereitgestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EssigsäureSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Kompaktes Glasfärbeglas (5 Plätze)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Coomassie brillantblau R-250Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
DeckglasSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Doppelseitige KlingeGillette Shanghai Co., Ltd.74-S
Ethanol absolutSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
PlantischLeicaHI1220
FluoreszenzmikroskopOlympusBX60
Fluoreszenzaufheller 28Sigma-Aldrich910090
GlasstreifenLeica840031
Glutaraldehyd 50%ige Lösung in WasserSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
GlycerolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
IodSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
IsopropanolSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
LichtmikroskopOlympusBX53
LR Weißes HarzAgar ScientificAGR1281A
OvenShanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co., Ltd.9023A
KaliumiodidSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
SlideSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
PinzetteSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Natriumphosphat zweibasisches DodecahydratSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Monobasisches Natriumphosphat-DihydratSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
UltramikrotomLeicaEM UC7
A501931E678013A100472F518211A500737A600875A600232A500538A507048A100512F518101F519022A607793A502805

Referenzen

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  2. He, W., et al. The defective effect of starch branching enzyme IIb from weak to strong induces the formation of biphasic starch granules in amylose-extender maize endosperm. Plant Molecular Biology. 103 (3), 355-371 (2020).
  3. Wang, J., et al. Gradually decreasing starch branching enzyme expression is responsible for the formation of heterogeneous starch granules. Plant Physiol. 176 (1), 582-595 (2018).
  4. Chen, X., et al. Dek35 encodes a PPR protein that affects cis-splicing of mitochondrial nad4 intron 1 and seed development in maize. Molecular Plant. 10 (3), 427-441 (2017).
  5. Hu, Z. Y., et al. Seed structure characteristics to form ultrahigh oil content in rapeseed. PLoS One. 8 (4), 62099(2013).
  6. Huang, Y., et al. Maize VKS1 regulates mitosis and cytokinesis during early endosperm development. Plant Cell. 31 (6), 1238-1256 (2019).
  7. Xu, A., Wei, C. Comprehensive comparison and applications of different sections in investigating the microstructure and histochemistry of cereal kernels. Plant Methods. 16, 8(2020).
  8. Zhao, L., Pan, T., Cai, C., Wang, J., Wei, C. Application of whole sections of mature cereal seeds to visualize the morphology of endosperm cell and starch and the distribution of storage protein. Journal of Cereal Science. 71, 19-27 (2016).
  9. Zhao, L., Cai, C., Wei, C. An image processing method for investigating the morphology of cereal endosperm cells. Biotech & Histochemistry. 95 (4), 249-261 (2020).
  10. Borisjuk, L., et al. Seed architecture shapes embryo metabolism in oilseed rape. The Plant Cell. 25 (5), 1625-1640 (2013).
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GanzsamenschnittLR White Harz EinbettungAnalyse von St rkek rnernF rbung von Proteink rpernFluorescent Brightener 28Jodl sung F rbungCoomassie Brilliant BlueAnalyse von MorphologieparameternSamengewebestruktur

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